一种包裹酶的蚕丝纳米小球的制备方法及其应用与流程

本发明涉及酶包裹技术领域，具体涉及一种包裹酶的蚕丝纳米小球的制备方法及其应用。

背景技术：

酶是生物体内必不可少的天然催化剂，几乎所有的生物反应都与它息息相关，如蛋白质合成和新陈代谢等。但是天然的生物酶很脆弱，暴露在常温下极易丧失活性，且对反应环境要求很高，保护酶的活性如热稳定性和储存稳定性变得十分重要。

此外大多数的生物反应都是通过多种酶的串联反应完成的，在这些串联反应过程中会产生中间产物，而有些中间产物大多是对人体有害的。因此，研究者们通过将多种酶连接或包裹在一起的方法，来模拟体内的生物串联反应，这样不但可以有效提高酶的反应活性，还可以高效地祛除有毒有害的中间产物，如过氧化物酶催化反应产生的过氧化氢。然而，现有的包裹酶的材料多为高分子材料或者新型的无机材料，生物兼容性差，不利于在动物体内使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种包裹酶的蚕丝纳米小球的制备方法及其应用，制得一种能够同时有效保护多种酶的活性，实现多种酶之间的串联反应，同时又具备良好的生物兼容性的蚕丝纳米小球，并应用于医学领域。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种包裹酶的蚕丝纳米小球的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备蚕丝溶液，具体为：

S11、将蚕茧剪碎，置于5％的NaHCO₃溶液中煮沸，并用玻璃棒搅拌30min，重复该步骤两次；

S12、用60℃去离子水洗涤步骤S11中所得蚕丝20min，重复该步骤三次；

S13、将洗涤过的蚕丝置于60℃烘箱中烘干，随后溶于9.3M的LiBr溶液中，60℃溶解4h；

S14、用去离子水透析步骤S13中所得蚕丝溶液两天，每2小时换一次水；

S15、将步骤S14中所得蚕丝溶液稀释至6％w/w；

S2、将酶包裹进蚕丝，形成包裹酶的蚕丝纳米小球，具体为：

S21、取步骤S1制得的蚕丝溶液，与酶溶液混合后置于冰箱中低温保存4-8小时，其中蚕丝溶液与酶溶液的体积比为5：1；

S22、取步骤S21中所得混合溶液，以每滴25ul的量缓慢滴入一定量的丙酮中，其中混合溶液与丙酮的体积比为1.2：5，将所得溶液18000rpm离心30min；

S23、弃上清液，加入去离子水，超声洗涤并分散；

S24、将步骤S23中所得混合溶液18000rpm离心15min；

S25、重复步骤S23、S24三次，即制得包裹酶的蚕丝纳米小球。

所制得的蚕丝纳米小球由蚕丝纳米外壳及其包裹的酶核心组成，所述蚕丝纳米小球的粒径为50-150nm。

优选地，步骤S21所述的酶溶液中包含的酶种类为一种或多种。

优选地，所述酶溶液中含有葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的质量比为4:1。

优选地，步骤S21所述的低温为4-10℃。

优选地，步骤S23所述超声洗涤具体为：40％功率超声30s后在振荡器上震荡2min,重复3-5次，直到分散均匀。

优选地，所述蚕丝纳米小球可在医学领域应用。

优选地，所述蚕丝纳米小球可用于制备解酒药，所制得的解酒药里同时包裹酒精氢化酶和过氧化氢酶。

采用上述技术方案后，本发明与背景技术相比，具有如下优点：

1、有效保护包裹酶的活性。首先，本发明在制备蚕丝纳米小球时，将蚕丝溶液和酶溶液混合后置于4-8℃低温冰箱保存，能够确保酶活性的稳定，避免了酶在制备过程中就失去活性，从而保证了包裹酶的蚕丝纳米小球的有效产出率；其次，本发明所述的蚕丝纳米小球为高结晶度的结构，其用于包裹酶的蚕丝外壳中含有丝素蛋白，丝素蛋白具有可控降解性，在人体内不易被蛋白酶降解，可以长时间地保护酶的活性，为所包裹的酶提供了天然屏障，从而有效保护所包裹的酶的热稳定性和储存稳定性；再次，由于所制得的蚕丝纳米小球的粒径在50-150nm，该粒径大小可以有效提高蚕丝纳米小球在水溶液中的分散性，而高分散性保证了酶的高效催化反应；因此，本发明从制备到保存再到使用的过程都严格保护了包裹酶的活性。

2、实现多种酶的串联反应。在串联反应时，由于中间产物会在多种酶之间传输，而反应环境通常为高粘度溶液，如细胞液、血液等，这样的高粘度溶液更不利于中间产物的传输，阻碍了串联反应的进行。本发明所述的蚕丝纳米小球可同时包裹多种相关酶，通过包裹能够大大缩小相关酶之间的距离，减少溶液粘度对反应中间产物传输的影响，从而保证酶的活性更好的发挥，有效去除有毒有害的中间产物，此外，调节不同包裹酶之间的质量比可进一步增强相关酶的活性，实现了蚕丝纳米小球在串联反应中的优越性。

3、具有良好的生物兼容性。本发明所制得的蚕丝纳米小球中含有的丝素蛋白是一种经过FDA认证的生物材料，具有良好的生物兼容性，不会在人体内引起任何排异反应，也不会引起炎症，避免了难以分解和排斥等缺点，从而可以在医学领域应用而作用于动物体。

附图说明

图1本发明所述蚕丝纳米小球的电镜图

图2包裹酶的热稳定性和储存稳定性测定结果

图3包裹酶的串联反应结果

图4相对酶活性比较结果

图5包裹酶在高粘度溶液中的活性测定

图6包裹酶的蚕丝纳米小球的解酒效果测定

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 制备包裹酶的蚕丝纳米小球

一种包裹酶的蚕丝纳米小球的制备方法，包括以下步骤：

S1、制备蚕丝溶液，具体为：

S11、将蚕茧剪碎，置于5％的NaHCO₃溶液中煮沸，并用玻璃棒搅拌30min，重复该步骤两次；

S12、用60℃去离子水洗涤步骤S11中所得蚕丝20min，重复该步骤三次；

S13、将洗涤过的蚕丝置于60℃烘箱中烘干，随后溶于9.3M的LiBr溶液中，60℃溶解4h；

S14、用去离子水透析步骤S13中所得蚕丝溶液两天，每2小时换一次水；

S15、将步骤S14中所得蚕丝溶液稀释至6％w/w；

S2、将酶包裹进蚕丝，形成包裹酶的蚕丝纳米小球，具体为：

S21、取1ml步骤S1制得的蚕丝溶液，与200ul含有酒精酶和过氧化氢酶的酶溶液混合后置于4℃冰箱中低温保存6小时；

S22、取1ml步骤S21中所得混合溶液，以每滴25ul的量缓慢滴入5ml丙酮中，将所得混合溶液18000rpm离心30min；

S23、弃上清液，加入去离子水，40％功率超声30s后在振荡器上震荡2min,重复3-5次，直到分散均匀；

S24、将步骤S23中所得混合溶液18000rpm离心15min；

S25、重复步骤S23、S24三次，即制得包裹酶的蚕丝纳米小球。

所制得的蚕丝纳米小球的粒径为50-150nm。

制得的包裹酶的蚕丝纳米小球的电镜图如图1所示。图1a的标尺为500um，图1b的标尺为100um。

实施例2 蚕丝纳米小球包裹的酶的活性测定

(1)酶的热稳定性和储存稳定性

通过测定无蚕丝包裹的酶和有蚕丝包裹的酶在不同时间点的相对酶活性，比较包裹前后酶的热稳定性和储存稳定性。结果如图2所示。

图2a表示在60℃下，无蚕丝包裹的葡萄糖氧化酶和有蚕丝包裹的葡萄糖氧化酶的相对酶活性。从图中可以看出，在60℃下，无蚕丝包裹的葡萄糖氧化酶1小时就丧失了一半活性；而有蚕丝包裹的葡萄糖氧化酶在30小时后才丧失一半活性；由此可见，经蚕丝纳米小球包裹的酶的热稳定性得到了有效的保护。

图2b表示在25℃下，无蚕丝包裹的辣根过氧化物酶和有蚕丝包裹的辣根过氧化物酶在不同天数的储存稳定性。从图中可以看出，在25℃下，无蚕丝包裹的辣根过氧化物酶4天后损失一半活性，14天后活性完全丧失；而有蚕丝包裹的辣根过氧化物酶14天后还保留70％左右的活性；由此可见，经蚕丝纳米小球包裹的酶的储存稳定性得到了有效保护。

(2)包裹酶在串联反应中的优越性

将多种酶同时包裹进蚕丝纳米小球，会形成串联反应，以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖分解为例，结果如图3所示。

从图3a中可以看出，在葡萄糖分解反应中，只加入葡萄糖氧化酶(GOx)时，随着反应的进行，会产生大量的中间产物过氧化氢，使得溶液中过氧化氢的浓度逐渐升高；当同时加入葡萄糖氧化酶(GOx)和过氧化氢酶(Cat)时，随着葡萄糖分解反应的进行，仍然会产生中间产物过氧化氢，但由于过氧化氢酶能催化过氧化氢分解，从而减少有害物质过氧化氢的量，因此过氧化氢浓度的增长速度稍有下降。

从图3b中可以看出，在葡萄糖分解反应中，只加入经蚕丝纳米小球包裹的葡萄糖氧化酶时，仍然会产生大量的过氧化氢中间产物，溶液中过氧化氢的浓度逐渐升高；当加入同时包裹了葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的蚕丝纳米小球，随着反应进行，溶液中过氧化氢的浓度增长幅度很小，增长速度明显减缓，其祛除有害中间产物过氧化氢的效果显著优于无蚕丝纳米小球包裹的实验组(图3a所示的结果)。

这是因为，在多种酶的串联反应中，会涉及到反应中间物在多种酶之间的传输，而将多种酶包裹在一起，可以大大缩小他们之间的距离，减少溶液粘度对反应中间物传输时的影响，从而保存更高的活性。

进一步地，当葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶混合时的质量比不同，测量其相对酶活性，结果如图4所示。实验证明：当蚕丝纳米小球中包裹的葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的质量比不同，其相对酶活性也不同，当葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的质量比为4:1时，活性最高。可见，通过控制多种酶之间的质量比，可以优化最终得到的包裹酶的蚕丝纳米小球的活性。

由此可见，经过蚕丝纳米小球包裹的酶在串联反应过程中，更能有效去除有毒有害的中间产物，如过氧化氢，其效果明显优于没有蚕丝纳米小球包裹的酶，体现了包裹酶在串联反应中的优越性。

(3)包裹酶在高粘度溶液中的活性

将无蚕丝纳米小球包裹的酶和有蚕丝纳米小球包裹的酶置于不同浓度的聚乙二醇(PEG)溶液中，测试其在高粘度下的酶的相对酶活性，结果如图5所示。从图中可以看出，随着PEG浓度升高，溶液粘度逐渐变大，酶的相对活性也逐渐降低，但当PEG浓度高于15v/v％，即处在高粘度溶液中，有蚕丝纳米小球包裹的酶的相对活性下降的速度明显低于无蚕丝纳米小球包裹的酶，说明蚕丝纳米小球的包裹能够保护处在高粘度溶液中(如细胞液、血液等)的酶的活性，使酶在同等条件下保存更高的活性。

实施例3 在解酒药的应用

将酒精氧化酶(AOx)和过氧化氢酶(Cat)包裹在蚕丝纳米小球中，制得一种抗蛋白酶的解酒药，其效果如图6所示。

在肠液模拟液中，加入无蚕丝纳米小球包裹的酒精酶或者有蚕丝纳米小球包裹的酒精酶，比较两者的相对酶活性，如图6a所示，有蚕丝纳米小球包裹的酒精酶在2h后依然保存90％以上的活性，而无蚕丝纳米小球包裹的酒精酶在20min后酶的相对活性迅速下降到5％。这是因为含有蛋白酶的药物经过口服后到达肠液中，肠液中存在的蛋白酶会促进蛋白质的水解，而绝大多数的酶的本质就是蛋白质，从而导致酶在肠液中快速分解失活，而包裹在酒精酶外的蚕丝纳米小球可以有效的保护酒精酶不被分解，从而保护酶的活性。由此可见，蚕丝纳米小球可以有效防止蛋白酶水解其包裹的酶，保证酶活性的发挥。

在肠液模拟液中，同时加入无蚕丝纳米小球包裹的酒精酶和过氧化氢酶，或者加入包裹了酒精酶和过氧化氢酶的蚕丝纳米小球，比较其随时间推移的酒精浓度的变化。如图6b所示，无蚕丝包裹的酒精酶和过氧化氢酶不能讲解酒精，在经过6h后，酒精的浓度仍然没有明显变化；而加入有蚕丝纳米小球包裹的酒精酶和过氧化氢酶可以有效降解酒精，使得酒精浓度迅速下降，在6h后酒精浓度降低到3％,解酒效果显著。

由此可见，包裹了酒精酶和过氧化氢酶的蚕丝纳米小球可以有效保护其包裹的酶不被蛋白酶分解，且可高效降低人体中的酒精浓度，达到显著的解酒效果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。