虫草素在制备预防和/或治疗放射损伤以及制备肿瘤放疗增敏的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及虫草素在制备预防和/或治疗放射损伤以及制备肿瘤放疗增敏的药物中的应用。

背景技术：

放射损伤指由电离放射所致的急性、迟发性或慢性的机体组织损害。大剂量放射可在数天内产生可见的身体效应，放射所导致的DNA损伤可使被照射者多种组织器官产生严重损害，甚至还可使后代发生遗传学缺陷。放射损伤的临床演变过程和严重程度取决于放射源的类型、辐照剂量和剂量率、暴露部位和范围等。

辐照损伤分为全身辐照损伤和局部辐照损伤。辐照损伤不仅表现在对皮肤的伤害，对其他器官和组织同样会造成损害。全身辐照损伤主要表现在造血系统的损伤；局部辐照损伤主要表现在皮肤和肠道的伤害。在意外辐照事故中，由于高强度的放射源照射，局部辐照损伤占绝大部分。局部辐照损伤病情演变得比较慢，通常数天甚至数周以后才能表现其临床症状，这些损伤虽然不足以致命，但是其延迟效应可导致更严重的损伤。

大剂量放射损伤损伤尚缺乏理想的救治手段，目前针对全身放射损伤，已有一些抗放药物的研究，但是对于局部组织器官损害，特别是针对大量受照人员的治疗至今仍没有标准的治疗方案。根据其症状，主要采取保守治疗和手术治疗。其中，保守治疗的方法主要是减轻疼痛、减少炎症、预防进一步循环系统的感染、改善循环、加速愈合、伤口清洁和减少纤维化，但保守治疗时效较慢。如果保守治疗无效，则需要应用外科治疗和重建塑形外科学。虽然外科治疗具有一定的治疗效果，但技术要求高，操作复杂，而且由于辐照的延迟效应会导致更严重的继发性损伤，局部病变可发展为持续性进展性损害，初期采用外科治疗很难确定其损伤的边界。

虫草素(cordycepin)即3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine),是一种核苷类似物(nucleoside analogue)。虫草素化学名为3’-脱氧腺苷，其化学式为C₁₀H₁₃N₅O₃，是一种碱性针状或片状晶体，熔点228℃～231℃。虫草素亲水性较强，在非极性溶剂中溶解度较低。虫草素是虫草中特有的活性成分，具有抗肿瘤、抗白血病、抗菌、抗病毒、免疫调节、降血糖、降血脂和抗支气管哮喘等多种药理作用。近年来，其潜在开发应用价值已引起世界的高度重视。然而，虫草素对防治放射损伤的作用并不清楚，虫草素对放射损伤的影响未见相关文献报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供虫草素在制备预防和/或治疗放射损伤的药物中的应用。该应用提供了虫草素的新用途，也为放射损伤的预防和治疗提供了新的药物。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

虫草素在制备预防和/或治疗放射损伤的药物中的应用。

所述放射损伤是指辐照引起的DNA和组织细胞损伤。

所述放射损伤是指辐照引起的DNA损伤或细胞抗氧化能力和集落形成能力降低。

所述放射损伤是指过氧化氢损伤细胞活力。

所述放射损伤是指辐照引起的造血系统损伤和造血系统的损伤。

所述放射损伤是指放创复合伤创面的形成以及瘢痕的形成。

所述放射损伤是指放射引起的皮肤溃疡和水肿。

所述放射损伤是指真皮细胞和表皮细胞的损伤。

所述放射损伤是指局部腹部照射肠道损伤。

虫草素在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。

本发明所述的虫草素，具有以下结构：

本发明的有益效果在于：将虫草素用于预防和治疗放射损伤，药效学实验证明，虫草素能够增强皮肤成纤维细胞抗氧化能力和集落形成能力，并减轻辐照引起的DNA损伤，以及减轻过氧化氢损伤细胞活力；以及能够减轻辐照引起的造血系统损伤和促进造血系统恢复，并促进放创复合伤创面愈合，减轻瘢痕形成；能减轻大剂量照射引起的皮肤溃疡和水肿，并增加真皮细胞和表皮细胞再生修复；能促进局部腹部照射肠道修复，减轻肠道损害；增强正常细胞保护功能同时对肿瘤放疗增敏。由于虫草素为纯天然物质，因此有用药较安全，毒副作用小的优点，而且使用方便，为防治放射损伤和肿瘤放疗增敏提供了新的药物。

附图说明

图1为本发明实施例1的虫草素能够明显增强皮肤成纤维细胞抗氧化能力和集落形成能力；其中，1a为虫草素预培养过的细胞，抗氧化蛋白(SOD1、SOD2、GPX-1)表达升高，1b为虫草素预培养过的细胞在不辐照或受辐照后的集落形成能力明显强于未预培养细胞；

图2为本发明实施例2的虫草素能够明显降低辐照引起的DNA损伤；其中，2a为与对照组细胞相比，虫草素培养能够明显减少辐照引起的细胞核内γ-H2AX的形成，2b为使用虫草素预培养过的细胞，γ-H2AX蛋白明显低于对照组；

图3为本发明实施例3的虫草素能够明显降低过氧化氢损伤细胞活力；其为与对照组细胞相比，虫草素培养过的细胞能够明显减少H₂O₂培养引起的细胞活力降低；图4为本发明实施例4的虫草素能够降低辐照引起的造血系统损伤和促进造血系统恢复；其为治疗组与对照组于第3天白细胞数量急剧降低，但治疗组降低程度无对照组明显，同时治疗组组白细胞数量恢复更快，治疗组到第20天白细胞水平基本恢复至正常；

图5为本发明实施例5的虫草素能促进放创复合伤创面愈合，减轻瘢痕形成；其中，5a为与对照组相比，给药组的创面愈合速度更快，5b、5c为与对照组相比，给药组愈合后形成的瘢痕也更薄，表明虫草素能提高创伤愈合的速度和质量；

图6为本发明实施例6的虫草素可显著降低放射引起的皮肤溃疡和水肿，并增加真皮细胞和表皮细胞再生修复；其中，6a为与对照组相比，给药组可显著降低放射引起的皮肤溃疡和水肿，6b为与对照组相比，给药组可显著增加真皮细胞和表皮细胞再生修复，6c为给药组真皮层纤维组织致密、间隙小，对照组表现为表现为纤维组织稀疏、散乱、无规则，6d为对照组肌纤维密度出现显著降低，表现为骨骼肌结构松散，细胞间隙明显增大；

图7为本发明实施例7的虫草素促进局部腹部照射肠道修复，减轻肠道损害，其中，7a为与对照组相比，给药组的小肠损伤程度轻，小肠绒毛完整，7b为预防组、治疗组K i67阳性率明显多于对照组；

图8为本发明实施例8的虫草素对人支气管上皮样细胞(HBE)活力影响小，同时能显著降低肿瘤A549和H460细胞活力，虫草素能够增加人支气管上皮样细胞(HBE)集落形成能力同时降低肿瘤A549细胞集落形成能力。8a为虫草素对人支气管上皮样细胞(HBE)活力影响小，同时能显著降低肿瘤A549和HBE细胞活力，8b为虫草素预培养过的人支气管上皮样细胞(HBE)在不辐照或受辐照后的集落形成能力明显强于未预培养细胞，8c为与未预培养细胞相比，虫草素预培养过的肿瘤A549细胞在不辐照或受辐照后的集落形成能力明显少于未预培养细胞。

具体实施方式

实施例中所采用的试剂与仪器：

细胞培养使用美国Thermo Fisher公司CO₂细胞培养箱(型号HERAcell 150i)。

细胞活力使用日本Dojindo公司CCK-8试剂，并用美国Thermo Fisher公司全波长酶标仪(Multiskan GO，型号1510)在450nm波长处检测。

免疫组化实验使用日本Olympus公司荧光显微镜(型号BX51)观察实验结果。

所有一抗均购买于Cell Signaling公司，二抗购买于碧云天公司。

其余试剂采用市售的生物级产品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明的实质性内容。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

抗氧化蛋白的检测

把虫草素溶解于低糖培养基，使虫草素在低糖培养基的浓度为200μM。用含200μM虫草素的低糖培养基培养人真皮成纤维细胞，培养时间分别为0、2、4、6、8、12、24、48、72、96h。细胞用含虫草素的低糖培养基培养后，收集细胞并加入蛋白裂解液裂解细胞，BCA法检测蛋白浓度，将变性后的蛋白电泳、转膜、封闭，一抗封闭过夜后加二抗显影。检测的抗氧化蛋白有SOD1、SOD2、GPX-1。结果显示，使用虫草素预培养过的细胞，抗氧化蛋白(SOD1、SOD2、GPX-1)水平升高(图1a)。

集落形成试验

把虫草素溶解于低糖培养基，使虫草素在低糖培养基的浓度分别为0、100、200、300μM。分别用含0、100、200、300μM虫草素的低糖培养基培养人真皮成纤维细胞、人支气管上皮样细胞(HBE)和肿瘤A549细胞72h后，换成无虫草素的低糖培养基。每种细胞一组接受5Gy照射剂量γ射线照射，另一组不辐照，细胞重新接种于6孔培养板(1×103/孔)培养(无虫草素的低糖培养基)14天，直到集落清晰可见。4％多聚甲醛固定后使用0.5％结晶紫染色，计数超过50个细胞的单个集落数。结果显示，使用虫草素预培养过的人真皮成纤维细胞(图1b)和人支气管上皮样细胞(图8b)在不辐照或受辐照后的集落形成能力明显强于未预培养细胞，与未预培养细胞相比，虫草素预培养过的肿瘤A549细胞在不辐照或受辐照后的集落形成能力明显少于未预培养细胞(图8c)。

实施例2

γ-H2AX形成试验

把虫草素溶解于低糖培养基，使虫草素在低糖培养基的浓度为200μM。用含200μM虫草素的低糖培养基培养人真皮成纤维细胞72h，72h后把细胞接种于盖玻片上，培养(无虫草素的低糖培养基)过夜后进行5Gyγ射线照射。分别于照射后不同时间(0.5、2、6、12、24h)用4％多聚甲醛固定细胞，1％triton溶液培养后山羊血清封闭30分钟，γ-H2AX抗体4℃孵育过夜，山羊抗鼠荧光二抗37℃避光孵育2小时，DAPI复染细胞核后用荧光显微镜采集图像观察γ-H2AX形成情况。结果显示，与对照组细胞相比，虫草素培养能够明显减少辐照引起的细胞核内γ-H2AX的形成(图2a)。

γ-H2AX蛋白检测

把虫草素溶解于低糖培养基，使虫草素在低糖培养基的浓度为200μM。用含200μM虫草素的低糖培养基培养人真皮成纤维细胞72h后，换成无虫草素的低糖培养基。换成无虫草素的低糖培养基后，接受5Gy照射剂量γ射线照射。于辐照后不同时间(0、1、2、4、8、12h)，加入适量蛋白裂解液裂解细胞。BCA法检测蛋白浓度，制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)，将变性后的蛋白电泳、转膜、封闭，一抗封闭过夜后加二抗显影。结果显示，使用虫草素预培养过的细胞，γ-H2AX蛋白明显低于对照组(图2b)。

实施例3

细胞活力试验

将人真皮成纤维细胞接种于96孔板(1×10⁴/孔)中培养(无虫草素的低糖培养基)过夜。然后向细胞中分别加入0、100、200、300μM浓度的虫草素于37℃，5％CO₂条件下培养72h。用900μM H₂O₂培养12小时后，采用CCK-8试验检测细胞相对活力。结果显示，与对照组细胞相比，虫草素培养过的细胞能够明显减少H₂O₂培养引起的细胞活力降低(图3)。

将人支气管上皮样细胞(HBE)、肿瘤A549和H460细胞接种于96孔板

(1×104/孔)中培养(无虫草素的低糖培养基)过夜。然后向细胞中分别加入0、50、100、200、300μM浓度的虫草素于37℃，5％CO2条件下培养72h。72h后，采用CCK-8试验检测细胞相对活力。结果显示，虫草素对人支气管上皮样细胞(HBE)活力影响小，同时能显著降低肿瘤A549和H460细胞活力(图8a)。

实施例4

血常规检测

对6-8周龄C57小鼠随机分为2组，对照组和治疗组，每组10只小鼠。治疗组辐照后连续7天给药，每天给药量为60mg/kg(腹腔给药)。γ射线照射后(4Gy)第3、7、10、14、20天尾静脉采血，并进行血常规检测。结果显示，治疗组与对照组于第3天白细胞数量急剧降低，但治疗组降低程度无对照组明显，同时治疗组组白细胞数量恢复更快，治疗组到第20天白细胞水平基本恢复至正常(图4)。

实施例5

放创复合伤动物试验

对6-8周龄C57小鼠随机分为3组，对照组、预防组、治疗组，每组12只小鼠。预防组辐照前一周给药，连续给药7天，治疗组辐照后连续7天给药，每天给药量为60mg/kg。γ射线照射后(4Gy)在大鼠背部造1cm²大小创面，形成照射复合伤动物模型。观察不同给药组动物创面愈合情况。结果显示，与对照组相比，给药组的创面愈合速度(图5a)更快，愈合后形成的瘢痕也更薄(图5b、5c)，表明虫草素能提高创伤愈合的速度和质量。

实施例6

局部软组织大剂量照射动物试验

对6-8周龄SD大鼠机分为2组，对照组和给药组，给药组于辐照前后一周连续给药，每天给药量为60mg/kg，。右后腿进行局部γ射线照射(40Gy)，这种高剂量的照射会加重皮肤红斑、脱屑和溃疡。辐照后第15天拍照取材。结果显示，给药组可显著降低放射引起的皮肤溃疡和水肿(图6a)，并增加真皮细胞和表皮细胞再生修复(图6b),给药组真皮层纤维组织致密、间隙小，对照组表现为表现为纤维组织稀疏、散乱、无规则(图6c)，对照组肌纤维密度出现显著降低,表现为骨骼肌结构松散,细胞间隙明显增大(图6d)。

实施例7

局部腹部照射动物试验

对6-8周龄C57小鼠随机分为3组，对照组、预防组、治疗组，每组6只小鼠。预防组辐照前一周给药，连续给药7天，治疗组辐照后连续3天给药，每天给药量为60mg/kg。小鼠进行局部腹部γ射线照射(12Gy)辐照后第4天取材。观察不同给药组(治疗和预防组)小肠损伤和修复情况。HE结果显示，与对照组相比，给药组的小肠损伤程度轻，小肠绒毛完整(图7a)。同时免疫组化检测细胞增殖指标(Ki 67)，预防组、治疗组K i67阳性率明显多于对照组(图7b)。