一种菠萝酵素的制备方法及其在美白剂中的应用与流程

本发明属于化妆品领域，具体涉及一种菠萝酵素及其制备方法与抑制酪氨酸酶的用途。

背景技术：

黑色素(melanin)主要由人体的黑色素细胞产生，它能减少紫外线对皮肤的伤害；然而黑色素的异常蓄积会造成色素沉着过度，容易引起雀斑、老年斑、黑斑病等。研究者发现酪氨酸酶在黑色素的生物合成过程中有重大作用。在黑色素生物合成过程中，酪氨酸酶起着十分重要的催化作用。酪氨酸酶能够促进l-酪氨酸转化为l-多巴，l-多巴又经过氧化而转化为多巴醌，多巴醌多聚生成黑色素。

菠萝果肉属于菠萝的食用部位，含有丰富的营养物质；但是菠萝果皮及菠萝叶是不可食用部分，是菠萝加工产生的副产物，若不加以处理及利用，会对环境造成污染和资源浪费。本发明的目的是研究菠萝果肉、果皮及叶对酪氨酸酶的抑制作用，若有一定作用，在今后的生产生活中就不会造成资源浪费，同时也会减少对环境的污染。

技术实现要素：

本发明提供一种菠萝酵素，其特征在于所述菠萝酵素由如下方法制备，所述方法包括如下步骤：

取一定质量的原料，经预处理后，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入原料质量的20％-35％质量的葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵，25-35天。所述原料为新鲜菠萝果皮、菠萝果肉或菠萝叶；所述预处理包括如下步骤：将原料用自来水冲洗2-3次，然后用蒸馏水冲洗1-2次，再用无菌水冲洗1-2次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎。

本发明提供的菠萝酵素依靠菠萝果皮或菠萝叶表面的野生酵母菌、或菠萝蛋白酶，在葡萄糖存在下，自然发酵得到的，具有原料廉价易得，变废为宝的特点，本发明不仅解决了菠萝加工产生的副产物——菠萝果皮资源浪费、对环境造成污染的问题，而且通过自然发酵技术还得到了具有抑制酪氨酸酶作用的菠萝酵素，可用于化妆品领域作为美白剂，天然无刺激。

本发明提供一种菠萝酵素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：取一定质量的原料，经预处理后，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入原料质量的20％-35％质量的葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵，25-35天。所述原料为新鲜菠萝果皮、菠萝果肉或菠萝叶；所述预处理包括如下步骤：将原料用自来水冲洗2-3次，然后用蒸馏水冲洗1-2次，再用无菌水冲洗1-2次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎。

本发明制备方法中“75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟”是为了杀灭细菌，酵母菌基本不受影响。

本发明提供一种菠萝酵素在制备美白剂中的用途，所述菠萝酵素选自菠萝果皮酵素、菠萝果肉酵素或菠萝叶酵素。

本发明提供一种菠萝酵素在抑制酪氨酸酶方面的应用，所述菠萝酵素选自菠萝果皮酵素、菠萝果肉酵素或菠萝叶酵素。

附图说明

图1黑色素的吸光值与温度(a-t)图

图2黑色素的吸光值与反应时间(a-t)图

图3黑色素的吸光值与l-酪氨酸物质的量浓度(a-c)图

图4黑色素的吸光值与l-酪氨酸用量(a-v)图

图5黑色素的吸光值与土豆质量/缓冲溶液体积图

图6菠萝果皮酵素浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图

图7菠萝果肉酵素浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图

图8菠萝叶酵素浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图

图9熊果苷酵素浓度与酪氨酸酶抑制率的关系图

具体实施方案

本发明中涉及的酪氨酸酶是可按文献的方法(李好样，吕海燕，董金龙.马铃薯中酪氨酸酶的提取及其活性的研究[j].光谱实验室，2008，25(6)：1040-1043)从土豆中提取的；或按下列方法提取：将土豆洗净削皮，切块后放置于冰箱冷冻层，冷冻过夜。需用时取出称重，与相应比例的缓冲溶液[土豆质量：缓冲溶液体积＝1：5(g/ml)]共置于搅拌机中搅拌；将所得溶液进行离心，离心速率为4000r/min，离心时长为5min，取上清液为实验所用(即土豆提取液)。

本发明所述的缓冲溶液为ph＝6.86的混合磷酸盐缓冲溶液。

本发明从菠萝的不同部位(果皮、果肉、叶)中提取出酵素，测定其对土豆中酪氨酸酶活性的抑制作用，通过计算抑制率来反映抑制作用。用熊果苷作为阳性对照，比较ic50的大小(任红荣，单承莺，姜洪芳，等.香水莲花提取物抑制酪氨酸酶活性的研究[j].天然产物研究与开发，2011，23(06)：1122-1126；叶孝兆，龚盛昭，廖国俊，等.当归提取物对酪氨酸酶的抑制作用[j].日用化学工业，2010，40(02)：98-100)。

抑制率计算公式：[1-(t2-t1)/(c2-c1)]×100％

c1表示只有底物(土豆提取液和缓冲溶液的混合溶液)的吸光度值，c2表示含有底物和l-酪氨酸的吸光度值，c2-c1表示在扣除底物的吸光度后生成的黑色素的吸光度值。t1表示含有底物和样品的吸光度值，t2表示含有底物、l-酪氨酸和样品的吸光度值，t2-t1表示经过样品的抑制，在扣除样品和底物的吸光度后剩余的黑色素的吸光度值。

实施例1酪氨酸酶促进l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件的确定

(1)温度对酪氨酸酶最佳活性的影响

取10ml干净干燥的棕色容量瓶8个，分为4组，每组2个，分别标记为c1和c2。按照表1加入各试液：

表1体系组成及各试剂加入量

按照上表给4组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液，将4组溶液分别置于0℃、10℃、30℃、40℃下，反应35min后，立即进行吸光度的测量(测量波长为475nm为最好)。如图1。

(2)体系反应时间对酪氨酸酶最佳活性的影响

取100ml干净干燥的棕色容量瓶两个，标记为c1和c2，按照表2加入各试液：

表2体系组成及各试剂加入量

按照上表给2个容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液，将容量瓶置于10℃水浴，每隔5min测量一个吸光度，反应总时长为90min(测量波长为475nm)。如图2。

(3)l-酪氨酸物质的量浓度对酪氨酸酶最佳活性的影响

用电子天平准确称取0.0181g的l-酪氨酸粉末，用缓冲溶液溶解定容于100ml的容量瓶中,可得1mmol/l的l-酪氨酸溶液。

取6个10ml干净干燥的容量瓶，分别加入上述溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，用缓冲溶液定容至刻度线，即得物质的量浓度分别为0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l的l-酪氨酸溶液。

另取10ml干净干燥的棕色容量瓶12个，分为6组，每组2个，分别标记为c1和c2。按照表3加入各试液：

表3体系组成及各试剂加入量

按照上表给4组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和不同物质的量浓度的l-酪氨酸溶液作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图3。

(4)l-酪氨酸用量对酪氨酸酶最佳活性的影响

取10个10ml干净干燥的容量瓶，分为5组，每组2个，分别标记为c1和c2。按照表4加入各试液：

表4体系组成及各试剂加入量

表中x为1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，对应y为8.0ml、7.5ml、7.0ml、6.5ml、6.0ml，向5组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和不同量的l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图4。

(5)土豆质量与缓冲溶液体积比对酪氨酸酶最佳活性的影响

取10个10ml干净干燥的容量瓶，分为5组，每组2个，分别标记为c1和c2。按照表4加入各试液：

表5体系组成及各试剂加入量

土豆提取液中土豆质量与缓冲溶液体积比(g/ml)分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。向5组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图5。

经确定酪氨酸酶促进l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件：温度10℃，反应时间35min，l-酪氨酸物质的量浓度为0.3mmol/l，l-酪氨酸的体积用量为2.5ml，制备土豆提取液时土豆质量与缓冲溶液的体积比为1：4。

实施例2

称取新鲜菠萝果皮2.0kg，用自来水冲洗2次，然后用蒸馏水冲洗1次，再用无菌水冲洗2次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入400g葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵25天后，将发酵液取出，置于离心管中，经离心后，取上清液，进行减压浓缩，得到固体样品10.83g，即为菠萝果皮酵素。

实施例3

称取新鲜菠萝果皮1.0kg，用自来水冲洗2次，然后用蒸馏水冲洗2次，再用无菌水冲洗1次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入350g葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵35天后，将发酵液取出，置于离心管中，经离心后，取上清液，进行减压浓缩，得到固体样品6.65g，即为菠萝果皮酵素。

实施例4

称取新鲜菠萝果肉1.0kg，用自来水冲洗2次，然后用蒸馏水冲洗2次，再用无菌水冲洗1次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入350g葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵35天后，将发酵液取出，置于离心管中，经离心后，取上清液，进行减压浓缩，得到固体样品7.23g，即为菠萝果肉酵素。

实施例5

称取新鲜菠萝叶2.0kg，用自来水冲洗2次，然后用蒸馏水冲洗1次，再用无菌水冲洗2次，再用75％的乙醇冲洗2次，紫外灯照射5分钟，最后将其切碎，置于经无菌处理的发酵罐中，然后加入400g葡萄糖后，将发酵罐密封，于15-25℃下，自然发酵25天后，将发酵液取出，置于离心管中，经离心后，取上清液，进行减压浓缩，得到固体样品9.76g，即为菠萝叶酵素。

经hplc分析，实施例2和实施例3制备得到的菠萝果皮酵素的hplc图出峰情况一致性在95％，其与实施例4的出峰一致性较差，相似性仅为47％，与实施例5的出峰一致性更差，相似性仅为36％。

实施例6

在实施例1确定的酪氨酸酶促进l-酪氨酸生成黑色素的最佳活性条件下，分别测试实施例2、实施例4、实施例5制备得到的菠萝果皮酵素、菠萝果肉酵素、菠萝叶酵素对酪氨酸酶活性的影响，以熊果苷作为阳性对照。

(1)菠萝果皮酵素对酪氨酸酶活性的抑制作用

取1个25ml干净干燥的容量瓶，精确称量0.25g的菠萝果皮酵素固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为10mg/ml的样品溶液。

另取9个10ml干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述溶液0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml的9瓶溶液，贴上标签标记。

再取36个10ml干净干燥的容量瓶，分为9组，每组4个，分别标记为c1、c2、t1、t2。按照表6加入各试液：

表6体系组成及各试剂加入量

按照上表给9组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4),不同组中t1和t2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图6，在酪氨酸酶活性最佳条件下，当浓度为0.5mg/ml～3.0mg/ml之间时，样品对酶活性的抑制率随浓度的增大而增大，并在浓度为3.0mg/ml时达到最大值，此时的抑制率为76.11％；当浓度为3.0mg/ml～4.5mg/ml之间时，抑制率随浓度的增大而减小。在抑制率上升部分，半数抑制浓度为0.98mg/ml，即ic50＝0.98mg/ml。

(2)菠萝果肉酵素对酪氨酸酶活性的抑制作用

取1个25ml干净干燥的容量瓶，精确称量0.25g的香水菠萝果肉固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为10mg/ml的样品溶液。

另取8个10ml干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、1.8ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、4.0ml，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml的8瓶溶液，贴上标签标记。

再取32个10ml干净干燥的容量瓶，分为8组，每组4个，分别标记为c1、c2、t1、t2。按照表7加入各试液：

表7体系组成及各试剂加入量

按照上表给7组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4)，不同组中t1和t2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图7，在酪氨酸酶活性最佳条件下，当浓度为0.5mg/ml～2.0mg/ml之间时，样品对酶活性的抑制率随浓度的增大而增大，并在浓度为2.0mg/ml时达到最大值，此时的抑制率为75.00％；当浓度为2.0mg/ml～4.0mg/ml之间时，抑制率随浓度的增大而减小。在抑制率上升部分，半数抑制浓度为1.66mg/ml，即ic50＝1.66mg/ml。

(3)菠萝叶酵素对酪氨酸酶活性的抑制作用

取1个25ml干净干燥的容量瓶，精确称量0.25g的香水菠萝叶固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为10mg/ml的样品溶液。

另取8个10ml干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml、4.5ml、5.0ml、5.5ml，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml的8瓶溶液，贴上标签标记。

再取32个10ml干净干燥的容量瓶，分为8组，每组4个，分别标记为c1、c2、t1、t2。按照表8加入各试液：

表8体系组成及各试剂加入量

按照上表给8组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4),不同组中t1和t2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图8，在酪氨酸酶活性最佳条件下，当浓度为1.0mg/ml～4.0mg/ml之间时，样品对酶活性的抑制率随浓度的增大而增大，并在浓度为4.0mg/ml时达到最大值，此时的抑制率为81.44％；当浓度为4.0mg/ml～5.5mg/ml之间时，抑制率随浓度的增大而减小。在抑制率上升部分，半数抑制浓度为1.97mg/ml，即ic50＝1.97mg/ml。

(4)熊果苷对酪氨酸酶活性的抑制作用

取1个25ml干净干燥的容量瓶，精确称量0.25g的熊果苷固体样品，用缓冲溶液溶解定容于容量瓶中，可得浓度为10mg/ml的样品溶液。

另取9个10ml干净干燥的容量瓶，每个容量瓶中分别加入上述溶液0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.5ml、1.8ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml，用缓冲溶液定容至刻度线，可得质量浓度分别为0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml的9瓶溶液，贴上标签标记。

再取36个10ml干净干燥的容量瓶，分为9组，每组4个，分别标记为c1、c2、t1、t2。按照表9加入各试液：

表9体系组成及各试剂加入量

按照上表给9组容量瓶加入对应量的缓冲溶液和l-酪氨酸溶液(浓度为0.3mmol/l)作为反应体系的底物，然后加入对应量的土豆提取液(土豆质量与缓冲溶液体积比为1:4)，不同组中t1和t2中加入不同浓度的等量的样品溶液。将容量瓶置于10℃水浴，反应35min后，立即测量吸光度(测量波长为475nm)。如图9，在酪氨酸酶活性最佳条件下，当浓度为0.5mg/ml～2.0mg/ml之间时，样品对酶活性的抑制率随浓度的增大而增大，并在浓度为2.0mg/ml时达到最大，此时的抑制率为61.68％；当浓度为2.0mg/ml～3.5mg/ml之间时，抑制率随浓度的增大而减小。在抑制率上升部分，半数抑制浓度为1.55mg/ml，即ic50＝1.55mg/ml。

由本实施例(1)-(4)的测试结果(图6-图9)，可以看出菠萝果皮酵素对酪氨酸酶的抑制活性最好(ic50＝0.98mg/ml)，优于菠萝果肉酵素和菠萝叶酵素及阳性对照熊果苷的活性。分析可能是菠萝果皮依靠其表面野生酵母菌在葡萄糖存在下，自然发酵产生了对酪氨酸酶具有较高抑制活性的次级代谢产物，由其hplc图谱也可以看出，菠萝果皮酵素与菠萝果肉酵素和菠萝叶酵素的出峰位置具有显著不同。

实施例7

按照文献(中草药，第46卷第7期第949-954页)的方法得到菠萝叶95％的乙醇提取物和按照专利cn104523463a的方法得到菠萝叶丙酮提取物，按照本发明实施例6中的方法，进行测试酪氨酸酶抑制活性，结果发现菠萝叶95％的乙醇提取物和菠萝叶丙酮提取物在浓度为5mg/ml时，其对酪氨酸酶抑制率不足15％。