从加拿大一枝黄花中提取抗氧化物的方法与流程

本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体来说是一种从加拿大一枝黄花中提取抗氧化物的方法。

背景技术：

目前在医疗和食品领域使用较多的是合成抗氧剂，但动物实验研究表明，合成抗氧剂，如bht、bha对生物体具有潜在的毒副作用。天然抗氧化剂因具有无毒副作用、无残留、无污染、稳定、安全等优点而越来越受到人们的关注，在医药学、保健与功能食品、美容养颜护肤等领域有非常重要的意义。

加拿大一枝黄花(solidagocanadensisl.)原产北美，1931年作为花卉植物引入我国，后溢生为恶性杂草，其繁殖力强，传播速度快，严重破坏生态环境并造成严重的经济损失。研究结果表明加拿大一枝黄花天然化学成分丰富，富含黄酮和多酚类等抗氧化活性物质，因此进一步对加拿大一枝黄花中的活性物质进行开发利用，既实现对外来入侵植物的综合利用和调控，又能制备大量天然抗氧化剂，具有重要的生态、经济和社会意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种从加拿大一枝黄花中提取抗氧化物的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种从加拿大一枝黄花中提取抗氧化物的方法，步骤包括：

(1)将加拿大一枝黄花洗净，阴干，烘至恒重，粉碎过20-100目筛；

(2)粉末中加入体积浓度为50-95％乙醇溶液，超声提取并过滤，滤液浓缩至无溶剂得到浓缩物；

(3)浓缩物分散于水中，用石油醚萃取4次，除去色素，保留水相；

(4)向水相中加入乙酸乙酯溶剂，萃取4次，保留上层有机相，合并萃取物：

(5)萃取物浓缩干燥即得抗氧化剂。

进一步的，步骤(1)中，所述加拿大一枝黄花为地上部分，烘干条件为40℃恒温鼓风干燥。

进一步的，步骤(2)中，所述乙醇的质量分数为70％，超声波提取的功率为1kw，提取时间30min。

进一步的，步骤(3)中，所述石油醚与浓缩物的水溶液的体积比为3:1。

进一步的，步骤(4)中，所述乙酸乙酯与水相的体积比为3:1。

进一步的，步骤(5)中，所述浓缩为42℃减压浓缩，干燥是40℃减压真空干燥。

本发明提取的抗氧化物主要以多酚和黄酮类化学成分为主。

本发明的有益技术效果是：本发明的优点在于材料来源广，成本低廉，提取工艺简单，抗氧化活性与天然抗氧化剂vc相比具明显优势。

附图说明

图1是加拿大一枝黄花总提取物及其各萃取物清除abts自由基的能力结果图；

图2是加拿大一枝黄花对铁离子的还原能力结果图；

图3是加拿大一枝黄花总提取物及其各萃取物氧自由基吸收能力结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种从加拿大一枝黄花中提取抗氧化物的方法，步骤包括：

(1)将加拿大一枝黄花地上部分洗净，阴干，40℃恒温鼓风烘至恒重，粉碎；

(2)粉末中加入质量分数为70％乙醇溶液，设置超声功率为1kw、提取并过滤30min，上清液弄死至无溶剂得到浓缩物；

(3)浓缩物分散于水中，用浓缩物水溶液3倍体积的石油醚萃取4次，除去色素，保留水相；

(4)向水相中加入3倍体积的乙酸乙酯溶剂，萃取4次，保留上层有机相，合并萃取物：

(5)萃取物42℃减压浓缩后40℃真空干燥即得抗氧化剂。

实施例2

从加拿大一枝黄花提取的抗氧化活性验证

主要试剂和仪器：

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)、2,4,6-三吡啶基三嗪(tptz)、2,2-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢(aaph)、维生素e水溶性类似物(trolox)和抗坏血酸(vc)，美国sigma-aldrich公司；分析纯，天津市大茂化学试剂厂；kq-500de型数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；n-1100型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；synergyh1型酶标仪：美国biotek公司。

样品制备：

加拿大一枝黄花乙醇提取物(总提取物)、乙酸乙酯萃取物、水饱和正丁醇萃取物和水层剩余物按如下方法制备：将加拿大一枝黄花地上部分用清水洗净，于通风处阴干3d，剪碎后40℃烘干直至恒重，粉碎。准确称取加拿大一枝黄花粉末480.0g，用体积分数为70％的乙醇室温下浸泡12h，超声波辅助提取30min，重复4次，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至浸膏后称重，得乙醇提取物(总提取物)。后取部分总提取物加水混悬，用有机溶剂石油醚萃取，去除色素，后依次用乙酸乙酯和水饱和正丁醇与分散液按体积比3:1混和进行萃取，重复萃取4次，合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏后称重，分别得到加拿大一枝黄花乙酸乙酯萃取物、水饱和正丁醇萃取物和水层剩余物。

1、加拿大一枝黄花清除abts自由基能力的测定

配置含7.0mmabts和2.45mm过硫酸钾的abts自由基溶液，室温避光12h后用甲醇稀释到在734nm的吸光值为0.7±0.2(现配现用)。

取适宜浓度的样品50.0μl(用乙醇配置)和abts自由基溶液200.0μl于96孔板中，室温反应6min后于734nm处测样品吸光值(as)，用甲醇代替abts自由基溶液为样品组在反应体系中自身的吸光值(ab)，用乙醇代替样品为样品空白组吸光值(ac)，所有测定平行3次，对照样品为vc。样品的抗氧化程度用对abts自由基的清除率表示，抗氧化能力用半数清除率ic50值表示，ic50值越低，抗氧化活性越强。清除率的计算公式采用式(1)，根据样品浓度与清除率的关系用origion8.6软件进行非线性拟合，得ic50值。按(1)式计算对abts自由基的清除率。

清除率＝[(ac-(as-ab))/ac]*100％式(1)

2、加拿大一枝黄花铁离子还原能力(frap)的测定

frap(ferricreducingabilityofplasma)法反映被测样品的总抗氧化能力，能够体现待测样品整体抗氧化水平，该法常被用以表明样品的抗氧化功能特性，其原理是抗氧化活性物质将fe³⁺还原为fe²⁺，fe²⁺与三吡啶三吖嗪(tptz)结合生成明显的有色络合物，并在波长593nm处有最大吸收。吸光值越大，表明待测样品有越强的还原能力。样品的还原能力以达到相同吸光值的feso4当量浓度表示，记为frap值。

frap工作液配制：①配制10mmol/l的tptz溶液(准确称取0.0312gtptz于小烧杯中，用40mmol/l的盐酸溶解，并定容至10ml容量瓶中，置于冰箱避光冷藏备用)；②配制20mmol/l的三氯化铁溶液(准确称取0.5406gfecl3·6h2o于小烧杯中，用蒸馏水溶解，并定容至100ml容量瓶中)；③配制ph3.6的乙酸缓冲液(将30mmol/l的乙酸溶液与30mmol/l的乙酸钠溶液按体积比9.25:0.75的比例混匀，调至ph3.6)。将以上三者按照体积比1：1：10的比例混合，在37℃恒温水浴锅中保温备用。

feso4标准曲线的绘制：配制100μg/ml的feso4溶液，采用倍稀法，准确移取feso4溶液25μl于含有25μl乙醇的酶标板中，各加入300μlfrap工作液，迅速摇匀后，置于37℃恒温水浴锅中反应10min，于波长593nm处测定吸光值，平行3次。绘制feso4标准曲线，试验所得feso4标准曲线方程为y＝0.0055x-0.0073，(r²＝0.995)。

样品铁离子还原能力的测定：配制样品溶液，准确移取25μl的样品溶液于酶标板中，加入300μlfrap工作液，迅速摇匀后，置于37℃恒温水浴锅中反应10min，于波长593nm处测定吸光值，平行3次。根据feso4标准曲线，计算相同吸光值下feso4的当量浓度，记为frap值。

3、加拿大一枝黄花氧自由基吸收能力(orac)的测定

orac是氧自由基吸收能力(oxygenradicalabsorbancecapacity)的缩写，也被称为抗氧化能力指数，orac分析法中的自由基主要来源于偶氮化合物2，2'-偶氮-双-(2-脒基丙烷)氯化二氢[2，2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，aaph]热分解产生的过氧化氢自由基，也可以是芬顿(fenton)反应过程中产生的羟自由基，以荧光素钠(sodiumflourescein，fl)为荧光探针，观察自由基与荧光探针作用后，探针荧光强度的衰退过程，以水溶性维生素e类似物(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，trolox)作为抗氧化标准物质，检测体系中各种抗氧化剂延缓探针荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。

磷酸盐缓冲液的制备：精密量取适量磷酸，以高纯水稀释得到75mmol/l磷酸溶液；

准确称取4.3235g磷酸，以高纯水定容至500ml。称取8.56g磷酸氢二钾以高纯水500ml溶解，以磷酸溶液调ph＝7.4，即得75mmol/lph7.4的磷酸盐缓冲液。

aaph溶液的制备：精密称取aaph207mg，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5ml量瓶，即得浓度为153mmol/l的aaph溶液。

fl溶液的制备：准确称取0.0301gfl(30mg)，定容至100ml，此时浓度为0.8mmol/l，记为母液a。

吸取1ml母液a，定容至100ml，此时浓度为8×10^-3mmol/l，记为母液b。

吸取1ml母液b，定容至100ml，此时浓度为8×10^-5mol/l，此为fl稀释液。

trolox溶液配制trolox母液10mmol/l，量取100ul，定容至10ml，此时浓度为100ug/ml。

精密吸取不同浓度样品溶液25.0μl(用乙醇配置)，再加入fl稀释液150.0μl于96孔板中，随后振荡5min，37℃温育10min后迅速加入aaph液25.0μl启动反应，以激发波长485nm，发射波长535nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值，测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止，所有测定平行3次。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制trolox系列标准溶液和不同浓度样品荧光衰变曲线，试验得trolox系列标准溶液的标准曲线方程为y＝5.8211x-0.7086，(r²＝0.997)。

实验所得的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据与其初始时间的荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光衰退曲线下面积(areaunderthecurve，auc)。其公式为：auc＝0.5×[2×(f0+f1+···+fn-1+fn)-f0-fn]×△t，其中fn表示第n个测定点的相对荧光强度，△t标示相邻两个时间点之间的时间间隔(即1.5min)，根据上述公式可简化为：auc＝0.75×(f0+f1+···+fn-1+fn)-f0-fn。测定结果以orac值表示，即以相当于trolox的微克数表示(μg/mg)，按以下公式(2)计算：

orac值＝[(aucsample-auc﹢aaph)/(auctrolox-auc﹢aaph)](molarityoftrolox/molarityofsample)式(2)

数据分析采用spss17.0和origin8.6软件进行数据处理和分析。所有实验平行3次，实验结果以平均值±标准偏差表示，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。

6、试验结果

加拿大一枝黄花总提取物及其各萃取物清除abts自由基的能力见图1。

从图1可知，加拿大一枝黄花总提取物及其各萃取物对abts自由基均具有清除作用，在一定范围内，随着浓度的增大，清除率升高。

加拿大一枝黄花总提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层剩余物和vc的ic50值分别为59.32、55.52、159.35、129.10和306.76μg/ml。ic50值越小，抗氧化能力越强，因此清除abts自由基的能力由强到弱依次为乙酸乙酯萃取物＞总提取物＞水层剩余物＞vc＞正丁醇萃取物。

乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最强，且强于阳性对照vc(p＜0.01)，是vc的5.53倍。

加拿大一枝黄花对铁离子的还原能力见图2，由图2可知还原能力的大小依次为乙酸乙酯萃取物＞vc＞总提取物＞正丁醇萃取物＞水层剩余物。

乙酸乙酯萃取物比vc的抗氧化能力强(p＜0.05)，且是vc的1.33倍。

由图3可知加拿大一枝黄花总提取物及其各萃取物氧自由基吸收能力的大小依次为乙酸乙酯萃取物＞vc＞正丁醇萃取物＞水层剩余物＞总提取物。

氧自由基吸收能力试结果表明乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最强，是vc的1.40倍，这与清除abts自由基和frap试验所得的试验结果一致。

外来入侵植物加拿大一枝黄花乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力强，与vc相比具有更强的抗氧化活性。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。