抑制PTP1B活性的远志有效部位及其制备和应用的制作方法

本发明涉及中药提取物有效部位，具体属于抑制ptp1b活性的远志有效部位及其制备方法和应用。

背景技术：

糖尿病(diabetesmellitus，dm)是以血糖升高为特征的内分泌代谢紊乱疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病作为dm的主要类型，发病机制主要涉及胰岛b细胞受损导致的功能障碍，以及由于胰岛素信号通路紊乱引起的外周组织对胰岛素敏感性的降低，目前临床上治疗糖尿病的药物主要有胰岛素促分泌剂、胰岛素增敏剂等，但这类药物常存在不同程度的副作用，无法达到预期的治疗效果。随着对于糖尿病发病机制的深入研究，依据发病关键靶点作用机制来寻找安全且高效的降糖药物已成为该领域新的研究焦点。糖尿病往往都伴随着胰岛素敏感组织中的胰岛素敏感性降低，也就是胰岛素抵抗。这是因为胰岛素信号在传导过程中减弱或出现调控紊乱，从而引起肌肉、肝脏及脂肪组织中的糖脂代谢失衡。研究人员发现在胰岛素信道通路中存在一个重要的调控机制就是对胰岛素受体(insulinreceptor，ir)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，irs)以及其他下游分子的蛋白质酪氨酸磷酸化进行可逆性调节。在胰岛素信号转导过程中，被激活的磷酸化ir转移到内质网上，被特定的酪氨酸酯酶，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶1b(proteintyrosinephosphatase1b，ptp1b)，去磷酸化则失活，胰岛素信号通路则被终止。由此可见，在整个信号传导过程中，通过对ptp1b活性的抑制，有助于提高胰岛素信号通路的敏感性以及ir、irs-1的磷酸化水平，从而达到治疗糖尿病的效果。自ptp1b对胰岛素通路的负调控机制阐明至今，已有大约300种小分子抑制剂被发现，但却没有相应的新药上市，这主要是因为该类药物生物有效性和专属性不高，于是，开发高效而安全的ptp1b抑制剂对于糖尿病的治疗及新药研发具有非常重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供具有抑制ptp1b活性的远志有效部位及其制备方法和应用。提取分离出的远志有效部位对ptp1b具有较高抑制活性，可在制备抗糖尿病药物中应用。

本发明提供的一种抑制ptp1b活性的远志有效部位的制备方法，步骤如下：将远志药材剪短至1-2cm，加入8-10倍的95％乙醇浸泡10-12h，加热回流2h，药渣重复浸泡2-3h、回流提取2-3次后合并提取液，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，即得到醇提物；将过滤后的药渣，加8-10倍水浸泡10-12h，加热回流2h，重复浸泡2-3h、回流提取2-3次后合并提取液，过滤，减压浓缩至流浸膏状，得到水提物；将醇提物与水提物等体积混合，加入1-1.5倍体积的沸点60℃-90℃的石油醚，萃取2-3次，收集合并萃取剩余液体，加入1-1.5倍体积的氯仿，萃取2-3次，收集、合并萃取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎得部位b。

本发明以远志药材为原料，采用现代提取分离技术得到远志的醇提物、水提物和部位a、b、c、d、e，通过体外ptp1b抑制剂筛选模型，对远志不同提取部位进行了活性筛选，筛选出部位b即氯仿部位对ptp1b具有明显的抑制作用，其可在制备治疗糖尿病药物中应用。

附图说明

图1远志各部位的提取、分离流程图；图中：ct：远志醇提物；wt：远志水提物；a：石油醚部位；b：氯仿部位；c：乙酸乙酯部位；d：正丁醇部位；e：萃取水部位。

图2远志石油醚部位的uplc-uv图谱。

图3远志氯仿部位的uplc-uv图谱。

图4远志乙酸乙酯部位的uplc-uv图谱。

图5远志正丁醇部位的uplc-uv图谱。

图6远志萃取水部位的uplc-uv图谱。

图7远志醇提物的uplc-uv图谱。

图8远志水提物的uplc-uv图谱。

图9远志部位b、e及阳性药对ptp1b的抑制活性

具体实施方法

实施例1远志各提取物及部位的制备

称取一定量的远志药材，剪短至1-2cm，加入10倍的95％乙醇浸泡10-12h，加热回流2h，重复浸泡2-3h、回流提取3次后合并提取液，过滤，将滤液减压浓缩至无醇味，即得到醇提物；将过滤后的药渣，加10倍水浸泡10-12h，加热回流2h，重复浸泡2-3h、回流提取3次后合并提取液，过滤，减压浓缩至流浸膏状，得到水提物；将醇提物与水提物等体积混合，加入1.5倍体积的石油醚(沸点60℃-90℃)，萃取3次，收集合并萃取剩余液体，在石油醚萃取后的剩余液体中加入1.5倍体积的氯仿，萃取3次，收集、合并萃取剩液，回收溶剂，浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎得部位b；在氯仿萃取后的剩余液体中加入1.5倍体积的乙酸乙酯，萃取3次，收集、合并萃取剩余液体，加入1.5倍体积的正丁醇，萃取3次，收集、合并萃取剩余液体，回收溶剂，浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎得部位e。

实施例2远志各提取、分离部位的uplc-uv图谱研究

对上述提取、分离的各部位进行uplc-uv研究，观察各部位之间是否存在化学成分的差异。具体方法和结果如下：

1.色谱柱

acquityuplcbehc18，2.1mm×50mm，1.7μm。(厂家：美国waters公司)

2.色谱条件

乙腈(a)-0.1％乙酸溶液(b)为流动相进行梯度洗脱，采集时间：40min，洗脱梯度见表1；检测波长：302nm；柱温：40℃；流速：0.3ml·min^-1；进样量：2μl。

表1洗脱梯度表

3.结果

部位b在保留时间(tr)位于22-28min区域中的化学成分种类及含量明显不同于其他部位，故推测此保留时间区域内的化合物为部位b抑制ptp1b活性的物质基础。

实施例3远志各提取物与部位的ptp1b抑制活性筛选

1.远志提取物及各部位对ptp1b抑制活性测定原理

为了特异地检测ptp1b的活性，我们采用对硝基苯磷酸盐法，检测纯化后的ptp1b活性。原理基于一个显色反应，对硝基苯磷酸二钠盐(pnpp)在ptp1b的催化作用下可分解成对硝基苯酚(pnp)和磷酸盐，其中pnp显黄色，在405nm处有强紫外吸收，由pnp[(ε＝1.78×10⁴(mol^-1·l·cm)^-1)]的摩尔浓度可以确定在ptp1b催化下被分解的pnpp的量。

半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration，ic50)，是抑制酶活性至原活性1/2时抑制剂的浓度，可用以评判抑制剂对于酶的抑制能力，ic50越低，说明抑制酶活性至1/2所需抑制剂越少，抑制剂对酶的抑制能力越高。将不同浓度的抑制剂，加入至同一条件下的酶-底物反应体系中，将单位时间内产物的增加量，与相同条件下未加抑制剂的对照体系比较后，以抑制百分数为纵坐标，抑制剂浓度的对数值为横坐标，作图得到其相应的ic50值。

2.远志提取物及各部位对ptp1b抑制活性测定

ptp1b的纯化：lb固体培养基灭菌后，按照(100ml培养基：100μlcam：100μlamp)加入24mg/ml的cam和100mg/ml的amp。铺板冷却后，取0.5μl-1μl菌液于板上，涂布均匀后，用封口膜封好，倒扣置于37℃培养箱中培养过夜。挑取单个、大小合适的菌于已加入cam和amp的5ml已灭菌的液体培养基中，于37℃摇床上200rpm培养过夜。将5ml菌液全部转移至500ml已灭菌的液体培养基中、灭菌后加入500μlcam、500μlamp，37℃于摇床200rpm培养，od值达到0.6-0.8时，按照每500ml培养基加250μl异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(itpg)的量加入iptg，置于37℃诱导4-5h，8000rpm离心10min，弃去上清，沉淀保存于-20℃。取1l培养基离心得到的菌体，加入50ml的提取缓冲液，重悬菌体，于冰浴上磁力搅拌30min，于50％的功率下超声破碎8min(超声破碎仪：scientzjy92-iin超声波细胞破碎机)，取少量菌液加入0.1mol/l的pnpp，显黄色则视为均匀。将上述破碎后菌液上至强碱性阴离子交换树脂柱(q柱)，挂柱1h，，用tris-hcl配制不同浓度的nacl洗脱液(0.05m、0.1m、0.15m、0.2m)，以流速1秒1滴进行梯度洗脱，用pnpp跟踪活性，收集有效流分放入冰盒保存于4℃。将q柱所得组分用tris-hcl分别稀释至0.05m，分别稀释再合并，加入至强酸性阳离子交换树脂柱(sp柱)，挂柱1h，用mes缓冲液配制不同浓度的nacl(0.05m、0.1m、0.15m、0.2m)进行梯度洗脱，收集pnpp显示有活性的流分。

阳性药(na3vo4，钒酸钠)的配制：称取0.1gna3vo4溶于蒸馏水，转移至10ml的容量瓶，用蒸馏水定容，制成10⁴μg/ml阳性药溶液。

缓冲液的配制：称取4.18gmops，2.92gnacl溶于800ml的蒸馏水中，用2mnaoh调节ph至7.2，转移至1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，临用现配。

ptp1b酶溶液的配制：取前述配好的缓冲液和纯化的ptp1b酶配成1ml缓冲液中含有7.36μlptp1b酶溶液

在96孔板中加入83μl前述配好的ptp1b酶溶液，加入远志提取部位溶液10μl，在37℃下恒温孵育30min，然后加入2μl的pnpp，于37℃恒温孵育15min。加入5μl2m预冷的naoh终止反应，通过酶标液测量其在405nm处的紫外吸收强度。每份样品进行3次平行实验，每一提取部位进行随行阳性药对照。通过graphpadprism5.0软件计算得到ic50值。

3.实验分组

本实验设置了远志ct、wt、部位a、部位b、部位c、部位d、部位e等8个组，分别进行对ptp1b酶活性抑制作用的检测。根据参考文献，当ic50＜55.96±1.14μg/ml时，认为其对ptp1b有较强的抑制效果。

4.实验结果

(1)钒酸钠阳性药的浓度设置为0.01，0.1，1，5，25，100μg/ml。钒酸钠的抑制曲线见图9-a，从抑制曲线可得，钒酸钠的ic50为0.1845±0.01μg/ml。

(2)部位e的抑制曲线见图9-c，其ic50为184.6μg/ml。从吸光度看，浓度为100μg/ml时才出现抑制作用，故认为该部位对ptp1b没有较强的抑制作用。

(3)部位b的抑制曲线见图9-b，其ic50值为1.213±0.3μg/ml，认为其对于ptp1b具有强抑制作用。