一种疏风解毒胶囊及其制备方法与检测方法及用途与流程

本发明涉及中药领域，具体涉及一种疏风解毒胶囊及其制备方法与检测方法及制药用途。

背景技术：

疏风解毒胶囊，是本专利申请人安徽济人药业有限公司的独家产品，批准文号为：国药准字z2009004，规格：每粒装0.52g。该品种是根据我国著名老中医向楚贤的祖传密方，原名“祛毒散”，研制的中药新药，由虎杖、连翘、败酱草、柴胡、马鞭草、板蓝根、芦根、甘草等药味组成。具有疏风清热，解毒利咽之功，用于治疗急性上呼吸道感染属风热证，症见发热，恶风，咽痛，头痛，鼻塞，流浊涕，咳嗽等，临床应用多年，疗效确切。本品被列为卫生部《甲型h1n1流感诊疗方案》(2009年第二版、第三版、2010年版)治疗风热犯卫首选中成药、《流行性感冒诊断与治疗指南(2011年版)》、国家中医药管理局《外感发热(上呼吸道感染)诊疗方案》和《时行感冒(甲型h1n1流感)诊疗方案》推荐用药，并纳入2009年版国家医保目录。

本品为本专利申请人安徽济人药业的拳头产品，是年产值、年销售额均过亿的中药大品种。2011年获得国家现代中药高技术产业发展专项支持，先后荣获“国家重点新产品”、“安徽省自主创新产品”、“呼吸系统疾病类中药十强”等一系列荣誉称号。本产品具有自主知识产权(专利号zl200510117119.8)，在治疗急性上呼吸道感染有着较好的疗效和市场，如何保证产品的稳定均一性及其安全有效性，是本品发展的亟待解决的问题。现行的疏风解毒胶囊检测方法仅规定了连翘、柴胡、马鞭草的薄层色谱鉴别方法和薄层扫描法测定大黄素含量的方法，而本品为8种中药药味原料组成，成分复杂，现有的检测方法尚处在较简单的初级阶段，显然不利于产品质量及疗效的保证。

产品质量的提高离不开检测方法的提高，因此，本发明的申请人安徽济人药业有限公司对疏风解毒胶囊检测方法进行大幅度提升，曾经于2014年10月27日申请了两件发明专利，发明名称分别为：一种疏风解毒胶囊指纹图谱的建立方法、一种疏风解毒胶囊的检测方法，申请号分别为：2014105823185、201410583418x，专利公开号分别为：104316613b、104330489b，两件专利分别提出了对疏风解毒胶囊的指纹图谱的检测方法，以及对其马鞭草苷、马鞭草苷、虎杖苷、连翘酯苷a、毛蕊花糖苷、甘草酸单铵盐、大黄素等几个成分进行检测的方法，这些检测方法对于提升疏风解毒胶囊的质量，起到了重要的推动作用。不过，在生产实践和科研实验中，申请人发现，表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d是疏风解毒胶囊重要活性成分，所以，申请人对此进行了反复的实验研究，提出并建立了同时对表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量进行检测的方法。

此外，申请人按照国家中药大品种开发战略的指导思想，对疏风解毒胶囊的新的治疗用途开展了系统性的研究，在研究中意外发现，疏风解毒胶囊对非酒精性脂肪肝具有非常突出的、令人意想不到的治疗效果。

本项目得到了国家科学技术部科技型中小企业技术创新基金的重点支持，项目名称：疏风解毒胶囊，项目类型：重点项目，立项代码：10c26213404286，批准文号：国科发计字[2010]543号。

技术实现要素：

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种疏风解毒胶囊及其制备方法与检测方法及制药用途。

本发明的目的是提供一种疏风解毒胶囊药物及其制备方法。

本发明的另一目的是提供疏风解毒胶囊的药物检测方法。

本发明还提供了疏风解毒胶囊的新的制药用途。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种疏风解毒胶囊，是由以下重量份的药味原料制成：虎杖5重量份、连翘4重量份、板蓝根4重量份、柴胡4重量份、败酱草4重量份、马鞭草4重量份、芦根3重量份、甘草2重量份。

一种疏风解毒胶囊的制备方法，该疏风解毒胶囊是由以下重量份的药味原料制成：虎杖5重量份、连翘4重量份、板蓝根4重量份、柴胡4重量份、败酱草4重量份、马鞭草4重量份、芦根3重量份、甘草2重量份，采用如下方法制备：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，即得。

一种疏风解毒胶囊的检测方法，该疏风解毒胶囊是由以下重量份的药味原料制成：虎杖5重量份、连翘4重量份、板蓝根4重量份、柴胡4重量份、败酱草4重量份、马鞭草4重量份、芦根3重量份、甘草2重量份，该疏风解毒胶囊是采用如下方法制备的：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，即得；

采用rp-hplc双波长切换法同时测定疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其检测方法的步骤如下：

(1)色谱条件：色谱柱：c18柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0至10min，乙腈从5％线性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从95％线性下降至85％，从11至20min，乙腈从15％线性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从85％线性下降至65％；流速：0.5～2.0ml·min^-1；检测波长：0至10min检测波长230～240nm，11至20min检测波长330～340nm；柱温：30～40℃；进样量：5～20μl；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d对照品，精密称定，置同一量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品内容物，精密称定，置离心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氢钠溶液，称定质量，超声提取，放冷，再称定质量，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液补足所减失的质量，离心，取上清液，滤纸过滤后，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：取混合对照品溶液、供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定。

上述检测方法，采用rp-hplc双波长切换法同时测定疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其检测方法的优选步骤如下：

(1)色谱条件：色谱柱：c18柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0至10min，乙腈从5％线性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从95％线性下降至85％，从11至20min，乙腈从15％线性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从85％线性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；检测波长：0至10min检测波长235nm，11至20min检测波长336nm；柱温：36℃；进样量：20μl；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d对照品，精密称定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品内容物0.1g，精密称定，置5ml离心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氢钠溶液4ml，称定质量，以功率300w、频率60khz超声提取40min，放冷，再称定质量，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液补足所减失的质量，离心，取上清液，滤纸过滤后，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定。

一种疏风解毒胶囊在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用，该疏风解毒胶囊是由以下重量份的药味原料制成：虎杖5重量份、连翘4重量份、板蓝根4重量份、柴胡4重量份、败酱草4重量份、马鞭草4重量份、芦根3重量份、甘草2重量份，该疏风解毒胶囊是采用如下方法制备的：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，即得；

采用rp-hplc双波长切换法同时测定疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其检测方法的步骤如下：

(1)色谱条件：色谱柱：c18柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0至10min，乙腈从5％线性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从95％线性下降至85％，从11至20min，乙腈从15％线性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从85％线性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；检测波长：0至10min检测波长235nm，11至20min检测波长336nm；柱温：36℃；进样量：20μl；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d对照品，精密称定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品内容物0.1g，精密称定，置5ml离心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氢钠溶液4ml，称定质量，以功率300w、频率60khz超声提取40min，放冷，再称定质量，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液补足所减失的质量，离心，取上清液，滤纸过滤后，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定。

以下实验研究用于验证本发明的技术方案的技术内容和技术效果，但并不限制本发明的保护范围。

实验一：rp-hplc双波长切换法同时测定疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量

1仪器与材料

hitachil2130高效液相色谱仪，包括hi-tachil-2400紫外检测器、d-2000ellte色谱工作站，由特赛恩斯仪器有限公司制造；kromasilc18色谱柱，规格：250mm×4.6mm，5μm，由安捷伦科技(中国)有限公司制造；sk250h超声波发生仪，由上海大广电超声波发生器公司生产；hc-2516高速离心机，由上海利鑫坚离心机有限公司制造。

表儿茶素没食子酸酯对照品(纯度质量分数为98.5％)，由上海哈灵生物科技有限公司生产；决明松-8-o-葡萄糖苷对照品(纯度质量分数为99.0％)，由成都德思特生物技术有限公司生产；丙二酰基柴胡皂苷d(纯度质量分数为99.0％)，由成都瑞芬思生物科技有限公司生产。乙腈(色谱纯)，由上海安谱实验科技股份有限公司生产；其他试剂(分析纯)，由上海安谱实验科技股份有限公司生产；水为重蒸馏水，由安徽济人药业有限公司实验室自制。

疏风解毒胶囊：处方：虎杖450g、连翘360g、板蓝根360g、柴胡360g、败酱草360g、马鞭草360g、芦根270g、甘草180g；

制备方法：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液的制备：分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d对照品适量，精密称定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备：取本品内容物0.1g，精密称定，置5ml离心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氢钠溶液4ml，称定质量，以功率300w、频率60khz超声提取40min，放冷，再称定质量，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液补足所减失的质量，离心，取上清液，滤纸过滤后，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3阴性对照溶液的制备

以胶囊制备工艺的处方比例，按“2.1.2”条方法分别制备缺虎杖和缺柴胡的阴性对照溶液。

2.2色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：kromasilc18柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0至10min，乙腈从5％线性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从95％线性下降至85％，从11至20min，乙腈从15％线性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从85％线性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；检测波长：0至10min检测波长235nm，11至20min检测波长336nm；柱温：36℃；进样量：20μl。

在上述色谱条件下分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的混合对照品溶液、阴性对照溶液和供试品溶液各20μl进样分析，各被测成分的色谱峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5，拖尾因子符合要求，理论塔板数按丙二酰基柴胡皂苷d计算不低于5000，色谱图见图1、图2、图3、图4。

2.3方法学验证

2.3.1线性关系的考察

分别精密量取混合对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml置10ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，配成不同质量浓度的混合对照标准系列溶液。按“2.2”条色谱条件进样分析，以各自的峰面积(y)为纵坐标，以质量浓度(x，mg·l^-1)为横坐标，绘制标准曲线。所得表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d回归方程，结果见表1。

表1线性关系

2.3.2精密度试验

取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d质量浓度分别为190.0、220.5、290.5mg·l^-1的同一混合对照品溶液，按“2.2”条色谱条件连续进样6次，测得表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d峰面积的rsd分别为1.6％、1.2％、1.1％。表明仪器的精密度良好。

2.3.3重复性试验

精密称取同一批号疏风解毒胶囊(批号：160128)内容物0.1g，按“2.1.2”条方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”条色谱条件进样分析，测得表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d含量的rsd分别为1.5％、1.3％、1.4％。表明方法重复性良好

2.3.4稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、6、8、10h，按“2.2”条色谱条件进样分析，求得表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d峰面积的rsd分别为2.3％、1.9％、2.8％。结果表明，供试品溶液在室温下10h内稳定。

2.3.5加样回收率试验

称取已知含量的疏风解毒胶囊(批号：160128)内容物9份，3份为一组，每份约50mg，精密称定。分别精密加入对照溶液适量，按“2.1.2”条方法制成低、中、高3个质量浓度的供试品溶液，按“2.2”条色谱条件进样分析，结果见表2。

表2表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的回收率试验(n＝9)

2.4供试品的含量测定

分别称取各批号疏风解毒胶囊10粒，精密称定。按“2.1.2”条方法制备供试品溶液，按“2.2”条色谱条件进样分析，采用外标法计算表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，结果见表3。

表3疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量(n＝3)(mg·g^-1)

3结论

采用本研究方法对疏风解毒胶囊的10个批次进行了指标性成分的含量测定。结果表明，表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d每克含量分别在1.20～1.45mg、0.90～1.55mg和2.40～3.60mg内。

本研究所建立的含量测定方法，同时测定3个指标性成分，结果准确，操作简便，分析时间快速，为完善疏风解毒胶囊的检测分析方法提供了依据。

实验二：疏风解毒胶囊对小鼠非酒精性脂肪肝的治疗作用

本研究用高糖高脂饲料喂养小鼠建立非酒精性脂肪肝模型，研究疏风解毒胶囊对非酒精性脂肪肝的治疗作用。

1仪器与试药

1.1试药

疏风解毒胶囊：处方：虎杖450g、连翘360g、板蓝根360g、柴胡360g、败酱草360g、马鞭草360g、芦根270g、甘草180g；

制备方法：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

壳脂胶囊(商品名：甘复生)，由内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司生产，批准文号：国药准字z20050665，规格：0.25g*30s，批号：20160125-8。

1.2试剂与仪器

丙二醛(mda)检测试剂盒，由北京百莱博科技有限公司制造，批号：20151223-9；超氧化物歧化酶(sod)检测试剂盒，由北京百莱博科技有限公司制造，批号：20160120；全自动生化分析仪，由北京华奥智恒科技有限公司制造，批号：20151227；三筒光学显微镜，由桂林市迈特光学仪器有限公司制造。

1.3动物

昆明种小鼠，spf级，♂，体质量(20±2)g，由安徽中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：scxk(皖)2012-2013。给予标准食物，自由饮水，保持光照和避光循环饲养(12/12h)；实验开始前保持室内饲养1周。

2方法

2.1非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立

将小鼠随机分为2组，正常对照组小鼠(14只)喂饲普通饲料，其余小鼠(34只)喂饲高脂饲料(40％普通饲料粉、20％猪油、15％蛋黄粉、10％奶粉、10％蔗糖、2.5％胆固醇、2.5％胆酸钠)，自由摄食、饮水。连续喂养5周后，从正常对照组和脂肪肝模型组分别处死4只小鼠，比较2组小鼠的血清和肝脏生化指标，以及肝脏组织病理切片，判断非酒精性脂肪肝模型小鼠是否建立成功。

2.2分组与给药

将造模成功小鼠30只随机分为3组，每组10只，分别为模型对照组、阳性药物组(壳脂胶囊100mg·kg^-1，1次·d^-1)、疏风解毒胶囊组(100mg·kg^-1，1次·d^-1)。连续给药6周，正常对照组(10只)和模型对照组给予等量蒸馏水。给药期间，除正常对照组标准鼠料饲养外，其余各组继续给予高脂饮食，直到实验结束。所有小鼠在末次给药后，禁食不禁水12h，小鼠眼球取血，分离血清，采用全自动生化分析仪检测血清谷总胆固醇(tc)、甘油三脂(tg)含量和丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)活性。取血后处死小鼠，取出肝脏，一部分用4％福尔马林固定，he染色，切片，送安徽中医药大学附属第一医院病理科，供组织病理学检查；另一部分，制成10％肝组织匀浆，测定其中tg、tc、mda、sod含量或活性。

2.3数据处理

采用spss12.0软件对数据进行统计学描述和分析，结果以(x±s表示，采用单因素方差分析进行多组间均数比较。

3结果

3.1非酒精性脂肪肝模型的建立

与正常对照组比较，高脂饲料喂养的模型小鼠血清和肝脏中tg、tc含量均显著升高(p<0.05或p<0.01)，血清中alt、ast活性和肝脏中mda含量显著升高(p<0.01)，sod活力降低(p<0.05)，结果见表1，肝组织病理切片观察可见肝细胞脂肪变性。表明非酒精性脂肪肝小鼠模型建立成功。

高脂饲料的配方是在基础饲料的基础上添加胆固醇、猪油、胆酸钠等，胆酸钠可以乳化脂肪，促进吸收。本实验通过高脂饲料喂养小鼠成功建立了非酒精性脂肪肝动物模型。

3.2小鼠血清和肝组织生化指标检测

实验结束时，阳性药物组小鼠的各项生化指标都有改善(p<0.05或p<0.01)。与模型对照组相比，疏风解毒胶囊组表现出降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中tg、tc含量和alt、ast活性的作用，降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中tg、tc、mda含量，升高sod活力的作用(p<0.05或p<0.01)。而且从各项生化指标的比较中，疏风解毒胶囊组的治疗效果与阳性药物组相当(p>0.05)，对于降低血清中的tc含量，疏风解毒胶囊组还优于阳性药物组(p<0.05)。结果见表4。

表4对非酒精性脂肪肝小鼠生化指标的影响(n＝10，)

注：与模型对照组比较，*p<0.05，#p<0.01

3.3疏风解毒胶囊对非酒精性脂肪肝小鼠肝组织病理学的影响

给药6周后，阳性药物组和疏风解毒胶囊组小鼠肝脏颜色接近正常肝脏的暗红色，而模型对照组小鼠的肝脏为乳白色。组织病理切片见图5、图6、图7、图8，实验结果显示，疏风解毒胶囊组的小鼠肝细胞脂肪病变程度减轻，肝细胞中几乎没有脂滴的沉积，肝细胞坏死程度降低。

4结论

本实验结果显示，疏风解毒胶囊组治疗6周，非酒精性脂肪肝小鼠血清和肝脏中tg、tc含量均明显降低，非酒精性脂肪肝小鼠的血清alt、ast水平和肝脏mda的量明显降低，sod活性显著升高，肝细胞脂肪变性得到修复，疏风解毒胶囊高剂量组小鼠肝脏组织形态接近正常状态。研究表明，疏风解毒胶囊对于非酒精性脂肪肝有治疗作用。

实验三：疏风解毒胶囊对小鼠慢性酒精性肝损伤模型的实验研究

疏风解毒胶囊对于非酒精性脂肪肝有治疗作用，按照常规的逻辑推理，疏风解毒胶囊对酒精性肝损伤也应该具有一定的治疗作用，发明人对此也进行了试探的实验研究。

1实验材料

1.1药物和试剂

造模剂：红星二锅头酒(清香型白酒，酒精度56％vol)，200ml/瓶，北京红星股份有限公司，启封后4℃冷藏保存。

受试药：

疏风解毒胶囊：处方：虎杖450g、连翘360g、板蓝根360g、柴胡360g、败酱草360g、马鞭草360g、芦根270g、甘草180g；

制备方法：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

阳性药物：联苯双酯片，由河北东风药业有限公司生产，批准文号：国药准字h13023295，规则：25mg，批号：20160221。用蒸馏水配制成浓度为0.40mg/ml的药液，4℃冷藏保存。

试剂：丙氨酸氨基转移酶(alt)试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(ast)试剂盒，胆固醇(tc)试剂盒，上海复星长征医学科学有限公司。

1.2实验动物icr小鼠，雄性，18～22g。由安徽中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：scxk(皖)2012-2013。

1.3实验仪器selectra-e全自动生化仪，由北京华奥智恒科技有限公司制造；低速大容量多管离心机，由上海嘉鹏科技有限公司制造；电子天平，由常州市天之平仪器设备有限公司制造；j-50型流化床气流粉碎机，由上海赛山粉体机械制造有限公司生产；winner2308智能型全量程干湿一体激光粒径仪，由济南微纳颗粒仪器股份有限公司制造；bp211d型电子分析天平，由常州市天之平仪器设备有限公司制造。

2.实验方法

2.1动物分组

雄性icr小鼠，分为疏风解毒胶囊、正常对照组、模型对照组、阳性对照(联苯双酯滴丸)组，每组10只，共10组。

2.2给药与造模

每日灌胃给药1次，灌胃容积均为0.1ml/10g体重。正常对照组和模型对照组给予水；疏风解毒胶囊灌胃给予0.5g/ml的疏风解毒胶囊。每次给药后2h，除正常对照组外，其余组按10ml/kg体重灌胃给予56°白酒，连续60天造成慢性酒精性肝损伤模型。

2.3指标测定末次灌胃给予酒精后禁食不禁水，12h后摘眼球取血，4000r/min离心15min，取血清备测alt，ast，tc。

2.4统计学处理：实验数据以x±s表示，组间差异采用t检验。

3.结果

对酒精性肝损伤小鼠血清alt，ast，tc的影响

表5结果显示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清alt、ast、tc明显升高(p<0.05，p<0.01)。与模型对照组比较，疏风解毒胶囊不能降低血清alt(p＞0.05)、血清ast(p＞0.05)和血清tc(p＞0.05)。说明疏风解毒胶囊对慢性酒精性肝损伤小鼠血清alt、ast、tc没有明显的改善作用，对酒精性肝损伤小鼠的改善作用不明显。

表5对酒精性肝损伤小鼠血清alt、ast的影响n＝10

与正常组相比:^△p<0.05，^△△p<0.01；与模型组相比:*p<0.05

附图说明：

图1为混合对照品溶液的高效液相色谱图

图2为缺柴胡阴性对照溶液的高效液相色谱图

图3为缺虎杖阴性对照溶液的高效液相色谱图

图4为疏风解毒胶囊样品的高效液相色谱图

图5为正常对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)

图6为模型对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)

图7为阳性对照组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)

图8为疏风解毒胶囊组小鼠肝脏组织病理切片图(200×)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1：

疏风解毒胶囊：

处方：虎杖450g、连翘360g、板蓝根360g、柴胡360g、败酱草360g、马鞭草360g、芦根270g、甘草180g；

制备方法：

s1：取虎杖、板蓝根粉碎成粗颗粒，加5倍量70％乙醇加热回流提取2h，滤过；药渣再加3倍量70％乙醇加热回流提取1h，滤过，滤液合并，回收乙醇并减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s2：取连翘、柴胡加7倍量的水，加热回流提取挥发油4h，分取分层的挥发油，备用；药渣和药液粗滤，滤液离心分离，上清液和药渣分别保存备用；

s3：取败酱草、马鞭草、芦根、甘草与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后药渣合并，加水煎煮提取二次，第一次加18倍量水提取2h，第二次加12倍量水提取1h，粗滤，滤液离心分离，两次提取的上清液与s2步骤得到的柴胡、连翘提取挥发油后的上清液合并，减压浓缩至60℃下相对密度1.35～1.40的稠膏，备用；

s4：取糊精、微粉硅胶，混匀，加入到上述s1步骤得到的水提浓缩稠膏与s3步骤得到的醇提浓缩稠膏中，充分搅拌均匀，铺层，真空干燥，粉碎，加入糊精，喷入s2步骤得到的挥发油，过筛，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。

采用rp-hplc双波长切换法同时测定疏风解毒胶囊中表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d的含量，其检测方法的步骤如下：

(1)色谱条件：色谱柱：c18柱，规格：250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈-0.4mol/l磷酸二氢钠溶液，梯度洗脱，洗脱程序为：0至10min，乙腈从5％线性上升至15％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从95％线性下降至85％，从11至20min，乙腈从15％线性上升至35％，0.4mol/l磷酸二氢钠溶液从85％线性下降至65％；流速：1.5ml·min^-1；检测波长：0至10min检测波长235nm，11至20min检测波长336nm；柱温：36℃；进样量：20μl；

(2)混合对照品溶液的制备：分别取表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d对照品，精密称定，置同一100ml棕色量瓶中，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为300.0mg·l^-1、350.0mg·l^-1和450.0mg·l^-1的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备：取本品内容物0.1g，精密称定，置5ml离心管中，精密加入0.2mol/l磷酸二氢钠溶液4ml，称定质量，以功率300w、频率60khz超声提取40min，放冷，再称定质量，用0.2mol/l磷酸二氢钠溶液补足所减失的质量，离心，取上清液，滤纸过滤后，取续滤液，再用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(4)测定：取混合对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定；

(5)测定结果：本品每克含表儿茶素没食子酸酯、决明松-8-o-葡萄糖苷和丙二酰基柴胡皂苷d分别为1.35mg、1.26mg、2.88mg。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。