一种用于治疗宫颈癌的中药提取物的组合物的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，所述中药提取物组合物由连翘和甘草两味中药组成。具体涉及一种由连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物组成的天然中药提取物组合物，该中药提取物的组合物用于制备治疗宫颈癌药物开发中的用途。
背景技术：
：恶性肿瘤是人类因疾病致死的第一因素。而子宫颈癌更是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率低于乳腺癌，死亡率低于居首位的卵巢癌，位居妇科恶性肿瘤第二位，严重影响和侵害女性的身心健康。根据古籍、古方中的记载，从中草药植物中提取有效组分，应用于当前疾病的临床治疗已取得突破性的进展。其中包括从中药中提取有效的抗肿瘤成分治疗相关肿瘤疾病，受到越来越多的研究人员重视，并得到了病患的接受，已经成为目前治疗恶性肿瘤的有效方法。传统中草药及天然产物中有效抗肿瘤成分的治疗也属于一种治疗手段。目前，从中药中获取抗肿瘤有效成分已成为肿瘤防治的研究热点。有文献报道已经证实甘草具有抗肿瘤功效，能激活多种癌细胞发生凋亡（夏岚，中华疾病控制杂志，201014（6）:524-527）。连翘提取物具有广谱抗肿瘤活性，对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用（抗肿瘤中药的临床应用主编张民庆，人民卫生出版社，63）。但是该两种药物在抗肿瘤作用方面，药物使用剂量大，抗癌效果有限，同时长期服用连翘还会造成肝肾功能的损害。并且过量的使用甘草还会导致血压升高，肌肉无力，慢性疲劳，头痛，肿胀，男性睾酮水平降低而引起阳痿、睾丸和阴茎萎缩等问题。因而需要探寻研发一种治疗效果稳定、高效低毒副作用的增效作用显著的天然药物组合物。连翘是我国传统中草药之一（始载于《神农本草经》），药用部分主要是果实；并且在传统医学中，甘草多属于使药，它有调和诸药的功能，而且很多传统药方都用上甘草配搭（《伤寒论》、《金匮要略》）。本发明人经过前期的实验和研究，得到了本发明的连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物组成的天然中药提取物的组合物，并且反复试验找到最佳地药物配比组合，并证明了其对宫颈癌细胞具有极好的抗肿瘤功效，两味中药的配伍起到了增效作用并减少了药物的使用剂量，降低了毒副作用，最终完成了本发明。技术实现要素：本发明的目的是为了解决抗肿瘤药物中现有技术所存在的不足，克服传统化疗药物会导致骨髓功能受到抑制、免疫功能降低和抗药性等问题；以及单味中草药使用剂量大，毒副作用难以控制，抗癌效果局限的不足。研发一种高效低毒、多靶点、多效应、不易产生耐药性、价格低廉、药源丰富，易于推广的抗肿瘤药物，本发明提出一种用于治疗宫颈癌的中药提取物的组合物。具体而言，本发明提供了一种中药提取物的组合物，由连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物以重量计按1-4:1的比例组成，均发现在这种用量范围内的中药提取物的组合物能获得很好的协同作用。上述中药提取物的组合物，其中连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物的用量配伍比例是2:1，其抑制宫颈癌细胞增值，诱导宫颈癌细胞凋亡效果最佳。其中，连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物本领域技术人员公知的常规方法进行提纯获得，采用常规方法获得的这些成分或商业购得的成分组成的本发明的天然中药提取物的组合物均能获得相同的疗效。优选地，上述中药提取物的组合物中连翘乙醇提取物的制备方法是:取连翘干燥果实，水洗除尘，蒸馏水浸泡过夜，文火煮沸2h，纱布过滤收集滤液，沉淀物重复上述操作；水提液100℃蒸发浓缩定容至1mg/ml后，90%乙醇溶液震荡混匀，室温浸提8h，低温离心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，加压浓缩后，浸膏冷冻干燥，即得。上述中药提取物的组合物中甘草丙酮提取物的制备方法是:将甘草根清洗，干燥，粉碎，过筛，水浸，低温离心10min（4℃，5000r/min），取沉淀物，以1g:10ml比例与丙酮混合，浸提8h，低温离心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，旋转蒸发，浸膏冷冻干燥，即得。本发明的中药提取物的组合物的制备方法是：按前述比例选取连翘乙醇提取物和甘草丙酮提取物，定比定量均匀溶解于乙醇溶液中，即得。本发明的天然中药提取物组合物在抑制宫颈癌细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡方面与现有单味中草药相比具有以下几点有益效果。本发明天然中药提取物组合物，在应用mtt比色法检测不同药物对宫颈癌hela细胞增殖的抑制作用实验结果显示:本发明天然中药提取物组合物随药物浓度的增加，其对hela细胞增殖抑制作用增强，呈现出很好的剂量效应关系，并且其抑制率与其他单味中药对照组均有显著性差异。表明本发明天然中药提取物组合物对hela细胞增殖抑制作用优于其单味中药成分。在采用流式细胞仪双染法检测hela细胞凋亡率的实验结果，证明了本天然中药提取物组合物作用于hela细胞后能够体外诱导细胞凋亡，杀死肿瘤细胞。并经统计分析对比得出，其诱导细胞凋亡率高于单味中药对照组，差异具有统计学意义。本发明人创造性地将连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物进行配伍组合，实验确定组份的配比用量范围，确定最佳配伍比例2:1，能够使该组合物发挥了最大的协同增效作用，而且极大降低了该两味中药的单独使用剂量，这是本发明人创造性实验过程的结果，本领域普通技术人员仅仅通过公开的内容无法简单获得这种配伍组合及配比用量范围。该天然中药提取物组合物连翘乙醇提取物与甘草丙酮提取物均可通过常规提取手段获得，天然中药提取物组合物的原材料充足，提取过程简单易操作。使得该天然中药提取物组合物具有成本低廉、获得方便、易于投入生产的效果。图1是中药提取物的组合物的制备及应用流程图。图2是不同药物对hela细胞增殖抑制的作用浓度—抑制率关系曲线图。图3是不同药物对hela细胞诱导凋亡的作用浓度—凋亡率关系曲线图。具体实施方式实施例1：中药提取物组合物的药物毒性试验观察测定。实验材料：（1）实验细胞：人宫颈癌hela细胞株：购自中国科学院上海细胞库，常规方法传代培养；（2）实验药物：中药连翘干燥果实，产地山西；中药甘草根，产地内蒙古，均购自黑龙江省中医药学会国医堂门诊部，经黑龙江省食品药品检验检测所中药室鉴定合格。实验方法：（1）中药连翘乙醇提取物的提取按照常规方法进行提纯获得：具体步骤为取连翘干燥果实，水洗除尘，蒸馏水浸泡过夜，文火煮沸2h，纱布过滤收集滤液，沉淀物重复上述操作；水提液100℃蒸发浓缩定容至1mg/ml后，90%乙醇溶液震荡混匀，室温浸提8h，低温离心10min（4℃，5000r/min），收集上清液，加压浓缩后，浸膏冷冻干燥，即得；（2）中药甘草根丙酮提取物的提纯方法同样按照常规方法获得，具体为首先使用蒸馏水对甘草根清洗2遍，置通风干燥环境自然晾干，而后经中药超微粒粉碎机粉碎成粉。再将甘草粉以1g:20ml比例溶解于蒸馏水中，浸泡过夜，低温离心10min（4℃，5000r/min），收集沉淀物；干燥后，再以1g:10ml比例与丙酮溶液混合，浸泡过夜，低温离心10min（4℃，5000r/min），收集上清液；经旋转蒸发器浓缩，鼓风干燥烘干。再经甲醇的溶解，低温离心10min（4℃，5000r/min），得到该提取物。将上述两种药物的提取物按重量份以2:1的配伍比例进行均匀混合，即得中药提取物组合物；（3）中药提取物组合物对hela细胞的药物毒性测定：将两种中药提取物（连翘乙醇提取物和甘草丙酮提取物）按不同配伍比例（1:1、2:1、3:1、4:1、5:1）及不同倍比稀释浓度剂量120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml；另设溶媒阴性对照组(乙醇浓度0.5%)加入到hela细胞96孔培养板中。置35℃、5%co2培养箱内培养，倒置显微镜下观察12h、24h、48h细胞的生长情况。采用cpe法进行记录，见表1。表1：药物毒性指标：细胞病变作用（cpe）。细胞病变作用（cpe）细胞状态“0”：无cpe细胞形态正常、贴壁生长良好“1”：cpe为1%－25%细胞圆缩或细胞破碎“2”：cpe为26%－50%细胞圆缩或细胞破碎“3”：cpe为51%－75%细胞圆缩或细胞破碎“4”：cpe为76%－100%细胞圆缩或细胞破碎实验结果：记录每孔细胞cpe的程度：“0”：无cpe；“1”：cpe为1%～25%；“2”：cpe为25%～50%；“3”：cpe为50%～75%；“4”：cpe为75%～100%，结果见表2。表2中药提取物组合物不同配伍比例不同浓度剂量作用hela细胞12h、24h、48h的毒性检测。实施例2：mtt比色法检测中药提取物组合物对hela细胞增殖抑制率及细胞毒性（ic50）测定。1、实验材料：同实施例1。2、实验方法：取处于对数生长期状态良好的hela细胞消化成细胞悬液，并用细胞培养液调整细胞密度，使之达到1.0×105个/ml。将细胞悬液按照100μl/孔加入96孔板，co2培养箱中温孵24h。药物配比2:1，药物终浓度依次为120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml，每孔100μl。并设立连翘乙醇提取物组，甘草丙酮提取物组，顺铂（ddp）药物对照组，溶媒阴性对照组（酒精浓度低于0.5%时不影响细胞生长）以及空白对照组（只加培养液，不加细胞和药物）。co2培养箱中分别温孵培养12h、24h和48h。弃去培养液，pbs清洗，加入0.5mg/ml的mtt，每孔200μl，co2培养箱中继续孵育4h。观察到蓝紫色沉淀形成后，吸弃mtt溶液，加入200μldmso，振荡10min。用酶标仪在490nm波长处测定吸光值。计算药物对肿瘤细胞的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率=[（实验组od-对照组od）－（对照组od值－空白组od值）/（对照组od值－空白组od值）]×100%，计算出ic50并绘制剂量-反应曲线。实验结果：根据实验结果，本发明中药提取物组合物随药物浓度的增加，其对hela细胞增殖抑制作用增强，呈现出很好的剂量效应关系，并且其抑制率与其他单味中药对照组均有显著性差异（p＜0.05）。计算得出，中药提取物组合物的半数抑制浓度（ic50）为10.90μg/ml，结果见表3。表3不同浓度药物作用24h对hela细胞增殖的抑制率。实施例3：应用流式细胞仪annexinv-pi双染法检测中药提取物组合物诱导人宫颈癌hela细胞凋亡情况。实验材料：同实施例1。实验方法：取处于对数生长期状态良好的hela细胞接种于50ml培养瓶中，置于37℃、5%co2培养箱温孵，调整细胞数量1×106个/ml。将中药提取物组合物（2:1）终浓度分别稀释至120μg/ml、60μg/ml、30μg/ml、15μg/ml、7.5μg/ml、3.75μg/ml于50ml培养瓶中，并设立连翘乙醇提取物对照组，甘草丙酮提取物对照组，溶媒阴性对照组。37℃、5%co2培养箱中温孵培养24h。4℃、1000r/min条件下离心10min，弃上清后收集细胞，重复前述条件用pbs清洗两次。用200μl结合缓冲液重悬细胞，而后加入10μlannexinⅴ-fitc和5μlpi轻摇混匀，避光室温反应15min或4℃反应30min。加入300μl结合缓冲液，并在1h内上流式细胞仪检测。实验结果：分析结果显示溶媒对照组细胞凋亡率为(3.52±1.94)%，中药提取物组合组（2:1）与其他单味药物对照组比较，各组间差异均有显著性（p＜0.01），且随剂量的升高凋亡率也增加，呈现明显的浓度依赖性（p＜0.05），结果见表4。表4不同浓度中药提取物组合物（2:1）诱导hela细胞凋亡率的情况。当前第1页12