本发明涉及一种具有防治心脑血管疾病功效的组合物及相应的药物，特别是由植物提取物成分为有效成分的相应组合物及药物。
背景技术：
丹参、红花为常用中药，中成药中的“丹红注射液”的有效成分就是由这二者以3:1组成。其基本制备方法，是将丹参用稀乙醇温浸提取后，药渣与红花混合，再加水温浸提取，合并提取液，浓缩、调节ph值6~7，冷藏、滤过，灌装即得。由于丹参酮难溶于水，而该制备方法的最后是对其水溶液冷藏后滤过处理，因而过滤后已除去了溶液中的丹参酮类成分，故该“丹红注射液”中实际上基本不含或仅含少量剩余的丹参酮类成分。
闻罗汉等（复方丹红滴丸的药学研究，大连理工大学硕士学位论文，2007.06）报道了用乙醇溶液回流提取及乙酸乙酯萃取工艺制备丹参有效组分（包含丹参酚酸和丹参酮类成分）后，另用乙醇溶液回流提取红花有效组分（包含红花黄色素类成分），并将所述的丹参有效组分、红花有效组分及冰片，与基质peg4000或6000热融混合后，滴入液体石蜡-二甲基硅油冷却剂中收缩制成滴丸。
cn105920096a的中国专利公开了一种丹参和红花以重量比为5:(1-2)的中药组合物，是用水、甲醇或50%甲醇水溶液提取，得到的提取物主要成分为丹参酚酸类、丹参酮类、醌式查尔酮类或黄酮类化合物，该组合物具有很好的抗心脑血管疾病的功效。cn1686275a的中国专利公开了一种由丹参及红花经提取所得丹参酚酸类有效部位、丹参酮类有效部位、红花黄酮类有效部位组成的药物“注射用丹红冻干粉针剂”，制备方法是将丹参分别用40~95%乙醇和水提取，提取物进一步处理后加适量注射用水，加热溶解，冷藏24小时，取上清液滤过，再进行超滤，或浓缩干燥，制得丹参酮类、丹参酚酸类有效部位。同样，由于丹参酮难溶于水，而其方法最后也是通过将水溶液冷藏后滤过，因而该“丹红冻干粉针”也基本不含或仅含少量剩余的丹参酮类成分。
cn1626075a的中国专利公开了一种由红花黄色素和总丹参酚酸组成的预防心脑血管疾病的药物组合物，其中的红花黄色素含有50%~100%的羟基红花黄色素a，总丹参酚酸中含有50%~100%的丹参酚酸b或其盐；cn1660266a的中国专利公开了一种由丹参总酚酸和红花总黄酮组成的治疗心脑血管疾病的口服药物组合物，其中红花总黄酮中羟基红花黄色素a含量≥10%，丹参总酚酸中丹参酚酸b含量≥35%。由此可见，中国专利cn1626075a和cn1660266a中的组合物，实际上同样也已丢弃了丹参酮类的有效组分。
目前已有文献报道的丹参、红花组合物，可大致有三种类型：（1）以丹参、红花为原料，采用常规的水、醇或醇-水溶液的提取物组成。其提取物收率高，但杂质多，有效成分含量低，引湿性强，制剂量大且成型困难，服用量大，依从性差等，不符合现代先进技术的发展方向和生活水平提高的需求；（2）采用易燃易爆的有机溶剂如乙酸乙酯等萃取、分离的提取物组成。其工业化生产工艺则存在严重的安全隐患和环境污染；（3）以单一有效成分如羟基红花黄色素a、丹参酚酸b和/或丹参酮iia为原料组成。其疗效不理想。
技术实现要素：
针对上述情况，本发明的目的是进一步提供一种能具有更好功效的防治心脑血管疾病的组合物，以及以该组合物为有效成分的具有防治心脑血管疾病的相应药物。
本发明防治心脑血管疾病的组合物，其特征是由红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物和丹参总酚酸提取物组成，其中以红花总黄色素计的红花总黄酮提取物、以丹参酮计的总丹参酮提取物和以丹酚酸b计的丹参总酚酸提取物的重量比为10:(1~10):(10~60)。在此基础上，所述的以红花总黄色素计的红花总黄酮提取物、以丹参酮计的总丹参酮提取物和以丹酚酸b计的丹参总酚酸提取物的重量比为10:(4~6):(20~40)，更进一步的优选比例为10:5:30。
为尽量减少和避免在所述各提取物中存在过多种类和/或比例量的其它成分可能产生或带来的不利影响，上述组合物中所述相应提取物的更好形式是，所述的红花总黄酮提取物中的红花总黄色素重量含量≥25%，和/或所述的总丹参酮提取物中的丹参酮重量含量≥20%，和/或所述的丹参总酚酸提取物中的丹酚酸b重量含量≥50%，以使上述组合物的质量及其效果能有更可靠的保证和提高。
在上述形式的组合物中，所述的总丹参酮提取物和/或丹参总酚酸提取物，除可以采用目前已有报道和/或使用的各种方法得到外，优选采用的是本申请人在中国专利cn104189073a中报道的方法制备得到的总丹参酮提取物和/或丹参总酚酸提取物。即，将粉碎后的丹参在温度≥20℃的条件下，用体积含量80±5%乙醇渗漉提取，收集的渗漉液除去乙醇后调ph值≤4，沉淀并固液分离，得到总丹参酮提取物（沉淀）；固液分离后的水溶液用大孔树脂吸附后，先用ph值≤7的水洗脱除杂，再用体积含量为40~80%的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液并除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
对于上述形式的组合物中所述的红花总黄酮提取物，除可以采用目前已有报道和/或使用的各种方法，包括如大孔树脂色谱法、溶剂萃取法或聚酰胺等柱层析分离法等方式制备得到外，优选建议的，是可参照刘晶等“大孔吸附树脂纯化红花黄色素研究”（中成药，2009,31(6):867），和/或李志峰等“红花有效部位制备工艺研究”（时珍国医国药，2013,24(3):643），和/或张莹“膜技术集成树脂制取高色价栀子黄色素的研究”（湖北工业大学硕士学位论文，2009年5月）等报道的方法，即可采用下述的方法之一制备得到：
方法1，红花用水或乙醇体积含量≤80%的乙醇水溶液提取，水提取液或由乙醇水溶液提取液除去乙醇后的水溶液调ph2~5，经大孔树脂吸附后用水洗涤除杂，再用30~80%乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物；
方法2，红花用水或乙醇体积含量≤80%的乙醇水溶液提取，水提取液或由乙醇水溶液提取液除去乙醇后的水溶液经膜分离除杂后，调ph2~5，经大孔树脂吸附后用水洗涤除杂，再用30~80%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物；
方法3，红花用水或乙醇体积含量≤80%的乙醇水溶液提取，水提取液或由乙醇水溶液提取液除去乙醇后的水溶液调ph2~5，经大孔树脂吸附后用水洗涤除杂，再用30~80%乙醇洗脱，洗脱液或除去乙醇后的水溶液经膜分离除杂，浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
上述各方法中所述对红花的水或水-醇溶液提取，包括目前已有报道和/或使用的渗漉法、回流法、超声法、搅拌温浸等常规方法。
众所周知，中药药效作用的发挥，具有多成分、多靶点、多途径的协同整合作用。现有研究表明，总丹参酮提取物中除丹参酮iia外，还含有隐丹参酮、丹参酮i等同类成分，除也具有丹参酮iia相似的功效外，还具有其自身的一些特点；同样，丹参总酚酸提取物中除丹酚酸b外，还含有丹酚酸a、丹酚酸c、迷迭香酸、紫草酸等，除可具有与丹酚酸b相似的作用外，也还具有其自身独特的特点；红花总黄酮提取物中除羟基红花黄色素a外，还含有红花黄色素a、红花黄色素b、红花黄色素c以及山奈素黄酮醇类成分等，这些成分除能产生与羟基红花黄色素a相似的作用外，也还具有其自身独有的特点。
深入研究及实验结果表明，这些成分的组合，除可分别对目前已知的丹参酮iia、丹参酚酸b、羟基红花黄色素a的作用有所加强外，还可以在其各自的心脑血管综合作用上，特别是在各提取物组合后的心脑血管的综合作用方面，起到显著的相互协同增效及互补的作用，而且不仅能使组合后的药效作用明显优于相应比例量的由单一羟基红花黄色素a、丹参酚酸b和/或丹参酮iia组成的药物组合物，同时还避免了为获得单一成分的羟基红花黄色素a、丹参酚酸b和/或丹参酮iia成分，而使包括红花黄色素a、红花黄色素b、丹酚酸a、迷迭香酸、紫草酸、隐丹参酮、丹参酮i等其它更多有益有效成分的丢失和浪费，使中药材资源个得到更充分和更好的利用，并显著降低了生产成本和价格，惠及民生。因此在药物经济学和药效作用方面都更具有显著的优越性。
在上述组合物的基础上，以上述的组合物为有效成分，与药物中可以接受的辅助和/或添加成分，按照目前常规的工艺和方法，可以制备成具有相应防治心脑血管疾病作用的药物。例如，作为一种优选的形式，是以上述的组合物为有效成分，与在口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助/添加成份混合后，按相应的现有常规工艺和方法处理，即可制成为相应的片剂、丸剂、胶囊剂，或适当形式的缓释剂、控释剂等口服型制剂的药物。
以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。
具体实施方式
实施例1
丹参粉末（粉碎过10目筛），在温度30~35℃条件下，按渗漉法常规操作，先用适量80%乙醇（均为体积含量，以下同）浸润，密闭放置3~6h，使药粉均匀润湿和膨胀，装入渗漉筒，加含醇量80%（v/v）的乙醇水溶液（以下均同此）浸渍5~10h后，以2~4ml/min×kg的速度渗漉，收集6~8倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至0.5g/ml（以生药计，以下同），调节ph值3（优选用盐酸），静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上hpd100大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积的水洗涤后，再用3倍柱床体积的50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。
红花用8~12倍量水于60~70℃温浸搅拌提取3次，每次0.5~1小时，滤过，滤液调约ph3，上hpd100型大孔树脂柱，用3倍柱床体积水洗涤除杂，再用4倍50%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
上述各提取物中相应有效成分的含量分别见表1~表3（以下均同此）。
分别取上述红花总黄酮提取物100g（以红花总黄色素计）、总丹参酮提取物50g（以丹参酮计）和丹参总酚酸提取物300g（以丹酚酸b计），加辅料淀粉1000g，混合均匀，制粒，压制5000片，即得本发明所述的片剂。
实施例2
丹参粉末（粉碎过20目筛），在温度20~25℃条件下，按渗漉法常规操作，用适量75%乙醇浸润，密闭放置2~4h，使药粉均匀润湿和膨胀，装入渗漉筒，加75%乙醇浸渍3~6h后，以2~3ml/min×kg的速度渗漉，收集8~10倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至0.2g/ml生药，用盐酸调节ph值4，静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上d101大孔吸附树脂柱，先用3倍柱床体积、ph值4的酸水洗涤后，再用4倍柱床体积的40%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。总丹参酮提取物用80%乙醇溶解，加入丹参总酚酸提取物，混合均匀，回收乙醇，干燥，得到丹参总酚酸和总丹参酮提取物。
红花用15~18倍量水于40~50℃超声提取2次，每次约0.5小时，滤过，滤液经pes-10聚醚砜超滤膜分离除杂后调ph2~3，上hpd300型大孔树脂柱，用4~5倍柱床体积水洗涤除杂，再用3倍70%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
分别取上述红花总黄酮提取物100g（以红花总黄色素计）、总丹参酮提取物100g（以丹参酮计）和丹参总酚酸提取物100g（以丹酚酸b计），加入到peg-6000熔融液中，充分搅拌均匀，在滴丸机中制成10000粒滴丸，即得本发明所述的丸剂型药物。
实施例3
丹参粉末（粉碎过40目筛），在温度25~30℃条件下，按渗漉法常规操作，用适量85%乙醇浸润，密闭放置1~3h，使药粉均匀润湿和膨胀，装入渗漉筒，加85%乙醇浸渍过夜，以1~3ml/min×kg的速度渗漉，收集10~12倍量的渗漉液，减压回收除尽乙醇，加水稀释至1g/ml生药，用盐酸调节ph值2，静置沉淀，过滤或离心，得到总丹参酮提取物；过滤或离心后的水溶液上ab-8大孔吸附树脂柱，先用2倍柱床体积、ph值2的酸水洗涤后，再用3倍柱床体积的80%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收除去溶剂，得到丹参总酚酸提取物。总丹参酮提取物用90%乙醇溶解，加入丹参总酚酸提取物，混合均匀，回收乙醇，干燥，得到丹参总酚酸和总丹参酮提取物。
红花用8~12倍量70%乙醇回流提取3次，每次1~2小时，滤过，滤液经超滤膜分离除杂后回收除尽乙醇，水溶液调ph3~4，上ab-8型大孔树脂柱，用3倍柱床体积水洗涤除杂，再用4倍40%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
分别取上述红花总黄酮提取物100g（以红花总黄色素计）、总丹参酮提取物10g（以丹参酮计）和丹参总酚酸提取物600g（以丹酚酸b计），加辅料适量，干压制粒，装制胶囊5000粒，即得本发明所述的胶囊剂。
实施例4
红花用15~18倍量50%乙醇溶液回流提取2次，每次1~2小时，滤过，滤液回收除尽乙醇后，水溶液经聚醚砜超滤膜分离除杂，调ph3~4，上hpd100型大孔树脂柱，用3倍柱床体积水洗涤除杂，再用4倍60%乙醇洗脱，乙醇洗脱液浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
取上述红花总黄酮提取物100g（以红花总黄色素计）和实施例1的总丹参酮提取物40g（以丹参酮计）、丹参总酚酸提取物400g（以丹酚酸b计），加辅料淀粉1000g，混合均匀，制粒，压制5000片，即得本发明所述的片剂。
实施例5
红花用10~15倍量水于50~60℃超声提取3次，每次约0.5小时，滤过，滤液调约ph3，上ab-8型大孔树脂柱，用3倍柱床体积水洗涤除杂，再用4倍50%乙醇洗脱，乙醇洗脱液或回收除尽乙醇后的水溶液，经聚醚砜超滤膜分离除杂，浓缩干燥，得到红花总黄酮提取物。
取上述红花总黄酮提取物100g（以红花总黄色素计）和实施例1的总丹参酮提取物60g（以丹参酮计）和丹参总酚酸提取物200g（以丹酚酸b计），加辅料适量，干压制粒，装制胶囊5000粒，即得本发明所述的胶囊剂。
以下通过具体的药学研究和药效学实验结果证明本发明的有益效果。
一、药学实验研究
实验1不同提取方法对提取物收率和含量的影响
1、丹参加10倍水回流提取3次，第一次2小时，第二次和第三次各1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到丹参提取物a。
2、红花加12倍水回流提取3次，第一次2小时，第二次和第三次各1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到红花提取物b。
3、丹参加10倍70%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二次和第三次各1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到丹参提取物c。
4、红花加12倍50%乙醇回流提取3次，第一次2小时，第二次和第三次各1小时，滤过，滤液合并，减压回收、浓缩，干燥，得到红花提取物d。
上述各样品提取物和实施例中的红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物，按下述方法进行含量测定。
红花总黄色素：参考文献方法（威宝霞等，分光光度法测定红花黄色素含量，药物分析杂志，2002，22（2）：137；梁颖等，红花黄色素中主要成分的含量测定，中国现代应用药学，2011，28（13）：1349），采用uv法，以羟基红花黄色素a为对照品，在检测波长403nm处测定红花总黄色素的含量。
羟基红花黄色素a：按2015版中国药典一部红花项下的方法（p.151页）测定。
丹酚酸b、丹参酮ⅱa、丹参酮：按2015版中国药典一部丹参项下的方法（p.76页）测定，其中，丹参酮含量包括丹参酮iia、隐丹参酮和丹参酮i。
实验2不同来源丹参、红花对提取物有效组分含量的影响
1．5批丹参来自四川、陕西、山东、安徽、山西，其中，四川、陕西丹参按实施例1方法制备，分别得到总丹参酮提取物（a、b）和丹参总酚酸提取物（a、b），山东、安徽丹参按实施例2方法制备，分别得到总丹参酮提取物（c、d）和丹参总酚酸提取物（c、d），山西丹参按实施例3方法制备，得到总丹参酮提取物（e）和丹参总酚酸提取物（e）。按上述方法测定各提取物中丹参酮和丹酚酸b含量，结果见表4。
2．5批红花来自四川、安徽、陕西、山东、新疆，分别按实施例1~实施例5中的相应方法制备，得到红花总黄酮提取物（a、b、c、d、e）。按上述方法测定各提取物中红花总黄色素的含量，结果见表4。
二、药效学实验研究
以实施例1所述的红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物和丹参总酚酸提取物为药效成分制成的本发明药物组合物作为试验药物进行的下述药效实验，可以表明本发明药物组合物所具有的有益效果。
实验3对内皮细胞和神经元缺氧再给氧的保护作用
1、实验方法：参见鄂征主编的《组织培养和分子生物细胞学技术》，北京：北京出版社，1994年12月，438页。
（1）mtt法测定内皮细胞存活率
致密单层细胞经药物作用后，用冰冷的pbs溶液洗涤2次，加入0.5mg/mlmtt溶液100ml，37℃掺入4小时，吸去残留液体，加入酸化异丙醇显色溶液100ml，30分钟内在波长595nm处用酶标仪测吸光度a值。观察试验药物对培养细胞生存的影响。
（2）mtt法测定神经元存活率
细胞培养10天后，向每孔加入0.5%的mtt10ml继续培养4小时，吸弃培养液，加入二甲亚砜（dmso）200ml/孔，待颗粒溶解后置于酶标仪上，在波长570nm处检测各孔的吸光度a值。观察试验药物对培养神经元生存的影响。
（3）培养细胞缺氧/再给细氧模型
正常培养基用95%n2和5%co2混合气体平衡30分钟后，获得缺氧培养基。细胞用缺氧培养基悬浮后置培养板，放入缺氧仓内（持续通入95%n2和5%co2混合气体为此缺氧环境），37℃孵育2小时（缺氧时间）后，立即更换正常的培养基，再孵育4小时（再给氧）。以未经处理细胞作为对照。
（4）药物给予方法
试验药物用培养基配制成10ug/ml的浓度。其中，ⅰ~ⅵ组，为以实施例1方法制备的不同红花总黄酮提取物:总丹参酮提取物:丹参总酚酸提取物（分别以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）比例形式的组合物/药物；ⅶ组为与ⅰ组（10:5:30）中相对应量的由单一成分的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b的组合物；ⅷ~ⅹ组分别为与实施例1中对应的单一组分的红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）；ⅺ~ⅹⅵ组分别为表4中的红花总黄酮、总丹参酮、丹参总酚酸（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）。缺氧期间药物用缺氧培养基配制，再给氧期间药物用普通培养基配制。
2、实验结果
（1）对内皮细胞缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用
新生牛脑微血管内皮细胞经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，mtt检测表明，缺氧再给氧（h/r）组细胞吸光度明显减小，经本发明试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用（ⅰ~ⅴ），与对照组比较p<0.01，如表5所示。此外，由表5还可以清楚地看出：
1）本发明药物组合物红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物按重量配比10:5:30比例配伍对内皮细胞缺氧再给氧（h/r）的保护作用最佳（ⅰ）；
2）缺失总丹参酮提取物的组合物10:0:30（ⅵ），或仅以ⅰ组（10:5:30）中相应量的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b的组合物（ⅶ），与ⅰ组比较p<0.05；
3）不同来源和含量的红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物（ⅷ~ⅹⅵ）均有明显的保护作用，与对照组比较p<0.05，但与ⅰ组比较p<0.05。
（2）对培养神经元缺氧2小时再给氧4小时损伤的保护作用
新生大鼠脑神经元经缺氧2小时再给氧4小时后，产生明显的死亡现象，mtt检测表明，缺氧再给氧（h/r）组细胞吸光度明显减小，经本发明试验药物保护的细胞均呈现出非常明显的保护作用（ⅰ~ⅴ），与对照组比较p<0.01，如表6所示。此外，由表6还可以清楚地看出：
1）本发明药物组合物红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物按重量配比10:5:30比例配伍对神经元缺氧再给氧（h/r）的保护作用最佳（ⅰ）；
2）缺失总丹参酮提取物的组合物10：0：30（ⅵ），或仅以ⅰ组（10：5：30）中相应量的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b的组合物（ⅶ），无明显的保护作用（p＞0.05）；
3）不同来源和含量的红花总黄酮提取物、总丹参酮提取物、丹参总酚酸提取物（ⅷ~ⅹⅵ）均有明显的保护作用，与对照组比较p<0.05。
实验4对小鼠耐缺氧能力的影响
1、试验动物：icr小鼠130只，随机分为13组。
2、实验方法：
取小鼠130只，体重为18~22g，随机分为13组，每组10只，雌雄各半，分别作为试验药物ⅰ—ⅳ组（红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物，以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）的高、低剂量组，ⅴ组为ⅰ组（10：5：30）中相应量的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b（单一成分纯品组合物），以及灯盏花素组和模型组（给以等量的生理盐水）。于实验前6天，每天灌胃给药一次，以不同浓度等容积给药0.1ml/10g体重。第7天最后一次给药后30分钟，将小鼠置于装有25g钠石灰的60ml密闭广口瓶中，记录小鼠的死亡时间。
3、剂量设置：试验药物组小鼠低剂量为50mg/kg，高剂量为100mg/kg；灯盏花素组小鼠低剂量为25mg/kg，高剂量为50mg/kg。
4、溶剂对照：生理盐水按0.1ml/10g灌胃。
5、给药途径：灌胃给药。
6、给药次数：1次/日，均给药7日。
7、观察指标及观察时间：观察小鼠在缺氧环境下生存的时间。实验结果见表7。
结论：本发明试验药物红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物（ⅰ—ⅲ）的低剂量组和高剂量组均可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间，与模型组相比有非常显著差异（p<0.01），如表7所示，表明本发明试验药物，可显著延长小鼠在缺氧状态下的存活时间。此外，由表7还可以清楚地看出，缺失总丹参酮提取物的组合物10：0：30（ⅳ），或仅以ⅰ组（10：5：30）中相应量的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b的组合物（ⅴ）的低剂量组无明显的保护作用（p＞0.05），高剂量组均可明显延长小鼠在缺氧状态下的存活时间（p<0.05）。
实验5对栓线法大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型的治疗作用
1、试验动物：sd大鼠192只，随机分为8组。
2、试验方法：参见徐江平等《中国中西医结合急救杂志》，2003；10（1）：31。
按组分别灌胃给予受试药物或溶剂对照，连续给予7天，末次给药后2小时按下述方法进行手术。
将大鼠用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离并结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈内动脉近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入4－0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血2小时后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈总动脉切口处，使血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。
存活鼠再灌注24后，观察大鼠行为变化，进行行为评分。参考zealonga的五分制评分标准：0分，正常，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。然后快速断头取实验鼠大脑，一部分分别称量左、右大脑半球湿重，置160℃烤箱内24小时后称干重，按以下公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(%)＝（湿重－干重）/湿重×100％；另一部分在前连合平面切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2%ttc溶液中，37℃孵育30分钟。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。数码相机拍摄记录，用medbrain2.0软件测出脑片总体积及梗塞区体积，并计算梗塞区占整个脑组织的百分比(%)；另一部分作组织形态学观察：脑组织经固定后，冠状切取大脑，常规脱水，石蜡包埋制片，he染色，光镜检验。
3、试验药物及剂量设置：
试验药物ⅰ：红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物（10：5：30），大鼠给药剂量为70mg/kg（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）。
试验药物ⅱ：红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物（10：1：60），大鼠给药剂量为70mg/kg（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）。
试验药物ⅲ：红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物（10：10：10），大鼠给药剂量为70mg/kg（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）。
试验药物ⅳ：红花总黄酮提取物：总丹参酮提取物：丹参总酚酸提取物（10：0：30），大鼠给药剂量为70mg/kg（以红花总黄色素、丹参酮、丹酚酸b计）。
试验药物v：为试验药物ⅰ（10：5：30）中相应量的羟基红花黄色素a+丹参酮iia+丹酚酸b（单一成分纯品组合物），大鼠给药剂量为36.72mg/kg。
4、药物配制：用4%tween-80混匀，再用纯净水配制成所需浓度，按1ml/100g灌胃给药。
5、溶剂对照：4%tween80的纯净水按1ml/100g灌胃。
6、给药途径：灌胃给药。
7、给药次数：均连续给药7日，每日1次。
8、观察指标及观察时间：观察大鼠行为、脑梗塞体积、组织形态学的变化。观察时间为再灌注24小时。
9、试验结果：见表8。
（1）对行为的影响：假手术组大鼠均无异常行为，神经行为评分为0；溶剂对照组大鼠出现不能完全伸展、对侧前爪向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状，行为评分为1.64±0.59；试验药物ⅰ～ⅲ组均可显著降低大鼠神经行为评分，同溶剂对照组比较有非常显著差异（p<0.05，p<0.01）；而试验药物ⅳ、ⅴ组无明显差异（p＞0.05）。
（2）对脑组织含水量的影响：溶剂对照组缺血-再灌注一侧（大脑右半球）脑组织含水量非常显著高于假手组。试验药物ⅰ～ⅲ组脑组织含水量均显著低于溶剂对照组（p<0.05，p<0.01）；而试验药物ⅳ、ⅴ组无明显差异（p＞0.05）。
（3）对脑梗塞体积的影响：假手术组脑组织无梗塞，溶剂对照组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞区占全脑组织的百分比为29.8±7.6％。试验药物ⅰ～ⅳ组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与溶剂对照组相比有非常显著差异（p<0.05，p<0.01）；同时试验药物ⅳ、ⅴ组与ⅰ组比较有明显差异（p<0.05）。
（4）对组织形态学的影响：假手术组两侧脑组织正常，溶剂对照组、试验药物ⅰ～ⅴ组非缺血侧脑组织均正常。对于缺血侧脑半球：溶剂对照组出现脑组织出血坏死及脑组织严重水肿、灶性坏死，试验药物ⅰ～ⅴ组均可缩小出血坏死灶；且试验药物ⅰ～ⅲ组的出血坏死灶明显小于ⅳ、ⅴ组。
上述对比实验结果充分表明，以本发明所述的组合物作为有效药用成分的相应药物，可明显缩小脑缺血再灌注损伤引起的脑组织出血坏死灶、减轻神经细胞和神经纤维的损伤，且效果分别显著优于现有文献报道和/或使用的实际上相当于不含丹参酮组合物成分（表5和表6中ⅵ组）、只含单一成分组合物组（ⅶ组）的药物，以及实际上相当于不含丹参酮组合物（表7和表8中ⅳ组）及只含单一成分组合物（ⅴ组）的药物。