一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种药物及其制备方法和应用，尤其涉及一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束及其制备方法和应用。

背景技术：

龙葵总碱(solasodine)，为茄科茄属(solanum)植物(如中药龙葵等)中含有的甾体生物碱提取物。二十世纪初，国外从茄科植物solanum.sodomeum中提取到龙葵总碱solasodine，对茄科植物生物碱作了系列的研究，研究表明龙葵总碱及其生物碱具有多种有效活性，特别是抗肿瘤活性。具备一定的抗肿瘤活性和较小的毒副作用，并且制备工艺简单，可以进行产业化生产。但龙葵总碱存在体内的分布不具选择性，水溶性差，对健康组织产生毒性及极易被清除等缺点，阻碍了其作为抗肿瘤药物的开发利用。

聚合物胶束(polymericmicelles)是由嵌段共聚物在水溶液中自组装形成的分子有序聚集体，具有经典的“核-壳”结构。作为药物载体，具有稳定、低毒、缓释、靶向的优点。由于聚合物具有亲水疏水的两亲结构，依据相似相容的原理，胶束疏水核可增溶难溶药物。肿瘤组织生长迅速，血管生成很快，新生血管外膜细胞缺乏、基底膜变形，纳米级的共聚物胶束能穿透肿瘤的毛细血管壁的“缝隙”进入肿瘤组织，而肿瘤组织淋巴系统回流不完善，造成粒子在肿瘤部位蓄积，实现了实体瘤的增强渗入停滞效应(epr)。另外纳米级胶束的粒径大小可延长其在血液中的循环时间，而长循环纳米粒能够更好地利用epr效应，从而提高药物对肿瘤细胞的毒性，增强疗效。另外，经聚合物胶束包裹的药物能避免药物被酶降解而失活，因此更加稳定。药物在吸收过程中，聚合物胶束的亲水外壳与纳米级的粒径能有效减少胶束与免疫球蛋白作用，减少微粒聚集，从而保护胶束不被网状内皮系统(reticuloendothelialsystem，res)识别并清除。同时，由于共聚物胶束的临界胶束浓度(cmc)较低，形成的胶束可以在较低浓度下保持稳定，从而延长了药物在血循环中的滞留时间，有利于提高药物的生物利用度。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术中的上述问题提出了一种能可以在较低浓度下保持稳定，从而延长了药物在血循环中的滞留时间，有利于提高药物的生物利用度的叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束，以叶酸和温敏材料修饰的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物作为载体，制备成具有靶向特征的聚合物胶束。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施为：

优选的，所述的叶酸及其衍生物是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸或四氢叶酸。

优选的，所述温敏材料为n-异丙基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯聚合的亲水链段。

优选的，所述亲水链段为在ph值7.4的pbs溶液中温度响应在38-40℃的亲水链段。

优选的，以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物为载体，包埋抗肿瘤药物；所述的抗肿瘤药物与环境响应基础共聚物质量比为：10：1～10:50。

优选的，所述聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物为泊洛沙姆，即pluronic。

本发明的第二个方面是提供一种环境响应基础共聚物在抗肿瘤药物领域中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种环境响应基础共聚物在抗肿瘤药物领域中的应用，所述环境响应基础共聚物为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。

本发明的第三个方面是提供一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：

步骤一、纳米胶束的制备：

以不同摩尔比聚合n-异丙基甲基丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯这两种不同功能单体，得到亲水链段，筛选得到在ph值7.4的pbs溶液中温度响应在38-40℃的亲水片段，通过加入引发剂和一定量的raft链转移剂pluronic-cta，在氮气保护下反应12小时反应完成后得到白色粉末状固体pluronic-pnh，作为温敏共聚物；

步骤二、采用溶剂挥发成膜法制备龙葵总碱载药胶束

称取一定量的温敏共聚物溶于氯仿中，完全溶解后加入一定量的龙葵总碱/氯仿溶液，混合均匀后使用超声分散，然后40℃旋蒸除去溶剂，旋干后龙葵总碱与共聚物在圆底烧瓶的内壁上形成一层薄膜。然后将圆底烧瓶置于超声清洗器中，边超声边用注射器慢慢加入一定量的超纯水，不断摇晃圆底烧瓶，使薄膜充分被超纯水润湿。加完超纯水后，继续超声分散，即可获得龙葵总碱载药胶束溶液；

步骤三、采用高压均质机法制备龙葵总碱纳米胶束

取fa-pf127-pnh，pf127-pnh，龙葵总碱，加到dmf中，超声溶解后，再加入超纯水，继续超声。在600bar的压力下，将混合液循环四次，流出液的温度为45℃。

优选的，所述步骤三中dmf添加量为20ml。

优选的，所述步骤三中fa-pf127-pnh添加量为30mg，pf127-pnh添加量为70mg，龙葵总碱添加量为4.22mg。

优选的，所述步骤三中的超纯水的添加量为80ml。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

通过本课题的研究可得到一种集载药、靶向、温敏控制释药于一体的聚合物载药胶束；并将这种具多种功能性的载体材料用于抗肿瘤中药龙葵总碱的载体胶束制剂制备，主要有以下优点：

(1)在聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物修饰优化后的温敏片段，胶束的两亲性可增溶难溶性药物，从而可以优化载药胶束的增溶作用，延长血液循环时间等性能。

(2)制备得到的依靠叶酸受体介导肿瘤靶向聚合物胶束具有温敏的性能，可使药物在肿瘤环境下控制释放，增加了对肿瘤组织的细胞毒性，也降低了对正常组织的毒性。

(3)在原有商品化材料聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物基础上改性，增加新的功能，既保留原材料的物理化学特性，又使其靶向性和释药性更智能化。

(4)载药胶束的制备方法适合产业化放大，不仅具有产业化前景，而且为其应用于临床给药提供了可能。

(5)将龙葵总碱制成共聚物载体胶束，提高龙葵总碱的溶解性，延长其在体内的滞留时间，提高药物的生物利用度。

附图说明

附图1为龙葵总碱纳米胶术合成示意图；

附图2为共聚物pluronic-pnh-pnas对nih3t3细胞存活率的影响；

附图3为龙葵总碱纳米胶束体外抗肿瘤活性；

附图4为龙葵总碱体外抗肿瘤活性。

具体实施方式

本发明提供了一种叶酸受体介导靶向龙葵总碱靶向纳米胶束及其制备方法和应用。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

下面结合具体实施实例对本发明做进一步的说明。

实施例1连接叶酸纳米胶束材料的制备

pf127溶解在丙酮中，倒入冰冻的己烷中通过结晶获得纯净的白色粉末，以进行进一步的实验。f127-cdi的制备：pluronicf127(1.2604g，0.1mmol)溶解在无水thf(20ml)形成无色透明液。然后，过多的cdi(0.1644g，1mmol/l)由蠕动泵以1rpm滴(15s/滴)在氮气气氛下在室温下添加到f127溶液中。滴加完成后，混合溶液用磁力搅拌12小时后用旋转蒸发器将混合浓缩至约10毫升。然后倒入冷冻乙醚(300ml)保存在20℃沉淀pf127-cdi。通过离心10000rpm消除未反应的cdi。收集产物为白色粉末(0.8700g)经真空干燥在35℃过夜。

pf127-cdi(0.6350g，0.05mmol)溶解在无水thf(20ml)中，在氮气气氛下在室温下通过蠕动泵以1rpm(15s/滴)的速度滴加到1，2-二氨基乙烷的四氢呋喃溶液中(25ml)。反应12h后，混合溶液浓缩至约10ml，用旋转蒸发器，然后倒入冷冻乙醚(300ml)保存在20℃沉淀pf127-nh2。通过离心10000rpm消除反应的原料。收集产物为白色粉末(0.5033g)经真空干燥在35℃过夜。

叶酸(0.2636g，0.06mmol)加入25mldmso中通过超声使溶解，然后，分别将10mlpf127-nh2(0.2525g)的二甲基亚砜溶液，dcc(0.2750g，0.1335mmol)，nhs(0.016g，0.1390mmol)，三乙胺(0.5ml)加入fa的dmso溶液中，并用磁力搅拌在避光条件下搅拌24小时。将反应后的混合物进入透析袋(分子量截止ff，截留分子量为8000-12000)进行72h的透析，其中前18小时每6小时换一次水，接下来每18小时换一次水。透析完成后，对透析袋内的产品进行冻干，获得pf127-nh-fa的淡黄色粉末。

实施例2温敏共聚物的合成

以不同摩尔比的(10:1，11:1，12:1)的nipaam和hema聚合得到亲水链段，初步选择合适的温敏功能响应区间，以获得合适的单体配比(约10:1)。在25ml圆底烧瓶中，分别加入1.26gnipaam(9.9×10-3mol)，100μlhema(8.25×10-4mol)，加入10mldmf溶解后，加入引发剂0.0032gaibn(1.95×10-5mol)和一定量的raft链转移剂pluronic-cta，超声溶解后通入氮气除氧，30分钟后将烧瓶置入80℃油浴锅中，在氮气保护下反应12小时。然后将冷却到室温的反应液倒入冰冷的无水乙醚中，-20℃过夜，离心获得白色沉淀，用无水乙醚洗涤沉淀三次，室温真空干燥，得到白色粉末状固体pluronic-pnh，作为温敏共聚物。

实施例3采用溶剂挥发成膜法制备龙葵总碱载药胶术

采用溶剂挥发成膜法制备龙葵总碱载药胶束：称取一定量的温敏共聚物与叶酸共聚物溶于氯仿中，完全溶解后加入一定量的龙葵总碱/氯仿溶液，混合均匀后使用超声分散20min，然后40℃旋蒸除去溶剂，旋干后龙葵总碱与共聚物在圆底烧瓶的内壁上形成了一层薄膜。然后将圆底烧瓶置于超声清洗器中，边超声边用注射器慢慢加入一定量的超纯水，不断摇晃圆底烧瓶，使薄膜充分被超纯水润湿。加完超纯水后，继续超声20min，即可获得龙葵总碱载药胶束溶液。

实施例4采用高压均质机法制备龙葵总碱纳米胶束

称取30mg叶酸共聚物fa-pf127-pnh，70mg温敏共聚物pf127-pnh，4.22mg龙葵总碱，加到20mldmf中，超声溶解后，再加入80ml超纯水，超声15min。在600bar的压力下，将混合液循环四次，流出液的温度为45℃。

实施例5nih3t3细胞用mtt法评价pf127-nh2和pf127-nh-fa的细胞毒性

实验步骤

取对数生长期的nih3t3细胞用胰酶消化、pbs洗涤、加入新鲜培养基吹打后将其制备成细胞悬液，取200μl的细胞悬液(1×105cells/ml)接种于96孔板中，每孔1×105个细胞。将96孔板置于37℃细胞培养箱中，在5％co2条件下孵育24h，通过显微镜观察可见细胞贴壁生长。然后吸去96孔板中的培养液，加入200μl溶有不同浓度共聚物胶束的培养液，继续培养48小时。吸去原培养液，每孔替换上新鲜的200μl培养液并加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续培养4小时。吸去原培养液，加入200μl的dmso，室温下震荡，充分溶解结晶。于590nm处用酶标仪测定光密度值(opticaldensity，od)。

实验结果：

实验结果如附图2所示，所合成的纳米胶术在达到较高浓度500mg/l，并与细胞共同孵育48小时之后也未发现对细胞的存活率有明显的影响。这表明这些共聚物材料的细胞毒性较低、生物相容性较好。

实施例6龙葵总碱纳米胶束的体外抗肿瘤活性评价

受试样品：将龙葵总碱或龙葵总碱聚合物胶束用dmso制备成50mg/ml溶液后，再用培养液稀释，加入培养板中化合物的终浓度分别为0.630、1.25、2.50、5.00、10.0μg/ml的dmem溶液，继续培养24或48小时后，用mtt法测定细胞的存活率，龙葵总碱纳米胶束结果如附图3所示，龙葵总碱结果如附图4所示：

将a549(人肺癌细胞)和hela(子宫癌细胞)以密度8*103/孔种在96孔板上，24h后弃去原培养基，加入200ul龙葵总碱浓度为0.630、1.25、2.50、5.00、10.0ug/ml的载药胶束dmem溶液，继续培养24或48h后，用mtt法测细胞的存活率。

实验结果，如图3和图4所示：载药胶束对两种细胞的作用趋势基本相同，随着药物浓度的增加和细胞培养时间的增加，细胞的存活率都有较大幅度地降低。而游离龙葵总碱对肿瘤细胞的浓度效应和时间效应没有载药胶束明显。这是因为游离龙葵总碱以小分子的状态通过被动扩散的形式进入细胞，而用叶酸修饰的载药胶束是通过与癌细胞表面的叶酸受体发生内吞作用，从而进入细胞中。在低浓度下，由于载药胶束浓度低，相应的胶束表面叶酸也少，从而与癌细胞表面的叶酸受体接触几率小，内吞作用不明显，因此游离龙葵总碱被动扩散的速度与胶束被内吞的速度相当，表现为在游离龙葵总碱作用下的癌细胞存活率比载药胶束的稍高或者相当。随着胶束浓度增大时，叶酸功能化的载药胶束对肿瘤细胞的靶向性越来越明显，有更多的叶酸与癌细胞表面的叶酸受体结合，使细胞内的药物浓度在较短时间内大大增加，因此在相同条件下，载药胶束对癌细胞的作用要大于游离龙葵总碱。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。