用于抑制因抗流感药引起的获得性免疫功能降低的组合物及其制造方法与流程

本发明涉及用于抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的组合物及其制造方法。

背景技术：

流感由于流感病毒的感染而发病。流感的感染力非常强，在日本每年约有1,000万人被感染。此外，由于流感具有流行性，一旦流行开始，就会在短时间内将感染扩散到很多人。其中，高龄者大多重症化，还存在引起肺炎等并发症，导致死亡的风险性。

目前，在流感的治疗中，例如通常使用奥司他韦(osv)等抗流感药。认为通过在发病后48小时内给予抗流感药，可以抑制流感病毒的增殖，缩短患病时间。然而，给予抗流感药会减少体内抗原量，从而存在导致机体获得的免疫功能降低的可能性。当机体的获得性免疫功能降低时，用于从体内除去病毒并且防止病毒再次感染的特异性抗体的产生量会减少。因此，与不使用osv的感染者相比，使用了osv的流感感染者在下一季的流感再感染率将变高，成为问题。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特表2010-518151号公报

专利文献2：特开2012-72113号公报

专利文献3：国际公开第2012/133827号公报

技术实现要素：

发明要解决的技术问题

近年来，确认了某些乳酸菌在流感感染的预防或治疗中是有效的。例如，在专利文献1中公开了干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)种的菌株用于制造可以口服给药的组合物的用途，该可以口服给药的组合物用于在疫苗接种后增强对流感的防御。此外，在专利文献2中开了含有属于嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)的乳酸菌作为有效成分的流感预防和/或治疗剂。此外，在专利文献3中公开了以副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)作为有效成分的抗流感病毒组合物。

然而，关于抑制给予抗流感药后针对病毒感染的免疫功能的降低，在上述专利文献1-3中均没有报道。

因此，本发明的目的在于提供能够抑制因给予抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的组合物及其制造方法。

解决技术问题的技术手段

本申请发明人等鉴于上述问题进行了深入研究，结果发现，与单独给予抗流感药的情况相比，在同时给予由乳杆菌(lactobacillus)属乳酸菌而来的乳酸菌产物(乳酸菌産生物)和抗流感药的情况下，可以抑制针对流感病毒的免疫功能的降低，从而完成了本发明。

根据本发明一方面的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物含有由乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为有效成分，抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低。即，在根据本发明一方面的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中，将由乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为组合物本身或者作为组合物的一种成分使用。另外，这里所说的“组合物”包括医药品、补充剂和食品添加剂等制剂、饮食品(动植物本身除外)以及饮食品组合物(包括加工饮食品)等动物(包括人)可以摄取的物质。

在上述用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中，上述乳杆菌属乳酸菌优选分类为保加利亚(bulgaricus)种。

在上述用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中，上述乳杆菌属乳酸菌优选是德式乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)。

上述用于抑制获得性免疫功能降低的组合物优选为发酵乳。

上述用于抑制获得性免疫功能降低的组合物还可以具有流感病毒感染抑制作用。

此外，根据本发明另一方面的制造方法是向乳杆菌属乳酸菌供给乳原料，制造用于抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的方法。

有益效果

如上所述，本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物含有由乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为有效成分。与单独给予抗流感药的情况相比，通过同时给予这样的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物和抗流感药，可以增加针对流感病毒的特异性抗体的量。因此，根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物，可以抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低。此外，根据本发明的制造方法，可以制造用于抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物。

附图说明

图1是示出了根据本实施例的试验1的结果(肺清洗液中的iga量)的图。

图2是示出了根据本实施例的试验1的结果(血清中的igg量)的图。

图3是示出了根据本实施例的试验2的结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行更具体的说明。但是，本发明并不限定于此。

(1)用于抑制获得性免疫功能降低的组合物

根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物含有由乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为有效成分。在此，乳酸菌产物包括乳酸菌发酵物、乳酸菌培养物、乳酸菌代谢物等。乳酸菌发酵物是指使用乳酸菌进行乳酸发酵后得到的结果物(包括培养物和生成物)。此外，乳酸菌培养物是在适于乳酸菌培养的培养基的存在下培养乳酸菌得到的结果物(包括培养物和生成物)。乳酸菌代谢物是通过乳酸菌的代谢作用得到的结果物(包括生成物)。另外，乳酸菌发酵物和乳酸菌培养物有时也意味着相同的物质，在这样的情况下，它们也可以彼此互换使用。

乳酸菌产物中可以含有也可以不含有乳酸菌本身(包括活菌和死菌)。另外，从益生菌的观点来看，优选使用含有活菌的乳酸菌发酵物。

此外，本文所谓的“乳酸菌”是利用葡萄糖作为营养源且对糖的吸收利用率在50％以上的产乳酸微生物的总称，作为生理学性质具有以下特征：革兰氏阳性菌的球菌或杆菌、无运动性、无芽孢形成能力、过氧化氢酶阴性等。自古以来，乳酸菌经由发酵乳等在世界各地被食用，可以说是安全性极高的微生物。乳酸菌分类为多个属。

而且，根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物含有由分类为乳杆菌(lactobacillus)属的乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为有效成分。即，根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物含有由乳杆菌属乳酸菌而来的发酵物、乳杆菌属乳酸菌的培养物和乳杆菌属乳酸菌的代谢物中的至少任一种作为有效成分。

作为乳杆菌属乳酸菌，例如可以列举保加利亚种、干酪(casei)种、嗜酸(acidophilus)种、植物(plantarum)种等。在这些乳杆菌属乳酸菌中，本发明中优选使用分类为保加利亚种的乳酸菌(也称为保加利亚菌)。进一步地，在乳杆菌属乳酸菌中，更优选使用德式乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)。

此外，更具体而言，德式乳杆菌保加利亚亚种包括德式乳杆菌保加利亚亚种oll1073r-1菌(保藏编号：fermbp-10741)(以下，称为“保加利亚菌r-1株”)等。

在各种乳杆菌属乳酸菌中，根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物更优选含有由“保加利亚菌r-1株”而来的乳酸菌产物作为有效成分。保加利亚菌r-1株于1999年2月22日(保藏日)在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(ipod，aist)(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)以保藏编号fermp-17227在日本国内保藏；并于2006年11月29日根据布达佩斯条约移交国际保藏，获得保藏编号ipodfermbp-10741。另外，由于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(ipod，nite)从独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心继承了专利微生物保藏业务，保加利亚菌r-1株目前保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(ipod，nite)(日本国千叶县木更津市かずさ镰足2-5-8122号室)(保藏编号：fermbp-10741)。

本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中所含的乳酸菌产物优选为乳酸菌发酵物。该乳酸菌发酵物包括乳酸菌的发酵物及其处理物，例如：将培养物(乳酸菌发酵物)使用过滤/离心分离或膜分离等进行除菌而得到的培养滤液或培养上清液、将培养滤液/培养上清液或乳酸菌发酵物等使用蒸发器等进行浓缩的浓缩物、糊化物(ペースト化物)、稀释物或(冷冻、加热、减压等)干燥物。另外，在制备处理物时，可以实施过滤、离心分离、膜分离等除菌处理，沉淀，浓缩，糊化，稀释，干燥等前述处理工序中的一种，或将多种组合实施。而且，作为乳酸菌培养物用的培养基，可以列举例如脱脂乳粉培养基、mrs培养基等。

作为本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中所含的乳酸菌产物，更具体而言，可以列举使用保加利亚菌r-1株对各种底物进行发酵得到的乳酸菌发酵物。

发酵中使用的底物只要是能够形成作为保加利亚菌r-1株生长或增殖的结果而产生发酵的环境的底物即可。该底物例如可以是人和动物乳以及蔬菜、水果、豆、谷类等食品材料，也可以是微生物的生长用或增殖用的培养基和原料乳。该底物优选为发酵后可作为食品摄取的食品材料，具体而言，可以是含有生乳(未灭菌乳)、灭菌乳、全脂浓缩乳、全脂乳粉、脱脂乳粉、脱脂浓缩乳、乳蛋白浓缩物(mpc)、乳清(ホエイ)、乳清粉、脱盐乳清、脱盐乳清粉、乳清蛋白浓缩物(wpc)、乳清蛋白分离物(wpi)、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白(カゼイン)、酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钙、奶油、黄油、豆乳等的培养基和原料乳；在这些食品素材中，可以是含有糖类(包括乳糖)和矿物质(ミネラル)、维生素、酵母提取物的培养基和原料乳。

另外，已知保加利亚菌r-1株产生作为代谢产物的胞外多糖(eps)。因此，本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物中也可含有由保加利亚菌r-1株产生的胞外多糖。在本发明中，例如，胞外多糖的每日摄取量的下限为500μg，优选为1.0mg，更优选为2.0mg。上限不受到特别限定，但例如为8.0mg。

此外，在发酵时，也可以并用保加利亚菌r-1株以外的乳酸菌和/或纳豆菌、酵母等类似的各种其它发酵菌。具体而言，可以使用在酸奶制造中作为发酵剂(スターター)菌使用的嗜热菌(嗜热链球菌streptococcusthermophillus)和在纳豆发酵中使用的纳豆菌等。

乳酸菌产物特别优选为乳酸菌的乳发酵物或乳培养物。作为乳发酵物或乳培养物，可以列举例如发酵乳。在此，“发酵乳”是指使乳发酵而成的物质。“发酵乳”包括例如由与乳和乳制品成分规格等有关的省令(乳等省令)定义的“发酵乳”、“乳酸菌饮料”、“乳饮料”、“天然奶酪(ナチユラルチーズ)”等，但不限定于此。例如，发酵乳为乳等省令定义的“发酵乳”，即将生乳、牛乳、特殊牛乳(特別牛乳)、生山羊乳、灭菌山羊乳、生绵羊乳、成分调整牛乳、低脂肪牛乳及加工乳等的乳或含有与其同等以上的无脂乳固体成分的乳等通过乳酸菌或酵母发酵而制成固体状(硬型)、糊状(软型)或液状(饮料型)物或是这些的冻结物，但不限定于此。

就本发明的发酵乳而言，无脂乳固体成分的浓度范围例如优选为4.0％以上12.0％以下，更优选为6.0％以上10.0％以下，进一步优选为7.0％以上9.0％以下。此外，乳脂肪成分的浓度例如优选为0.2％以上4.0％以下，更优选为0.3％以上3.0％以下，进一步优选为0.4％以上2.0％以下。

作为发酵乳的典型实例可列举酸奶。酸奶例如包括原味酸奶(プレーンヨーグルト)、硬酸奶(凝固型酸奶(セットタイプヨーグルト))、软酸奶、饮料酸奶等。

此外，在将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物作为发酵乳来实施的情况下，优选将适合1次摄取的量制成单个包装形式。由此，由于能够适当且简便地摄取有效成分的需要量，因此能够提高使用性。在此，“单个包装形式”包括所有形式。作为包装形式，例如可以列举带盖容器、带瓶盖的瓶、小袋、小包(パウチ)、管等。在本发明中，在各个单独包装或含有多个单独包装的包装中，可通过如下方式明确其用途：通过记载该制品的用途、功效、摄取方法等的说明；和/或通过制成添加记载物的包装；和/或通过揭示另外的小册子等的记载物等。

另外，本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物也可以作为发酵乳以外的形式的饮食品来实施。作为这样的饮食品的具体实例，例如可以列举奶酪、清凉饮料、口香糖、软糖、果冻、饼干等。但是，饮食品的形式不受到特别限定。

接着，对根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的生理活性进行说明。本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低。

作为抗流感药，例如已知奥司他韦(osv)、扎那米韦(ザナミビル)、帕拉米韦(ペラミビル)、拉尼米韦辛酸酯水合物(ラニナミビルオクタン酸エステル水和物)等。它们均是通过抑制神经氨酸酶来抑制病毒增殖的抗流感药。已知如果在流感患病时给予这样的抗流感药可以抑制病毒增殖，可以缩短患病时间；但另外一方面，会导致针对流感病毒感染的获得性免疫功能的降低。因此，与未给予抗流感药的人相比，给予抗流感药的人在下一季以后容易再次感染流感。这是因为通过给予抗流感药，减少了防止病毒再次感染的特异性抗体的产生量。作为这样的特异性抗体，例如可以列举iga抗体。已知iga抗体在人的呼吸道和鼻腔等中产生时，直接作用于流感病毒，防止对呼吸道粘膜上皮的感染。

在本说明书中，将如上所述的因给予抗流感药而导致产生的针对流感病毒感染的免疫功能的降低称为“获得性免疫功能降低”。本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物可以抑制因使用抗流感药而导致产生的“获得性免疫功能降低”。即，生物体通过摄取本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物，可以增加在生物体内产生的流感病毒特异性抗体(例如iga抗体、igg抗体等)的产生量。此外，即使在使用了抗流感药的情况下，通过摄取本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物，也可以抑制在生物体内产生的流感病毒特异性抗体的产生量的减少。

因此，通过将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物与例如抗流感药同时给予，可以抑制针对流感病毒感染的免疫功能的降低。因此，可以降低使用抗流感药的流感患者在下一季等再次感染流感的可能性。

另外，如下述实施例所示，保加利亚菌r-1株还具有抑制感染流感病毒的功能。即，本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物优选还具有针对流感病毒的感染抑制作用。由此，通过定期(例如每天)摄取本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物，还可以同时进行流感感染的预防。

如上所述，为了强化对流感病毒的抗性以及抑制获得性免疫功能的降低，优选在感染流感之前定期(优选每天)摄取本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物。为了每天容易地摄取本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物，本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物优选为发酵乳(例如酸奶)的形式。酸奶因其美味以及美容和健康层面而被广泛食用。通过将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物制成酸奶的形式，可以毫无困难地每天摄取其需要量。

此外，作为本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的适合1次摄取的量，例如，在无脂乳固体成分为8.0重量％的发酵乳(例如饮料型)的情况下，优选每1次为50ml以上200ml以下，更优选80ml以上150ml以下，进一步优选100ml以上120ml以下。或者，例如，在无脂乳固体成分为8.0重量％的发酵乳(例如硬型、软型)的情况下，优选每1次为50g以上200g以下，更优选80g以上150g以下，进一步优选100g以上120g以下。此外，摄取频率例如优选为1天0.5次以上5次以下，更优选1天1次以上3次以下，进一步优选1天1次以上2次以下。

此外，根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物具有抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的生理活性功能。因此，可以作为饮食品(动植物本身除外)、功能性食品、功能性饮料、医药品等的有效成分来利用。即，含有本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物作为有效成分的饮食品(动植物本身除外)、功能性食品、功能性饮料、医药品也包括在本发明的技术范围内。

此外，也可以将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物本身作为饮食品(动植物本身除外)、功能性食品、功能性饮料、医药品等来实施。即，根据本发明另一方面的饮食品、功能性食品、功能性饮料、医药品含有上述任一种由乳杆菌属乳酸菌而来的乳酸菌产物作为有效成分。进而，抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低。

此外，在将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物作为饮食品来实施的情况下，从生产效率、摄取的容易度和嗜好性等观点来看，优选为发酵乳的形式。此外，在本发明的一个方式中，发酵乳是在乳原料中添加乳杆菌属乳酸菌，将该乳酸菌发酵(培养)而得到的酸奶。

此外，在本发明的饮食品中，除了用于抑制获得性免疫功能降低的组合物之外，还可以含有食品(例如功能性食品)中可以含有的公知的添加物。作为这样的添加物，可以列举水、糖类、糖醇类、淀粉和加工淀粉、食物纤维、牛乳、加工乳、豆乳、果汁、蔬菜汁、水果·蔬菜及其加工品、蛋白质、肽、氨基酸类、动物及植物生药提取物、天然来源高分子(胶原、透明质酸、软骨素等)、维生素类、矿物质类、增粘剂、乳化剂、防腐剂、着色剂、香料等。

此外，在将本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物用于医药品的情况下，除了乳酸菌产物之外，还可以含有可以在医药品中含有的公知的添加剂。作为这样的添加剂，可以列举赋形剂、崩解剂、粘合剂、流化剂、矫味剂、香料、着色剂、甜味剂、溶剂、油脂、增粘剂、表面活性剂、凝胶化剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂等。

(2)用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的制造方法

接着，对根据本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的制造方法进行说明。本发明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的制造方法包括向乳杆菌属乳酸菌供给乳原料这样的工序。关于使用的乳杆菌属乳酸菌，可以采用上述(1)中说明的乳杆菌属乳酸菌。

作为乳原料，可以列举例如：牛乳等动物乳及其加工品(例如脱脂乳、全脂乳粉、脱脂乳粉、炼乳(れん乳)、酪蛋白、乳清、鲜奶油、复合奶油、黄油、酪乳粉、奶酪等)；来自于大豆的豆乳等植物性乳等。另外，乳原料可以进行灭菌处理，也可以不进行灭菌处理。此外，在用于制造用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的乳原料中，可以添加各种添加剂。

通过向乳杆菌属乳酸菌供给乳原料，对乳杆菌属乳酸菌进行发酵或培养，可以生成作为主成分的乳酸菌产物。通过根据本发明的制造方法制造的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物可以作为发酵乳获得。在这种情况下，根据本发明的制造方法也可以说是如下方法：向乳杆菌属乳酸菌供给乳原料，制造具有获得性免疫降低的抑制功能的发酵乳。

在该发酵乳制造中使用的原料中，不仅可以含有上述乳原料，还可以含有其它各种成分。因此，作为发酵乳制造中使用的原料，可以列举例如被称为发酵乳原料混合物(発酵乳原料ミックス)的原料。发酵乳原料混合物是指含有原料乳和其它成分的混合物。该发酵乳原料混合物例如可以通过将乳原料、水、其它任意成分(例如砂糖、糖类、甜味剂、酸味剂、矿物质、维生素、香料等)等在发酵乳制造中常用的原料加温溶解、进行混合而得到。在乳原料中也可以含有：生乳、灭菌乳、脱脂乳、全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂浓缩乳、脱脂浓缩乳、酪乳、黄油、奶油、奶酪等。而且，在乳原料中也可以含有：乳清蛋白浓缩物(wpc)、乳清蛋白分离物(wpi)、α-乳白蛋白(α-la)、β-乳球蛋白(β-lg)等。

与传统方法一样，经由原料混合物的调配工序、原料混合物的(加热)灭菌工序、原料混合物的冷却工序、发酵剂(スターター)的添加工序、发酵工序、发酵乳的冷却工序等工序来制造发酵乳。在原料混合物的调配工序中，将原材料混合(调配)。另外，就上述工序而言，适当采用在制造发酵乳时使用的通常的条件即可。而且，优选按照原料混合物的(加热)灭菌工序、原料混合物的冷却工序、发酵剂的添加工序、发酵工序以及发酵乳的冷却工序这一顺序实施。

作为用于培养乳酸菌的培养基，可以使用通常使用的培养基。即，只要是除主碳源以外适量含有氮源、无机物和其它营养素的培养基即可，可以使用任意培养基。作为碳源，根据使用菌的营养源利用特性(資化性)，可以使用：乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解产物、废糖蜜等。作为氮源，可以使用酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、糖巨肽、大豆蛋白水解产物等有机含氮物质。此外，作为增殖促进剂，可以使用肉提取物、鱼肉提取物、酵母提取物等。

乳酸菌优选在厌氧状态下进行培养，通常优选在液体静置培养等所使用的微好氧状态下进行培养。另外，对于在厌氧状态下的培养方法，可以采用在碳气气相下进行培养的方法等公知的方法，也可以采用其它方法。培养温度一般优选在30℃以上47℃以下的范围内，更优选在35℃以上46℃以下的范围内，进一步优选在37℃以上45℃以下的范围内。乳酸菌培养中的培养基的ph优选为维持在6以上7以下的范围内，但只要是菌生长的ph，也可以是其它的ph范围。作为乳酸菌等的培养时间，通常优选在1小时以上48小时以下的范围内，更优选在8小时以上36小时以下的范围内，进一步优选在10小时以上24小时以下的范围内。

典型地，发酵乳的无脂乳固体成分为8重量％以上，乳酸菌数或酵母数在10⁶个/ml以上10¹¹个/ml以下的范围内。

通过上述本发明的制造方法，可以制造用于抑制因使用抗流感药而引起的获得性免疫功能降低的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物。另外，上述(1)中说明的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物是通过本发明的制造方法制造的用于抑制获得性免疫功能降低的组合物的一个实例。

应该认为本次公开的实施方式在所有方面都是例示而不是限制性的。本发明的范围不是由上述说明而是由权利要求书的范围来表示，意在包括与权利要求书的范围等同的意思以及范围内的所有变更。

实施例

以下，示出实施例来更详细地说明本发明。另外，以下所示的实施例只不过是例示，并不限定本发明。

(试验1)

在试验1中，研究了通过摄取使用保加利亚菌r-1株制造的酸奶(以下称为“r-1酸奶”)对抗流感特异性抗体的量(iga抗体和igg抗体)的影响。具体而言，在预先给予r-1酸奶的小鼠和未给予r-1酸奶的小鼠间，研究了使流感病毒轻微感染后产生的抗体量是否存在差异。

(1-1)r-1酸奶的制造

在含有生乳、脱脂乳粉、奶油、砂糖、甜叶菊的混合物中添加德式乳杆菌保加利亚亚种oll1073r-1菌(保藏编号：fermbp-10741)(以下称为“保加利亚菌r-1株”)和嗜热菌作为发酵剂使其发酵，制造酸奶。

(1-2)对小鼠给予r-1酸奶等

作为试验对象，使用6周龄雌性balb/c小鼠(日本slc株式会社)。在进行试验时，将小鼠分组为以下4个组。对于各组使用9只或10只小鼠。

mc：给予超纯水(r-1酸奶的替代品)和0.5％甲基纤维素溶液的对照组(r1组的比较对照组)

r1：给予r-1酸奶和0.5％甲基纤维素溶液的组

osv：给予超纯水和溶解在0.5％甲基纤维素溶液中的奥司他韦的组

osv+r1：给予r-1酸奶和溶解在0.5％甲基纤维素溶液中的奥司他韦的组

如上所述，在mc组和osv组中，使用超纯水作为r-1酸奶的比较对照物。此外，在mc组和r1组中，使用为溶解液的0.5％甲基纤维素溶液(0.5w/v％甲基纤维素400)(和光纯药)作为osv的比较对照物。

在上述4个组中，对于mc组和osv组的小鼠，在流感病毒感染前，口服给予超纯水(r-1酸奶的替代品)21天(3周)。1次给予量为0.4ml。此外，给予次数为1天1次，病毒感染后也继续给予14天。

在上述4个组中，对于r1组和osv+r1组的小鼠，在流感病毒感染前，口服给予r-1酸奶21天(3周)。r-1酸奶的1次给予量为0.4ml。此外，给予次数为1天1次，病毒感染后也继续给予14天。

(1-3)对小鼠的流感病毒感染及osv给药

对于上述(1-2)的各组的小鼠，以0.5pfu(空斑形成单位)/小鼠经鼻感染流感病毒。使用的流感病毒是a型流感病毒(iav)/波多黎各/8/1934(pr8)(h1n1)(以下简称为pr8)。

病毒感染后，对于mc组和r1组的小鼠，口服给予作为osv溶剂的0.5％甲基纤维素(不含osv)。甲基纤维素的1次给予量为0.1ml。此外，给予次数为1天2次，给予天数为14天。

病毒感染后，对于osv组的小鼠和osv+r1组的小鼠，在0.5％甲基纤维素中溶解作为抗流感病毒药的一种的奥司他韦(磷酸盐)(フナコシ株式会社)，口服给予。奥司他韦(磷酸盐)的1次给予量为0.1mg/0.1ml/小鼠。此外，给予次数为1天2次，给予天数为14天。

如上所述，对osv组和osv+r1组的小鼠给予抗流感药(osv)，对mc组和r1组的小鼠未给予抗流感药。

(1-4)利用elisa评价抗流感特异性抗体效价(抗体価)

在病毒感染起第14天利用elisa评价抗流感特异性抗体效价。具体而言，评价小鼠肺清洗液中的iga抗体效价和小鼠血清中的igg抗体效价。

按照以下步骤进行elisa。向96孔板中以100μl/孔加入抗原调节液(抗原調整液)(pr8(0.5μg/ml)bsa(0.1％)/pbs)，实施抗原的固相化(抗原为0.05μg/孔)。在4℃下保持12小时后，使用清洗缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0)，0.14mnacl，0.05％tween20)将每个孔洗涤3次。向每个孔中加入足够量的封闭缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0)，0.14mnacl，1％bsa)，在37℃下保持2小时。使用清洗缓冲液将每个孔洗涤3次后，以100μl/孔添加用样品缓冲液(50mmtris-hcl(ph8.0)，0.14mnacl，0.05％tween20，1％bsa)适当稀释的测量样品(取自每组小鼠的肺清洗液或血清)。使用清洗缓冲液将每个孔洗涤5次。

将足够量的10,000倍稀释后的hrp缀合抗小鼠igg(bethyllaboratories社制造，#a90-131p)或2,000倍稀释后的hrp缀合抗小鼠iga(bethyllaboratories社制造，#a90-103p)添加到每个孔中。然后用清洗缓冲液将每个孔洗涤5次。以100μl/孔添加显色液(tmb(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，kpl社制造，sureblue，#52-00-02)，在室温下放置15分钟后，以100μl/孔添加终止液(tmb终止液，kpl社制造，#50-85-05)。然后，对各测量样品测定450nm下的吸光度，评价测量样品中的抗流感特异性抗体效价。

图1中示出了iga的测定结果。图2中示出了igg的测定结果。在各图的图中，各竖直棒表示各组(mc组、osv组、r1组、osv+r1组)内的标准偏差。此外，各组间的*标记意味着在风险率(危険率)小于5％时有显著差异，**标记意味着在风险率小于1％时有显著差异。

如图1所示，与仅给予奥司他韦的组(osv组)相比，肺清洗液中的iga抗体量在给予r-1酸奶和奥司他韦的组(osv+r1组)中显著增加。此外，如图2所示，与osv组相比，血清中的igg抗体量在osv+r1组中显著增加。

根据以上结果，确认了在使用保加利亚菌r-1株(德式乳杆菌保加利亚亚种oll1073r-1菌)制造的r-1酸奶中具有因抗流感药引起的获得性免疫功能降低的抑制效果。

(试验2)

在试验2中，从上述试验1的(1-3)中得到的各组(mc组、osv组、r1组、osv+r1组)的小鼠中采集鼻腔清洗液。将50μl该鼻腔清洗液与流感病毒pr8(100pfu)中和。然后，使其作用于mdck细胞(犬肾来源的细胞)，16小时后计测感染细胞数，由此评价r-1酸奶的流感病毒感染中和活性。

其结果如图3所示。在图中，各竖直棒表示各组(mc组、osv组、r1组、osv+r1组)内的标准偏差。此外，各组间的*标记意味着在风险率小于5％时有显著差异，**标记意味着在风险率小于1％时有显著差异。与对照组(mc组)相比，观察到r-1酸奶给药组(r1组)中感染细胞数显著减少。此外，在r-1酸奶和osv给药组(osv+r1组)与osv给药组(osv组)之间未发现显著差异，但是，如图3所示，与osv组相比，在osv+r1组一方中发现了感染细胞数稍微减少的倾向。

根据以上结果，确认了在使用保加利亚菌r-1株(德式乳杆菌保加利亚亚种oll1073r-1菌)制造的r-1酸奶中具有提高针对流感病毒的中和活性的效果。

保藏编号：

fermbp-10741

pct/ro/134表