可用于治疗免疫相关疾病的组合物的制作方法

本发明涉及可用于治疗个体的免疫相关疾病，特别是用于治疗特应性皮炎的化合物和组合物。

背景技术：

免疫相关疾病是人类衰弱性疾病的重要组成部分。实际上，这些疾病特别包括自身免疫性疾病，炎症性疾病，特别是炎症性皮肤病，以及过敏性疾病，包括皮炎、特应性皮炎、炎症性皮疹、哮喘和关节炎。

尽管这些病状的病因在很大程度上是未知的，但免疫相关疾病由正常免疫应答的失调引起。这种免疫失调通常涉及以下炎性细胞因子例如TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)的不适当激活(Cianferoni等,(2014)Expert Rev.Clin.Immunol.(临床免疫学专家评论)10:1463-1474)和CCL26(Kagami等,(2005)Clinical and Experimental Immunology(临床和实验免疫学)141:459-466；Sera等,(2008)An.Bras.Dermatol.(巴西皮肤病学分析)83:57-73)。

举例来说，特应性皮炎(也称为湿疹)是与表皮屏障的改变和对过敏原的高度敏感性相关的多因素疾病。它通常由反复的炎症性发作引起。特应性皮炎的主要症状是皮肤干燥(干燥症)、红疹、瘙痒和红色斑块。它通常始于儿童期，并且认为发达国家中15％至20％的婴儿患有特应性皮炎。这种疾病的进一步发展常常导致青少年哮喘和成人过敏性鼻炎。此外，所述疾病常常导致严重的身心痛苦。

炎症性皮肤病如特应性皮炎的常用药物治疗牵涉局部甾体化合物，特别是地塞米松(Hon等,(2015),Hong Kong Med.J.(香港医学杂志),21:251-261)，其用于减少炎症。作为局部甾体化合物的补充，日常护理，例如无皂洁肤乳和保湿剂，尤其对减少皮肤干燥至关重要。然而，基于甾体化合物的治疗具有若干副作用，例如皮肤萎缩，并且它们的有效性随时间降低。此外，患者通常对其耐受性差。更通常地，目前可用于特应性皮炎的治疗仅是对症治疗，不能维持持久的缓解。

因此，需要替代这些疗法的方案，除治疗症状之外，所述替代方案还可有效治愈免疫相关疾病。

技术实现要素：

本发明源于本发明人的意外发现，即牙龈成纤维细胞条件培养基可以抑制炎症状况下人类角质形成细胞(即皮肤细胞)分泌炎性细胞因子TSLP、CCL-26和IL-1β。

因此，本发明涉及用于治疗或预防个体的免疫相关疾病的牙龈成纤维细胞衍生产品。

在本发明的一个实施方案中，上文定义的牙龈成纤维细胞衍生产品与至少一种供预防或治疗炎症性皮肤病用的药剂相联合，所述药剂特别地选自皮质类固醇、钙调神经磷酸酶(calcineurin)抑制剂、润肤剂和保湿剂。

本发明还涉及一种包含牙龈成纤维细胞衍生产品的组合物，其用于预防或治疗免疫相关疾病。

本发明还涉及一种组合物，其包含如上文所定义的牙龈成纤维细胞衍生产品并且还包含至少一种供预防或治疗炎症性皮肤病用的药剂以及任选地包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物特别地用于预防或治疗免疫相关疾病。

本发明还涉及牙龈成纤维细胞衍生产品用于个体的皮肤干燥的美容治疗的非治疗性用途，所述产品任选地与至少一种供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂相联合。

本发明还涉及一种美容组合物，其包含牙龈成纤维细胞衍生产品和至少一种供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂，以及任选地包含至少一种美容学可接受的载体或赋形剂。

本发明还涉及一种预防或治疗个体的炎症性皮肤病的方法，该方法包括向所述个体施用预防或治疗有效量的牙龈成纤维细胞衍生产品。

本发明还涉及上文所述的用于预防或治疗炎症性皮肤病的方法，该方法还包括向个体施用至少一种供预防或治疗炎症性皮肤病用的药剂，所述药剂优选选自皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂、润肤剂和保湿剂。

本发明还涉及一种用于个体皮肤干燥的美容治疗方法，该方法包括向所述个体施用美容学有效量的牙龈成纤维细胞衍生产品和任选的至少一种供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂。

本发明还涉及一种用于个体皮肤干燥的美容治疗方法，其包括向所述个体施用美容组合物，所述美容组合物包含牙龈成纤维细胞衍生产品，并且还包含至少一种供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂，以及任选地包含至少一种美容学可接受的载体或赋形剂。

发明详述

如本文所预期，术语“包含”具有“包括”或“含有”的含义，这意味着当对象“包含”一个或几个要素时，除了所提及的那些之外的其它要素也可以包括在该对象中。相反，当对象被称为“由一个或几个要素组成”时，该对象限于所列出的要素并且不能包括除了所提及要素之外的其它要素。

免疫相关疾病

如本文所述，“免疫相关疾病”是指与功能障碍相关或由功能障碍导致的任何疾病，特别是失调，例如免疫系统的过度激活。

根据本发明的免疫相关疾病优选选自炎症性疾病，特别是慢性炎症性疾病、炎症性皮肤病、自身免疫性疾病和过敏性疾病。更优选地，根据本发明的免疫相关疾病选自炎症性皮肤病、虹膜炎和哮喘。

优选地，根据本发明的炎症性皮肤病是慢性炎症性皮肤病。优选地，根据本发明的炎症性皮肤病还选自皮炎、炎症性皮疹、鱼鳞病和银屑病。

优选地，所述免疫相关疾病是皮炎。皮炎是指本领域普通技术人员熟知的一组瘙痒性慢性炎症性皮肤病，并且其在世界卫生组织的国际疾病分类(ICD-10)2016版的第10次修订版中的L20至L30类中特别定义。

因此，根据本发明的皮炎优选选自：

-特应性皮炎(例如L20ICD-10)，

-脂溢性皮炎(例如L21ICD-10)，

-尿布皮炎(例如L22ICD-10)，

-过敏性接触性皮炎(例如L23ICD-10)，

-刺激性接触性皮炎(例如L24ICD-10)，

-未明确的接触性皮炎(例如L25ICD-10)，

-剥脱性皮炎(例如L26ICD-10)，

-由于内服物质引起的皮炎(例如L27ICD-10)，

-慢性单纯性苔藓和痒疹(例如L28ICD-10)，和

-瘙痒症(例如L29ICD-10)。

更优选地，根据本发明的免疫相关疾病是特应性皮炎。如本文所述，皮炎也称为湿疹。

根据本发明的慢性炎症性疾病优选选自类风湿性关节炎、红斑狼疮和多发性硬化症。

根据本发明的炎症性皮疹在ICD-10的R21类中特别定义。根据本发明的鱼鳞病在ICD-10的L85和Q80类中特别定义。根据本发明的银屑病在ICD-10的L40类中特别定义。根据本发明的红斑狼疮在ICD-10的L93类中特别定义。根据本发明的哮喘在ICD-10的J45类中特别定义。根据本发明的类风湿性关节炎在ICD-10的M06类中特别定义。根据本发明的虹膜炎在ICD-10的H19类中特别定义。根据本发明的多发性硬化症在ICD-10的G35类中特别定义。

个体

如本文所述，根据本发明的“个体”优选是哺乳动物，更优选是人类或宠物。最优选地，根据本发明的个体是人类。

优选地，根据本发明的个体是婴儿、儿童或青少年。此外优选地，根据本发明的个体是成人。

在本发明的一个方面，根据本发明的个体可具有免疫相关疾病的一种或多种症状。

在本发明的另一方面，根据本发明的个体未患有免疫相关疾病，特别是根据本发明的炎症性皮肤病。在根据本发明的非治疗用途或皮肤干燥的美容治疗的框架中尤其如此。

牙龈成纤维细胞衍生产品

如本文所述，“牙龈成纤维细胞衍生产品”涉及可以从牙龈成纤维细胞本身获得或含有牙龈成纤维细胞分泌物的任何产品。根据本发明的牙龈成纤维细胞衍生产品优选选自牙龈成纤维细胞全细胞、牙龈成纤维细胞培养物、牙龈成纤维细胞提取物和牙龈成纤维细胞条件培养基。

用于获取、培养和保存牙龈成纤维细胞的程序是本领域普通技术人员所熟知的，并且特别描述于Naveau等,(2006)J.Periodontol.(牙周病杂志)77:238-47以及Gogly等,(2007)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.(动脉硬化血栓血管生物学杂志)27:1984-90中。优选地，将牙龈成纤维细胞取样并在血小板裂解物存在的条件下在无血清的培养基中培养，如Doucet等,(2005)J Cell Physiol.(细胞生理学杂志)205:228-36中所述。特别地，牙龈成纤维细胞能够如下获得：培养牙龈样品或活检，任选地在酶促消化样品或活检后，以从其中释放牙龈成纤维细胞。因此，源自牙龈样品或活检的培养物的细胞基本上是牙龈成纤维细胞。

牙龈成纤维细胞提取物可通过本领域已知的任何细胞碎裂方法获得。优选地，根据本发明的牙龈成纤维细胞提取物选自细胞膜提取物、细胞质提取物或细胞核提取物。

优选地，根据本发明的牙龈成纤维细胞条件培养基涉及液体细胞培养基，特别是无血清的培养基和/或包含血小板裂解物的培养基，所述培养基已与牙龈成纤维细胞接触，特别地历时足以使牙龈成纤维细胞在培养基中已分泌的时间。因此，根据本发明的牙龈成纤维细胞条件培养基含有牙龈成纤维细胞分泌物。

确定哪种培养基适合于该培养基中的牙龈成纤维细胞完全在本领域普通技术人员的共同技能范围内。特别地，培养物可以是本领域普通技术人员已知的任何类型，以维持牙龈成纤维细胞的存活和/或生长。举例来说，根据本发明的合适的牙龈成纤维细胞条件培养基有达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、伊格尔最低必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium，MEM或EMEM)、伊格尔最低必需培养基α变型(Eagle's Minimum Essential Medium Alpha Modification，Alpha MEM)和伊格尔基本培养基(Basal Medium Eagle，BME)。

优选地，牙龈成纤维细胞已与培养基接触至少2、4、6、8、10、12、24、36或48小时。此外优选地，牙龈成纤维细胞已与培养基接触少于72、56或48小时。

根据本发明的牙龈成纤维细胞条件培养基可以经历例如离心、过滤或浓缩的处理步骤。特别地，根据本发明的牙龈成纤维细胞条件培养基可以是浓缩的牙龈成纤维细胞条件培养基，更具体地是相对于其所源自的未浓缩牙龈成纤维细胞条件培养基浓缩2、5、10、25或50倍的牙龈成纤维细胞条件培养基。

优选地，根据本发明使用的牙龈成纤维细胞衍生产品包括：

-从个体获取牙龈成纤维细胞；

-培养所述牙龈成纤维细胞；

-从经培养的牙龈成纤维细胞获得牙龈成纤维细胞衍生产品；

-向所述个体施用所述牙龈成纤维细胞衍生产品。

优选地，根据本发明的牙龈成纤维细胞是自体的，这意味着它们取自要施用牙龈成纤维细胞衍生产品的个体。然而，根据本发明的牙龈成纤维细胞也可以是同种异体的，这意味着它们取自相同物种的另一个体，或者根据本发明的牙龈成纤维细胞是异源的，这意味着它们取自另一物种的另一个体。

施用

优选地，根据本发明的牙龈成纤维细胞衍生产品以预防或治疗有效量被施用，以预防或治疗炎症性皮肤病。此外优选地，根据本发明的牙龈成纤维细胞衍生产品以美容学有效量被施用以治疗皮肤干燥。

本发明的牙龈成纤维细胞衍生产品或包含该牙龈成纤维细胞衍生产品的药物组合物或美容组合物的施用可以通过本领域中已知的任何方法进行。优选地，牙龈成纤维细胞衍生产品或包含该牙龈成纤维细胞衍生产品的药物组合物或美容组合物的施用位于待治疗的皮肤区域附近或其上的部位。更优选地，牙龈成纤维细胞衍生产品或包含该牙龈成纤维细胞衍生产品的药物组合物或美容组合物通过皮下、静脉内、肌肉内、皮内或局部被施用在待治疗的皮肤区域附近或其上。最优选地，牙龈成纤维细胞衍生产品或包含该牙龈成纤维细胞衍生产品的药物组合物或美容组合物被局部施用。

优选地，根据本发明待治疗的皮肤区域是指其中本发明的炎症性皮肤病的一种或多种症状是目视可见的部位或紧邻该部位。此外优选地，根据本发明待治疗的皮肤区域是指其中本发明的皮肤干燥的一种或多种效果是目视可见的部位或紧邻该部位。

优选地，牙龈成纤维细胞衍生产品或包含该牙龈成纤维细胞衍生产品的药物组合物或美容组合物是洗剂、霜剂、膏剂、凝胶剂、喷雾剂、擦拭物、衬垫或贴剂的形式。

额外化合物

用于预防或治疗本发明的炎症性皮肤病、特别是特应性皮炎的药剂，可以是本领域普通技术人员已知的任何类型。优选地，用于预防或治疗本发明的特应性皮炎和/或炎症性皮疹的药剂选自皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂、润肤剂和保湿剂。

根据本发明的皮质类固醇可以是本领域普通技术人员熟知的任何类型，例如地塞米松、倍他米松、泼尼松龙、泼尼松、替可的松和曲安西龙。

钙调神经磷酸酶抑制剂可以是本领域普通技术人员熟知的任何类型，例如环孢菌素和修饰环孢菌素。

根据本发明的润肤剂可以是本领域普通技术人员熟知的任何类型，例如石蜡、硅、聚二甲基硅氧烷、花生四烯醇、鲸蜡醇、硬脂醇、cearyl alcohol、棕榈甘油酯、矿物油、凡士林、油酸、亚油酸乙酯、甘油酯衍生物、羊毛脂和甘油。

根据本发明的保湿剂可以是本领域普通技术人员熟知的任何类型，例如霜剂、膏剂和洗剂。

药物组合物

如本文所述，“药学上可接受的载体或赋形剂”是指适合于药物组合物的任何材料。优选地，根据本发明的药学上可接受的载体或赋形剂适合于局部施用。

优选地，本发明的药学上可接受的载体或赋形剂包括但不限于本领域普通技术人员已知的任何标准载体或赋形剂，例如水、甘油、醇、油乳液、水乳液、缓冲盐水溶液、防腐剂、稳定剂和润湿剂。

非治疗用途

如本文所述，根据本发明的“皮肤干燥”是指非病理性干燥皮肤。根据本发明的皮肤干燥优选与红色斑块、干式斑块、可见干燥纹、皮肤变色、结痂、浅表烧伤、皮肤紧绷感和皮肤刺激相关。

本发明的供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂可以是本领域普通技术人员已知的任何类型。本发明的供皮肤干燥的美容治疗用的美容剂优选选自保湿剂、润肤剂、低过敏性润肤剂、膏剂、无皂产品、皮肤凝胶剂和皮肤棒。

如本文所述，“美容学可接受的载体或赋形剂”是指适合于美容组合物的任何材料。优选地，美容学可接受的载体或赋形剂适合于局部施用。

根据本发明的美容学可接受的载体或赋形剂包括但不限于本领域普通技术人员已知的任何标准美容学载体或赋形剂，例如水、植物油、矿物油、脂肪酸醇和天然蜡。

通过以下非限制性附图和实施例进一步描述本发明。

附图说明

图1A和1B

图1A和1B表示在同时治疗中，由角质形成细胞分泌CCL26(图1A)和TSLP(图1B)的水平(纵轴pg/ml)。该实验在低炎症状况下进行。与对照(阴影条)相比，已经在10μΜ、100μΜ和500μΜ下测试地塞米松(黑色条)。

图2

图2表示在同时治疗中，由角质形成细胞分泌CCL26的水平(纵轴pg/ml)。该实验在低炎症状况下进行。与对照(灰色条)相比，来自各种牙龈成纤维细胞供体的两批条件培养基已经使用GF009(点线条)和GF010(阴影条)。已经在5X浓度下测试了两批条件培养基。

图3A、3B和3C

图3A、3B和3C表示在同时治疗中，由角质形成细胞分泌CCL26(图3A)、TSLP(图3B)和IL-1β(图3C)的水平(纵轴pg/ml)。该实验在高炎症状况下进行。与对照(灰色条)相比，来自各种牙龈成纤维细胞供体的两批条件培养基已经使用GF009(点线条)和GF010(阴影条)。已经在5X浓度下测试了两批条件培养基。

图4A和4B

图4A和4B表示在延迟治疗中，由角质形成细胞分泌CCL26的水平(纵轴pg/ml)。该实验在低炎症状况下进行。与对照(灰色条)相比，来自各种牙龈成纤维细胞供体的两批条件培养基已经使用GF009(点线条)和GF015(阴影条)。已经以两种不同的浓度测试了两批条件培养基：5X和50X，并在第2天(图4A)和第5天(图4B)收集。

具体实施方式

实施例

A.材料和方法

1.人类牙龈成纤维细胞

1.1.培养细胞

人类牙龈成纤维细胞(GF)获自健康供体。在牙龈活检的酶促解离(胶原酶、分散酶)后，在血小板裂解物存在的条件下在无血清的培养基中培养牙龈成纤维细胞(Doucet等,(2005)J Cell Physiol.(细胞生理学杂志)205:228-36)。

1.2.牙龈成纤维细胞条件培养基的制备

弃去汇合GF的培养基。冲洗(PBS)后，加入新鲜培养基(不含血小板裂解物并且不含抗生素)。将细胞在37℃下温育24小时。收集条件培养基(CM)，等分并储存在-80℃下。这些步骤可以用不同的传代细胞进行。

1.3.CM的浓度

将培养基在浓缩膜(Millipore,Amicon 3K)上离心，然后储存在-80℃下。

2.人类角质形成细胞

从健康供体的乳房再造获得角质形成细胞。为了扩增，将细胞接种到合适培养基中的被辐照饲养细胞中。

3.方案

3.1.炎症诱发

使用处于2种不同浓度下的相同的促炎剂组合(IL-4、IL-13、TNFα、聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyl:C))：

-低浓度：IL-4 10ng/ml，IL-13 10ng/ml，TNFα5ng/ml，polyl:C 5μg/ml；

-高浓度：IL-4 100ng/ml，IL-13 100ng/ml，TNFα20ng/ml，polyl:C 10μg/ml。

3.2.抗炎治疗

3.2.1.参考产品

地塞米松(100μΜ至500μΜ)(Sigma Aldrich)

3.2.2.牙龈成纤维细胞条件培养基

将牙龈成纤维细胞条件培养基浓缩，在最终浓度5X至50X下使用。已使用来自各种牙龈成纤维细胞供体的三批条件培养基(GF009、GF010和GF015)。

3.3.优化治疗时间

对于CM的功效测试，将角质形成细胞在没有饲养细胞的情况下接种在6孔板中，使用的培养基适合于不含饲养细胞的细胞培养物(KSFM培养基，Gibco)。

4.测试程序

4.1.炎症诱发的同时治疗

当角质形成细胞培养物达到汇合时，角质形成细胞的培养基被含有促炎剂的培养基(第0天)和抗炎治疗(参考产品或牙龈成纤维细胞条件培养基)替换。在第1天收集培养基并储存在-80℃直至分析。

4.2.炎症诱发的延迟治疗

当角质形成细胞培养物达到汇合时，角质形成细胞的培养基被含有促炎剂的培养基替换(第0天)。第1天，将牙龈成纤维细胞条件培养基直接加入到含有促炎细胞因子的培养基中。在第2天或第5天收集培养基并储存在-80℃下直至分析。

4.3.分析

通过测量培养基中的炎性细胞因子水平来确定角质形成细胞的炎症状况。所研究的细胞因子是CCL26、TSLP和IL-1β。用ELISA测定法(Duoset试剂盒，R&D system)定量这些细胞因子。

B.结果

本实施例是基于特应性皮炎的体外模型，其包括：

(i)角质形成细胞生长直至它们达到汇合，

(ii)使用已知参与特应性皮炎诱发的促炎剂(包括Polyl:C、肿瘤坏死因子(TNF-β)、IL-4和IL-13)的混合液刺激它们(Castex-Rizzi等,(2014)British Journal of Dermatology(英国皮肤病学杂志)170(增刊S1):12-18；Le等,(2009)Allergy(过敏症)64:1226-1235)，以及(iii)在存在或不存在牙龈成纤维细胞(GF)条件培养基的条件下，确定已知待参与特应性皮炎的发病机制的炎性细胞因子/趋化因子(TSLP、CCL26和IL-1β)的水平(Castex-Rizzi等,同上；Le等,同上；Cianferoni等,同上；Kagami等,同上；Sera等,同上)。

1.参考产品的抗炎作用(同时治疗)

图1A-1B中呈现的结果显示地塞米松抑制CCL26(图1A)和TSLP(图1B)的分泌。

因此该模型是相关的，并且地塞米松可以用作参考产品来评估牙龈成纤维细胞条件培养基抑制促炎细胞因子分泌的功效。

2.牙龈成纤维细胞条件培养液的抗炎作用(同时治疗)

2.1.用低浓度的致炎因子诱发炎症

图2中呈现的结果显示，经测试的两批牙龈成纤维细胞条件培养基(GF009和GF010)在5X浓度下抑制炎性角质形成细胞分泌CCL26。关于TSLP和IL-1β的分泌，获得类似结果。

2.2.用高浓度的致炎因子诱发炎症

图3A-3C显示牙龈成纤维细胞条件培养基抑制CCL26(图3A)、TSLP(图3B)和IL-1β(图3C)的分泌。

2.3.结论

牙龈成纤维细胞条件培养基对暴露于炎症状况下的角质形成细胞分泌炎性细胞因子CCL26、TSLP和IL-1β具有抑制作用，即使在高度炎症状况下也是如此。

3.牙龈成纤维细胞条件培养基的抗炎作用(延迟治疗)

3.1.炎症诱发

当在第2天(图4A)和第5天(图4B)收集时，经测试的两批牙龈成纤维细胞条件培养基(GF009和GF010)在5X或50X浓度下抑制炎性角质形成细胞分泌炎性细胞因子CCL26。

3.2.结论

牙龈成纤维细胞条件培养基对暴露于炎症状况下的角质形成细胞分泌炎性细胞因子具有长期抑制作用，即使在通过条件培养基处理角质形成细胞之前建立炎症状况24小时时。