一种智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒及其制备方法。

背景技术：

糖尿病是一组以高血糖为特征的重大慢性代谢性疾病，人体内胰岛素相对不足或绝对不足导致高血糖是发生糖尿病的重要原因。目前糖尿病已成为危害人类健康的第三大因素。据统计2016年全球有4.2亿糖尿病患者，中国是糖尿病患者最多的国家。

实时监测体内血糖浓度、并适时注射胰岛素是有效控制糖尿病的关键。目前，绝大多数糖尿病患者采用胰岛素治疗，即采用注射或口服的方式摄入胰岛素，起到调节血糖的作用。其具体治疗方式是，先进行血糖浓度监测，再根据情况注射胰岛素。然而，传统的血糖检测需要扎针采取手指血液，反复刺针采血给患者造成极大痛苦。目前胰岛素的主要给药方式是利用注射器或胰岛素笔进行皮下注射。长期频繁的皮下胰岛素注射，给患者带来严重的心理压力，影响其生活质量。同时，如果无法精确控制注射的剂量，容易造成高血糖或低血糖，从而诱发严重的并发症，或者是患者体内血糖浓度过低危害生命健康。并且采用这种方式治疗的患者往往要日复一日年复一年的每天定时注射或口服胰岛素。为了减少糖尿病患者的痛苦，一种可以根据血液中葡萄糖浓度(血糖浓度)而释放胰岛素的药物亟待开发。

因此研制有效的、能根据体内血糖浓度做出响应的智能胰岛素递释系统是治疗糖尿病的关键，近年来已成为糖尿病治疗领域的研究热点。

本发明使用金纳米簇颗粒作为高效的药物载体材料，选择苯硼酸及其衍生物作为葡萄糖响应释放胰岛素的敏感开关，来制备基于金纳米簇的苯硼酸响应纳米颗粒，实现血糖响应的胰岛素释递。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒，该金纳米簇颗粒能够根据葡萄糖浓度响应控释胰岛素；本发明的目的还在于提供所述金纳米簇颗粒的制备方法。本发明采用金纳米簇颗粒作为高效的药物载体材料，选择不同的苯硼酸或其衍生物分子作为葡萄糖响应释放胰岛素的敏感开关因子，来制备基于金纳米簇的响应纳米颗粒，实现血糖响应的胰岛素释递体系。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒，包括载体材料、葡萄糖响应的敏感开关因子、药物分子。所述载体材料表面接枝修饰葡萄糖响应的敏感开关因子，所述葡萄糖响应的敏感开关因子表面接枝药物分子。其中，所述载体材料为表面富含氨基的金纳米簇颗粒；所述葡萄糖响应的敏感开关因子为苯硼酸或其衍生物，优选为4-羧基苯硼酸(pba)或4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)；所述药物分子为糖基化胰岛素。

所述智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒的制备方法，包括如下步骤：首先利用氯金酸、谷胱甘肽、crrrrrrrrr(cr9)多肽反应制备表面富含氨基的金纳米簇颗粒，作为药物分子的载体材料。然后在其表面接枝修饰4-羧基苯硼酸(pba)或4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)分子，作为葡萄糖响应的敏感开关因子。随后在其表面接枝上糖基化胰岛素，形成根据葡萄糖浓度响应控释胰岛素的金纳米簇颗粒，即本发明智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒。

优选的，所述智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备表面富含氨基的金纳米簇颗粒(gncs)

含haucl4、gsh和cr9的混合溶液在65-75℃反应，得到表面富含氨基的金纳米簇颗粒(gncs)。

(2)pba或fpba接枝到gncs上

1)活化4-羧基苯硼酸(pba)或4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)上的-cooh：在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和吗啉乙磺酸(mes)的混合液中加入pba或fpba进行反应，活化pba或fpba上的羧基cooh。

2)将羧基活化后的pba或fpba接枝到gncs上：将活化后的pba或fpba加入到表面富含氨基的gncs颗粒的溶液中，进行反应，得到金纳米簇-苯硼酸纳米颗粒gnc-pba或gnc-fpba。该步骤的反应是利用氨基和羧基间的特异性缩合反应。

(3)gnc-pba或gnc-fpba上接枝糖基化胰岛素

将糖基化胰岛素加入到gnc-pba或gnc-fpba溶液中，进行反应，得到金纳米簇-苯硼酸-胰岛素纳米颗粒gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin，即本发明智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒。该步骤中糖基化胰岛素与pba或fpba的带电荷形式反应，形成可逆的环酯。

更优选的，所述智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备表面富含氨基的金纳米簇颗粒(gncs)

将含haucl4、gsh和cr9的混合溶液加热至65-75℃(优选为70℃)，以450-550rpm(优选为500rmp)的转速搅拌22-26h(优选为24h)，得到表面富含氨基的金纳米簇颗粒(gncs)。

(2)pba或fpba接枝到gncs上

1)活化4-羧基苯硼酸(pba)或4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)上的-cooh：在1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和吗啉乙磺酸(mes)的混合液中加入pba或fpba，在15-35℃(优选为25℃)，下搅拌15-30min，活化pba或fpba上的羧基cooh。

2)将羧基活化后的pba或fpba接枝到gncs上：将活化后的pba或fpba加入到表面富含氨基的gncs颗粒的溶液中，15-35℃(优选为25℃)反应14-16小时(优选为15小时)，利用氨基和羧基间的特异性缩合反应，得到金纳米簇-苯硼酸纳米颗粒gnc-pba或gnc-fpba。

(3)gnc-pba或gnc-fpba上接枝糖基化胰岛素

将糖基化胰岛素加入到gnc-pba或gnc-fpba溶液中，在15-35℃(优选为25℃)下搅拌22-26h(优选为24h)，糖基化胰岛素可以与pba或fpba的带电荷形式反应，形成可逆的环酯，得到金纳米簇-苯硼酸-胰岛素纳米颗粒gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin，即本发明智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒。

所述智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒在制备糖尿病治疗药物中的应用。

本发明的智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒在高浓度的葡萄糖溶液中，葡萄糖与糖基化胰岛素竞争苯硼酸上的结合位点，将胰岛素从纳米颗粒上取代下来，释放出胰岛素，降低葡萄糖浓度。本发明能够根据葡萄糖浓度响应而释放出胰岛素、调控葡萄糖浓度，进而使得血糖恢复到正常水平。

本发明具有如下优点和有益效果：采用金纳米簇作为药物载体具有超高的载药率；以苯硼酸及其衍生物作为敏感开关因子，可实现根据葡萄糖浓度响应释放胰岛素、调节血糖的目的，达到可控降低糖尿病中高血糖的效果。制备方法简单，反应条件十分温和(常温，常压，水相)，极大地保护了药物的活性。

附图说明

图1是金纳米簇颗粒(gncs)的合成示意图。

图2是金纳米簇颗粒(gncs)溶液图，溶液为淡黄色。

图3是金纳米簇颗粒(gncs)的tem图，gncs直径为2.6±0.5nm。

图4是智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒的制备过程及其释放原理示意图；(a)以4-羧基苯硼酸(pba)为响应敏感因子，(b)以4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)为响应敏感因子。

图5是智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒在不同浓度(3.7mm、14.8mm)的葡萄糖溶液中的调节结果图，图中阴影部分代表人体正常的血糖范围。

图6是智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒在不同浓度(3.7mm、14.8mm)的葡萄糖溶液中的降糖结果图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1制备智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒

(1)制备表面富含氨基的金纳米簇颗粒(gncs)

在通风厨内，用王水清洗待用的磁子和圆底烧瓶，再用水和酒精清洗，烘干待用。

将氯金酸(haucl4)溶液、l-还原型谷胱甘肽(gsh)以及cr9溶液加入到预热70℃的水中，总体积为20ml，氯金酸、l-还原型谷胱甘肽、cr9的终浓度分别为4mm、6mm、3mm。在70℃恒温油浴加热的条件下，用磁力搅拌器以500rpm的转速搅拌24h，避光反应，使之充分反应形成金纳米簇颗粒(图1)。

将反应得到的产物放入分子截留量为3kd的超滤离心管中进行离心，在常温下以6000rpm转速离心20分钟，弃上清，加水，混匀，再离心2次，如此去除未反应的化学试剂，最后配成20ml溶液(-nh2终浓度为21mm)，得到淡黄色的gncs颗粒溶液(图2)。

用透色电子显微镜透射电子显微镜(tem，型号tecnaig220s-twin)观察gncs颗粒的大小和形貌(图3)。从tem照片分析得到gncs直径为2.6±0.5nm。

(2)活化4-羧基苯硼酸(pba)或4-羧基3-氟苯硼酸(fpba)上的-cooh

称取0.0575g1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(edc，40mm)、0.01726gn-羟基琥珀酰亚胺(nhs，20mm)和0.029286g吗啉乙磺酸(mes，20mm)，加入到7.5ml水中，搅拌至完全溶解，形成活化液，待用。

称取0.00829g4-羧基苯硼酸(pba，20mm)或0.00919g4-羧基-3-氟苯硼酸(fpba，20mm)，分别加入2.5ml水，搅拌至完全溶解，待用。

取10ml棕色玻璃试剂瓶1只，依次用酒精和去离子水清洗，烘干待用。取2.5ml上述活化液和2.5ml4-羧基苯硼酸溶液(pba)于棕色试剂瓶内，常温下以500rpm转速搅拌15-30min进行反应，使pba上的羧基活化(图4a-①)，准备与gncs上的氨基反应。

以同样的方式，将4-羧基3-氟苯硼酸fpba上的羧基活化(图4b-①)，准备与gncs上的氨基反应。

(3)活化后的pba或fpba接枝到gncs上

取5ml(2)中活化后的pba(活化的羧基浓度为10mm)，加入到2.38ml(1)中制备的gncs溶液(氨基浓度为21mm)中，即最终的氨基和活化羧基的摩尔浓度比为1:1，常温下以800rpm搅拌，避光反应15h，将活化的pba接枝到gncs上，反应原理见图4a-②。将反应后的溶液用分子截留量为3kd的超滤离心管中进行离心，在常温下以6000rpm转速离心20分钟，弃上清，加水，混匀，再离心2次，如此去除未反应的化学试剂。得到的产物命名为gnc-pba。

以同样的方式，将活化的fpba接枝到gncs上，得到gnc-fpba(图4b-②)。

(4)gnc-pba或gnc-fpba上接枝糖基化胰岛素

糖基化胰岛素根据文献合成所得(shiinod,kataokak,koyamay,yokoyamam,okanot,sakuraiy.aself-regulatedinsulindeliverysystemusingboronicacidgel.jintellmatersyststruct.1994；5:311-4.)。

将上述gnc-pba溶液浓缩至1.66ml，使得gnc-pba的pba端基浓度为30mm。称量0.0374g糖基化胰岛素(mw7513g/mol)溶解到1.66mlph＝2的稀盐酸溶液中(糖基化胰岛素浓度为3mm)。将上述两种溶液以体积比1:1混合(确保糖基化胰岛素完全反应)，常温下以800rpm搅拌，避光反应24h，将糖基化胰岛素接枝到gnc-pba上，得到gnc-pba-insulin(反应原理见图4a-③)。溶液中接枝的胰岛素浓度为1.5mm，体积为3.32ml。

以同样的方式，将糖基化胰岛素接枝到gnc-fpba上，得到gnc-fpba-insulin(图4b-③)。

所得到的gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin即为本发明智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒。

(5)gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin对葡萄糖浓度响应释放胰岛素的效果评价分别配制高浓度(22.22mm)和低浓度(5.55mm)葡萄糖溶液各10ml，待用。

设计实验，检验所制备的智能释放胰岛素调节血糖的金纳米簇颗粒对葡萄糖浓度的调节变化。取8只干净的容量为1.5ml的离心管，并编号为1、2、3、4、5、6、7、8号，其中分别加入：

1号：1ml低浓度葡萄糖溶液+0.5mlgnc-pba-insulin溶液；

2号：1ml低浓度葡萄糖溶液+0.5mlgnc-fpba-insulin溶液；

3号：1ml低浓度葡萄糖溶液+0.5mlinsulin溶液(ph＝2，1.5mm)；

4号：1ml低浓度葡萄糖溶液+0.5mlh2o；

5号：1ml高浓度葡萄糖溶液+0.5mlgnc-pba-insulin溶液；

6号：1ml高浓度葡萄糖溶液+0.5mlgnc-fpba-insulin溶液；

7号：1ml高浓度葡萄糖溶液+0.5mlinsulin溶液(ph＝2，1.5mm)；

8号：1ml高浓度葡萄糖溶液+0.5mlh2o。

测试葡萄糖溶液的最终浓度，分析金纳米簇颗粒随葡萄糖浓度响应释放胰岛素的能力(原理见图4-④)。

其中，1-4号溶液中的葡萄糖浓度为3.7mm，5-8号的葡萄糖浓度为14.8mm。以4号作为对照，评价在低浓度葡萄糖溶液中(3.7mm)，不同的纳米颗粒(1-3号)释放胰岛素的效果及降低血糖的能力。以8号作为对照，评价在高浓度葡萄糖溶液中(14.8mm)，不同的纳米颗粒(5-7号)释放胰岛素的效果、及降低血糖的能力。

溶液中葡萄糖浓度的监测：打开血糖仪开关，将血糖试纸插入到血糖仪中，将血糖试纸的采样端浸入到待测溶液中，等待10秒，读数，记录数据，每个样品分别记录三次数据、并取平均值。

检测结果见图5、6。在低浓度葡萄糖溶液中，低浓度的葡萄糖很难将糖基化胰岛素从gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin纳米颗粒上取代下来，金纳米簇颗粒不发挥降糖作用(图5，图6)；在且仅在高浓度葡萄糖溶液中(模拟糖尿病中高血糖)，高浓度的葡萄糖与糖基化胰岛素竞争结合位点，将糖基化胰岛素从gnc-pba-insulin或gnc-fpba-insulin纳米颗粒上取代下来。一方面，葡萄糖以结合物的形式存在，降低了游离的葡萄糖的浓度；另一方面，被取代释放下来的胰岛素能进一步降低游离葡萄糖的浓度。因此，在高浓度的葡萄糖溶液中，合成的纳米颗粒能发挥出色的降糖作用(图5，图6)，将葡萄糖浓度降低到正常血糖的范围内(图5)。相较之下，游离的胰岛素的使用，由于胰岛素的降糖过程不可控，可能导致低血糖事件的发生(图5左)。

从数据上看，gnc-fpba-insulin比gnc-pba-insulin纳米颗粒的降糖效果更优异(图5，图6)。相对于pba分子，fpba分子的侧基上引入氟(图4左)，影响pba末端带电形式的电子结构的重排，影响糖基化胰岛素和葡萄糖的竞争结合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。