本发明属于材料科学和生物医药领域，涉及一种硼酸类纳米药物复合物及其制备方法和应用。
背景技术：
天然多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，包括苯酚酸和黄酮类化合物，可直接食用和饮用。这种多酚类化合物的分子结构中有若干个酚羟基，多项体内外实验证明这类多酚化合物有显著的清除体内自由基、抗氧化、防紫外线、抗肥胖、预防心血管疾病、抗炎症、预防及治疗癌症的功效，常用于保健品或化妆品里的添加物。
硼替佐米(bortezomib，btz)作为一种新型的蛋白酶体抑制剂，已被用于多发性骨髓瘤的治疗中。它通过对肿瘤微环境的影响，提高内质网应激的程度进而引发肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤的目的。然而，硼替佐米在治疗固体瘤，甚至是骨髓瘤时效果并不明显，另外约百分之四十的肿瘤患者对硼替佐米敏感。硼替佐米在全身给药时也会带来周围神经病变、血小板减少和心脏毒性等副作用。部分患者在治疗时甚至会对硼替佐米产生耐药性。这些问题极大地限制了硼替佐米在生物医学和临床基因治疗领域的使用。
利用纳米载体递送抗癌药物作为一种通行策略已经被广泛的应用于肿瘤治疗中。它基于纳米载体优良的属性，将抗癌药物按需递送到特定的作用位点，进而发挥抗癌作用。其特点在于精准靶向，避免了化疗带来的低效、非特异治疗和较强的副作用。
然而，现今大多数的纳米递送载体本身并无治疗效果。由于部分载体载药率低下，难降解，新陈代谢缓慢，排泄困难等因素会产生严重的肾脏及其他器官的毒性和炎症反应。提高载药率和降低载体毒性仍然是纳米药物递送中亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提出一种可示踪的硼酸类纳米药物复合物，其组成成分包含天然多酚、硼酸类药物和铁离子。本发明可示踪的硼酸类纳米药物复合物可用于肿瘤示踪和肿瘤治疗等用途。
本发明所述纳米药物复合物中，所述天然多酚选自黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类植物提取物中的至少一种或多种。
其中，所述天然多酚选自表没食子儿茶素没食子酸酯、单宁酸、表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、1,2,3,6-四没食子酰葡萄糖、1,3,6-三没食子酰葡萄糖、原花青素、花青素、鞣花酸、咖啡酸中的至少一种或几种。
优选地，所述天然多酚为单宁酸、儿茶素、表没食子儿茶素或原花青素。
本发明所述纳米药物复合物中，所述硼酸类药物包括硼替佐米。还包括埃沙佐米、cep-18870。优选地，所述硼酸类抗癌药物为硼替佐米。
进一步优选地，所述硼酸类药物包括式(i)、式(ii)、式(iii)、式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)和式(ix)化合物中之任意一种或两种以上：
本发明所述纳米药物复合物中，所述铁离子为含fe3+的强电解质水溶性盐。优选地，所述铁离子来源于六水合三氯化铁、硫酸铁、硝酸铁等含fe3+的强电解质水溶性盐中的一种或几种。
本发明还提出了一种所述可示踪的硼酸类纳米药物复合物的制备方法，其包括如下步骤：在有机溶液中，先将硼酸类药物和天然多酚混合，再将前述得到的复合物与铁离子混合，得到含有硼酸类药物、天然多酚和铁离子的所述可示踪的硼酸类纳米药物复合物。
本发明制备方法中，所述硼酸类药物、所述天然多酚、所述铁离子的用量质量比为1:(0.5～0.9):(0.035～0.055)。
优选地，在有机溶液中，先将硼酸类药物硼替佐米和天然多酚单宁酸按照质量比为1:0.88混合得到复合物，再将前述由天然多酚单宁酸和硼酸类药物硼替佐米混合得到的复合物与铁离子按照质量比为1:0.03混合，得到本发明所述可示踪的硼酸类纳米药物复合物。
本发明还提出了所述可示踪的硼酸类纳米药物复合物在制备预防和/或治疗肿瘤、炎症等疾病的药物中的应用。
本发明还提出了一种用于肿瘤示踪的硼酸类纳米药物复合物在抗癌药物递送中的用途。其中，所述纳米药物两组分选自抗肿瘤药物、抗炎症药物和多种天然多酚类物质中的一种，具有良好的生物相容性。铁离子可以起到稳定体系和示踪作用。
本发明可示踪的纳米药物复合物的两组分选自抗肿瘤药物、抗炎症药物和多种天然多酚类物质中的一种，具有良好的生物相容性。铁离子可以起到示踪作用。本发明所述可示踪的纳米药物复合物含有硼替佐米和天然多酚作为纳米药物的两组分，并引入铁离子作为交联剂以提高载体在体内环境中的稳定性。硼酸键和临苯二酚键在弱碱性环境下能结合成稳定的硼酸酯键，但是该键遇酸极易水解。利用这一特点，本发明将含有硼酸基元的硼替佐米和含有临苯二酚基元的天然多酚分子在体外预先结合成为均一的纳米颗粒，同时引入具有成像功能的铁离子，利用铁离子与临苯二酚的配位作用使之在体内稳定，如图2。与传统纳米载药技术相比，本发明可示踪的纳米药物复合物可以将载药率提高至45～60％，显著提高了纳米载体递送时的治疗效果。且，另一组份天然多酚具有极高的生物相容性和显著的癌症治疗效率，降低了传统药物载体的副作用。且，铁离子的存在可以帮助提高组合物在血液运输时的稳定性，并具有肿瘤示踪效果。
本发明复合物的制备方法中，不引入其他化学试剂，合成简单，材料天然，生物安全性高，能高效安全地将硼酸类抗癌药物递送到肿瘤处，同时借助天然多酚良好的生物相容性保证纳米药物安全性，利用天然多酚自身的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用和铁离子的示踪作用，可以充分发挥此纳米药物在肿瘤等相关疾病治疗中的作用。可作为兼具高效、低毒、低成本等优点的抗癌药物递送策略，在多种原发性肿瘤疾病的治疗中具有良好的应用前景。
本发明提供一种可示踪的硼酸类纳米药物的普适性制备方法，主要成分包括硼酸类药物，天然多酚和铁离子。其中，天然多酚为植物提取物，含多个二酚/三酚结构，生物相容性好，还具有清除自由基，抗肿瘤、抗炎、抗氧化等性质。与单独的硼酸类药物相比，此纳米药物可以保证抗癌药物只在肿瘤部位发生作用，从而降低治疗副作用，具有更好的生物相容性。本发明中所述的纳米药物具有良好的治疗效率，并具有示踪能力。本发明中所述的纳米药物合成简单，安全，能够高效、安全地进行硼酸类药物递送，具有优秀的医用价值。
附图说明
图1中的a和b分别为实施例1中btz/ta和btz/ta/iron两种复合物在水溶液和磷酸缓冲液中的尺寸；
图2为实施例1中btz/ta/iron复合物在磷酸缓冲液中的形貌；
图3为实施例2中btz/ta/iron复合物随着时间推移，在磷酸缓冲液、10％胎牛血清和细胞培养基中的尺寸变化及图示；
图4中的a和b分别为实施例3中btz/ta/iron复合物在不同酸碱度下硼替佐米单体和单宁酸单体的释放规律；
图5为实施例4中mba-md-231细胞在与硼替佐米裸药和不同酸碱度下的btz/ta/iron复合物共培养时的存活率；
图6中的a和b分别为实施例5中btz/ta/iron复合物在小鼠体内0小时和24小时的t1成像；
图7为实施例6中btz/ta/iron复合物和对照组对小鼠皮下瘤的治疗效果；
图8为实施例6中btz/ta/iron复合物和对照组对小鼠体重的影响；
图9为实施例6中btz/ta/iron复合物和对照组在小鼠皮下瘤治疗过程中肿瘤体积变化情况；
图10为实施例6中小鼠注射btz/ta/iron复合物和对照组后血常规变化情况；
图11为实施例6中小鼠注射btz/ta/iron复合物后组织切片情况；
图12为实施例7中小鼠注射不同浓度btz/ta/iron复合物和对照组前后，骨肿瘤的荧光成像情况；
图13中的a和b分别为实施例7中小鼠注射不同浓度btz/ta/iron复合物和对照组前后，胫骨的micro-ct横截面和侧面图像；
图14为实施例7中小鼠注射不同浓度btz/ta/iron复合物和对照组前后，骨骼结构参数图，包括骨表面积、骨小梁数、骨体积和股小梁间距；
图15为中的a、b、c、d分别为实施例8中硼替佐米分别与儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸、单宁酸或原花青素复合形成纳米颗粒的尺寸及形貌。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1本实施例涉及btz/ta和btz/ta/iron两种复合物的尺寸对比和btz/ta/iron的形貌
将硼酸类纳米药物硼替佐米(btz)和天然多酚单宁酸(ta)在室温下于二甲基亚砜中混合(质量比1:0.88)，然后加入含有铁离子(fe3+)的水溶液中搅拌10s形成复合物。将复合物分别置于水溶液和磷酸缓冲液中，通过动态光散射和透射电镜观察复合物的尺寸和形貌。
实验结果：
如图1中的a、b所示分别为btz/ta和btz/ta/iron两种复合物在水溶液和磷酸缓冲液中的尺寸，图2所示为btz/ta/iron复合物在磷酸缓冲液中的电镜形貌，结果表明与btz/ta相比，添加铁离子的btz/ta/iron复合物能够在磷酸缓冲液中稳定存在且形貌均一。
实施例2本实施例涉及btz/ta/iron复合物在不同生理环境溶液中的稳定性情况。
将制备好的btz/ta/iron复合物分别置于磷酸缓冲液、10％胎牛血清和细胞培养基中，通过动态光散射观察其在不同生理条件下随时间推移的稳定性情况。
实验结果：
如图3所示为btz/ta/iron复合物随着时间推移，在磷酸缓冲液、10％胎牛血清和细胞培养基中的尺寸变化及图示，结果表明，随着时间推移，btz/ta/iron复合物都可以稳定存在于不同的生理环境中。
实施例3本实施例涉及btz/ta/iron复合物在不同酸碱度下硼替佐米组分和单宁酸组分的释放规律。
将透析好的btz/ta/iron复合物封装在透析袋中(截留分子量为3500)，置于不同酸碱度的磷酸缓冲液中，利用高效液相色谱仪定时检测磷酸缓冲液中各单体的含量(硼替佐米洗脱比例，甲醇：水＝7:3；单宁酸洗脱比例，4％乙酸：甲醇＝1:1)，进而绘制其释放曲线。
实验结果：
如图4中的a和b所示分别为btz/ta/iron复合物在不同酸碱度下硼替佐米单体和单宁酸单体的释放规律，结果表明，在酸碱度为7.4时，硼替佐米和单宁酸基本无释放，随着酸碱度接近肿瘤微环境(ph＝6.5)和内含体(ph＝5.0)时，两组分释放极具增大，表明复合物在正常生理环境下稳定，在肿瘤微环境和肿瘤细胞内释放药物。
实施例4本实施例涉及mba-md-231细胞在与硼替佐米裸药和不同酸碱度下的btz/ta/iron复合物共培养时的存活率。
将mba-md-231细胞与硼替佐米裸药和btz/ta/iron复合物(细胞培养基ph值分别调至7.4、6.5和5.0)孵育48小时，然后用细胞mtt测试法检测培养皿中活细胞比例。
实验结果：
如图5所示为mba-md-231细胞在与硼替佐米裸药和不同酸碱度下的btz/ta/iron复合物共培养时的存活率，结果表明，复合物在肿瘤酸性微环境下对癌细胞具有显著的抑制效果(600nm时高达26.7％)，在内含体微环境下与裸药硼替佐米效果持平，证明该复合物在体外具有良好的癌细胞抑制效果。
实施例5本实施例涉及btz/ta/iron复合物的体内成像情况。
将制备好的btz/ta/iron复合物通过尾静脉注射给小鼠(注射浓度为：2mg硼替佐米/kg老鼠)，分别检测小鼠在注射前和注射后24小时的t1成像。
实验结果：
如图6中的a和b分别为btz/ta/iron复合物在小鼠体内0小时和24小时的t1成像，由图可知通过尾静脉注射了复合物的小鼠肿瘤在24小时有明显t1增强，证明该复合物具有肿瘤示踪效果。
实施例6本实施例涉及btz/ta/iron复合物对小鼠皮下瘤的治疗效率和相关参数变化。
将特定浓度的btz/ta/iron复合物和对照组溶液通过尾静脉注射给皮下瘤模型小鼠(每2天注射1次，重复3次)，期间统计小鼠的体重、肿瘤体积等参数；注射结束后统计肿瘤大小、小鼠血常规等参数，并进行组织切片。
实验结果：
如图7所示，与对照组相比，btz/ta/iron复合物组的肿瘤大小明显更小，结果表明，此复合物可以有效抑制mba-md-231肿瘤的生长。
如图8所示，在治疗期间，btz/ta/iron复合物组的小鼠体重与生理盐水组持平，而注射裸药硼替佐米的小鼠体重明显下降，结果表明，此复合物具有极强的生物安全性。
如图9所示，在治疗期间，生理盐水组的小鼠肿瘤体积逐渐增长，裸药硼替佐米组也有一定幅度增长，只有btz/ta/iron复合物组的肿瘤体积被抑制，结果表明，此复合物可在治疗期间有效抑制mba-md-231肿瘤。
如图10所示，治疗完成后，btz/ta/iron复合物组的小鼠的四项血常规(baso#、lymph#、plt、wbc)都与生理盐水组持平，而裸药硼替佐米组的参数出现了大幅度的下降，结果表明，裸药注射硼替佐米会导致小鼠血常规紊乱，生物安全性差，而此复合物生物安全性高。
如图11所示，治疗完成后，btz/ta/iron复合物组的组织切片情况与生理盐水组类同，结果表明，此复合物不会对小鼠内脏造成损伤。
综上所述，btz/ta/iron复合物具有优秀的肿瘤抑制能力和极高的生物安全性。
实施例7本实施例涉及btz/ta/iron复合物对小鼠骨肿瘤的治疗效率和相关参数变化。
将特定浓度的btz/ta/iron复合物和对照组溶液通过尾静脉注射给骨肿瘤模型小鼠(每2天注射1次，重复3次)进行治疗，治疗结束后利用荧光成像技术测定骨肿瘤大小；利用micro-ct技术对骨组织进行三维重构，测定胫骨处骨组织的完整度并统计骨组织的相关参数；
实验结果：
如图12所示，与生理盐水组相比，适当浓度的btz/ta/iron复合物对骨肿瘤有明显抑制效果，裸药硼替佐米组的小鼠骨肿瘤明显变大，高浓度的硼替佐米会导致小鼠死亡，结果表明，此复合物可显著抑制骨肿瘤的发生，并具有良好的生物安全性。
图13中的a和b分别为实施例7中小鼠注射不同浓度btz/ta/iron复合物和对照组前后，胫骨的micro-ct横截面和侧面图像，由图13可知，对小鼠胫骨进行三维重构后可发现，生理盐水组和裸药硼替佐米组会导致胫骨横截面严重的碎骨侵蚀，侧面出现部分损毁，而btz/ta/iron复合物组胫骨横截面结构完整，侧面只有小的骨蚀孔，结果表明，此复合物可以帮助骨组织避免骨肿瘤带来的损伤。
如图14所示，生理盐水组和裸药硼替佐米组会导致骨组织的四项参数(骨体积、骨小梁间距、骨表面积和骨小梁数目)显著下降，而btz/ta/iron复合物组则是轻微减少，结果表明，此复合物可以帮助骨组织避免骨肿瘤带来的损伤。
实施例8本实施例涉及硼替佐米分别与儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸、单宁酸或原花青素复合形成纳米颗粒的尺寸及形貌。
如图15所示，其中，a、b、c、d分别为硼替佐米分别与儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸、单宁酸或原花青素复合形成纳米颗粒的尺寸及形貌，由图可知硼替佐米可与不同类型的天然多酚进行复合形成均一纳米颗粒。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。