本发明涉及化妆品原料领域，特别涉及一种化妆品用高活性糙米发酵原液的制备方法。
背景技术：
：我国是稻谷生产和消费大国，年产量已超过2亿吨，糙米不同于普通的精米是指稻谷未经过去颖壳，糙米不仅含有胚乳部分，还保留了在碾白过程中被除去的糠层，而糠层是稻谷中主要的营养成分富集处，其中含有较多的活性成分，如维生素、植物甾醇、酚酸、γ-氨基丁酸等，其中γ-氨基丁酸含量最高。γ-氨基丁酸是一种中枢神经系统中的抑制性神经递质，具有极其重要的生理功能，对人体皮肤具有良好的抗氧化、美白等功效作用，目前国内米类原料主要应用于食品领域，很少涉及到化妆品领域，而国外，特别是日本已上市的以米类作为化妆品原料的产品，如面霜、面膜等，都广受好评，因此开发米类特别是糙米类的化妆品原料具有非常重要的意义。糙米中众多的活性成分都是以结合态的形式存在于糙米中的，糙米外围被一层密度极高的粗纤维组织和糠蜡包裹，其吸水性和膨胀性很差，常规的方式制作米类提取物主要是将原料经糊化、糖化后，再加入稳定剂和乳化剂，用水浸提而成。此类方法不仅效率低，而且高温环境对大米的活性成分破坏严重，难以高效提取和保留，主要功效成分γ-氨基丁酸含量较低，大部分活性成分还存在于糙米中，然而市场上大多数米类提取物的原料产品以此法为主，如何使用温和手段使活性成分释放是能否成功利用糙米的关键，而通过微生物发酵正能满足这一需求。糙米的部分组织经发酵可使其结构简单的多糖类成分充分降解，为微生物提供生长所需碳源，同时糙米中以结合态形式存在于多糖上的活性物质被释放了出来，从而使发酵液具有功能活性。基于发酵代谢调控理论，采用酵母菌菌体细胞转化的方式不仅可以缩短发酵周期，同时通过添加辅酶能够高效提升活性成分γ-氨基丁酸的含量，此外酵母菌在生长过程中还会代谢其他多种活性产物，如多种小分子必须的氨基酸、甾醇、植酸、维生素等，营养密度和生理活性大幅度提高，因此糙米经过发酵后其营养物质得以进一步浓缩，其价值远远超过了糙米本身。迄今为止关于发酵糙米的研究众多，如中国专利cn104000266a公开了“一种大米发酵饮料的制备方法”，其特征在于将大米浸泡过筛糊化后加入酶解液酶解，再以乳酸菌发酵即得成品。其缺点乳酸菌发酵，终产品酸度较高，应用到食品领域中尚可，但是如果作为化妆品原料用到配方中，易对皮肤表皮造成损伤。中国专利cn104212698公开了“一种发酵糙米醋的制作方法”，将发芽糙米经酶解后，先利用酵母菌液态发酵再以醋酸菌液进行固态发酵，得到高营养活性发酵糙米醋。其缺点有（1）利用种子液发酵其发酵周期较长不宜放大，难以实现规模化生产；（2）利用两步发酵过程代谢难以精确控制发酵代谢途径，产品稳定性难以保证；（3）第二步发酵利用醋酸菌同样存在酸度过高的问题。中国专利cn1957752a公开了“一种糙米发酵提取物”，其中糙米经两次酵母菌发酵后获得发酵液，其缺点是第一步发酵不接种酵母，缺少发酵代谢控制，容易感染致病杂菌，安全性不能保证。中国专利cn1386423a公开了“一种大米发酵饮料及其制备方法”，将大米经糊化后接种微生物发酵1-5天后过滤灭菌得成品，其缺点是原料用去皮大米，米糠被浪费掉，另外其发酵产品的活性成分并没有涉及γ-氨基丁酸的含量，这与发酵菌种来源于市场购买，对γ-氨基丁酸没有转化能力有关；同时发酵周期较长，达5天。中国专利cn103705436公开了“一种发芽糙米草本护肤品及其制备方法”，糙米粉经糊化、酶解后再与草药精华液复配得成品，其缺点在于采用普通的提取法，活性成分的浸提率不高。综上所述，目前市场上的米类原料主要存在以下不足：1.原料主要来源是去皮的大米，而有着丰富的植物甾醇米糠被直接废弃掉。2.米类发酵原料主要应用于食品领域，化妆品领域涉及极少；3.多数米类发酵产品常采用食品领域评价手段仅从外观状态等物理特性为导向来评价发酵过程，而忽略了最为重要的以产品的活性成分为导向特别是γ-氨基丁酸含量来指导发酵过程，同时缺少产品功效数据，而这些是应用到化妆品领域十分重要因素；4.已有米类发酵专利缺少发酵中间控制，同时大都采用多步发酵，多步发酵的缺点是中间过程难以控制导致工艺难以放大，产品稳定性难以保证，另一方面，发酵周期普遍较长，效率不高。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种化妆品用糙米发酵原液的制备方法，该方法生产周期短、产品稳定，且活性物质含量高、安全健康符合化妆品原料的要求。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。一种化妆品用糙米发酵原液的制备方法，包括以下步骤：（1）糙米浸水催芽，然后烘干、粉碎为糙米粉；（2）糙米粉加水混为米浆，然后加入酶，酶解至终点，获得米浆酶解液；（3）将酵母细胞接种于含米浆酶解液的培养液中，加入辅酶，发酵至终点，获得发酵液；（4）发酵液除杂、除菌获得成品。所述步骤（1）中，浸水量为糙米质量的1.5-2倍，催芽时间为12h-24h。所述步骤（1）中，烘干温度为60℃-80℃，烘干时间为5h-10h。所述步骤（1）中，糙米粉水分含量为小于10%；细度为过80-200目筛。所述步骤（2）中，所述米浆中糙米粉的质量百分含量为5%-10%。所述步骤（2）中，酶的添加量为米浆质量的0.002%-0.2%。所述步骤（2）中，酶为淀粉酶和糖化酶，优选为α-淀粉酶和α-糖化酶。作为优选，酶活分别优选为100-150u/g和300-400u/g；两者比例优选为1:1-2。所述步骤（2）中，酶解温度为20℃-50℃，酶解时间为0.5h-3h。所述步骤（2）中，酶解终点为间隔0.5h的葡萄糖含量不再变化。所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法如dns法、斐林试剂法、间接碘量法以及旋光法等。所述步骤（3）中，培养液还含有氮源和无机盐。所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、豆饼粉。所述无机盐优选为磷酸氢二钾。所述步骤（3）中，酵母细胞的添加量为0.5-1%wt。所述步骤（3）中，酵母细胞通过以下方式获得：酵母菌种接种于含有碳源4-8%wt、氮源0.5-1%wt、无机盐0.1-0.5%wt的无菌种子培养液中，摇床转速150-200rpm，25℃-35℃下培养至对数生长期，离心后弃掉上清液获得。所述离心转速为8000-10000rpm，离心时间30min-120min。所述碳源为微生物培养常用碳源，如蔗糖、葡萄糖。所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、豆饼粉。所述无机盐优选为磷酸氢二钾。所述步骤（3）中，酵母菌选自化妆品领域可应用的安全菌种；优选为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），葡萄汁酵母（saccharomycesuvarum），红冬孢酵母（rhodospordiumspp.），啤酒酵母（saccharomycescerevisiaehansen），孢汉生酵母（hanseniasporaspp.），毕赤酵母（pichiaspp.）。所述步骤（3）中，发酵的温度为25℃-35℃；发酵时间为15h-20h。所述步骤（3）中，发酵过程中ph控制为5-5.5。作为优化，通过加入谷氨酸控制ph。所述步骤（3）中，发酵终点为发酵液中无葡萄糖。所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如dns法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等。步骤（3）中，所述辅酶为维生素及其衍生物；优选为烟酸、生物素、四氢叶酸或焦磷酸硫胺素中的一种或几种；添加量优选为0.0001-0.001%wt。所述步骤（4）中，除杂过程为发酵液1000-5000rpm离心除去沉淀。所述步骤（4）中，除菌过程为0.22μm孔径滤芯过滤除菌。一种采用上述制备方法获得的糙米发酵原液。所述糙米发酵原液的γ-氨基丁酸质量百分含量优选为0.15%-0.25%。一种上述糙米发酵原液在化妆品中的应用。所述糙米发酵原液在化妆品中具有抗氧化、美白和损伤修复功效。本发明具有以下优点：（1）本发明在发酵前对糙米采用催芽方式，可以将糙米中的营养物质进一步富集；（2）本发明对糙米进行酶解可初步将糙米中以结合态形式存在的营养物质转化为游离态，从而提高后续发酵效率，如将大分子淀粉降解为寡糖或单糖等；（3）本发明结合代谢调控手段在发酵过程中采用菌体细胞转化方式能够有效提高发酵效率，缩短发酵周期；（4）本发明在发酵过程中添加辅酶来提高酶活，进而使γ-氨基丁酸转化效率进一步提高；（5）本发明在发酵过程中通过补加谷氨酸来调节ph，一方面可使发酵过程控制在酶活的最适ph范围，另一方面能够显著提高γ-氨基丁酸产量。附图说明图1为不同样品中γ-氨基丁酸含量测定的hplc图谱；图2为促进细胞修复结果图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。称取100-150u/g的α-淀粉酶和300-400u/g的α-糖化酶分别配制成酶液，活力均为500u/ml，混合后供实施例与对比例中使用。α-淀粉酶和α-糖化酶均为市购。实施例1酵母菌鲜细胞制备从试管挑取孢汉生酵母菌种接种于500ml含有葡萄糖4-8%wt、蛋白胨0.5-1%wt、磷酸氢二钾0.1-0.5%wt的无菌种子培养液中，摇床转速150rpm，30℃下培养13h后，至对数生长期，再次接种扩培到5l种子培养基中，二次培养10h后至对数期，以10000rpm离心30min后弃掉上清液获得。实施例2（1）称取10kg糙米浸入20kg水催芽24h，然后60℃烘干10h、粉碎为全部过100目的糙米粉，水分为5.2%；（2）取步骤（1）中糙米粉8.5kg加100l水混为米浆，然后加入α-淀粉酶液和α-糖化酶液共100ml，酶解，每0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，获得米浆酶解液，其残糖含量为58.5g/l；（3）在上述米浆酶解液中添加5g/l豆饼粉做氮源，1g/l磷酸氢二钾作为培养液，将实施例1中的酵母菌菌体接入，同时添加1g生物素，中间补加谷氨酸粉末55g，使ph维持在5.0-5.5之间，30℃发酵20h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液；（4）发酵液以3000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤可得糙米发酵原液除杂、除菌获得相对密度为1.01的糙米发酵原液s1。实施例3（1）称取3kg糙米浸入4.5kg水催芽18h，然后80℃烘干5h、粉碎为全部过150目的糙米粉，水分为6.2%；（2）取步骤（1）中糙米粉2.2kg加30l水混为米浆，然后加入α-淀粉酶液α-糖化酶液共25ml，酶解，每0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，获得米浆酶解液，其残糖含量为63.1g/l；（3）在上述米浆酶解液中添加5g/l酵母粉做氮源，1g/l磷酸氢二钾作为培养液，将实施例1中的酵母菌菌体接入，同时添加0.3g烟酸，中间补加谷氨酸粉末15g，使ph维持在5.0-5.5之间，32℃发酵16h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液；（4）发酵液以5000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤可得糙米发酵原液除杂、除菌获得相对密度为1.01的糙米发酵原液s2。对比例1（1）称取精米1kg于80℃烘烤30min，充分烤干，水分为3.5%，碾磨式粉碎机对干燥后的精米充分粉碎，过40目筛后约860g制备成米粉；（2）加入约8.5l纯净水再加入α-淀粉酶，使其添加量为0.01%，90℃下反应10min，再加入α-糖化酶，使其添加量为0.05%，60℃下反应1h，再将水解液加热至100℃保持10min灭酶活处理，获得酶解液；（3）酶解液以5000rpm离心去除杂质后，上清液即为大米水解提取物c1。对比例2方法步骤同实施例2，不同在于，酵母发酵过程中没有添加辅酶，获得糙米发酵液c2。对比例3方法步骤同实施例2，不同在于，添加柠檬酸调节ph，获得糙米发酵液c3。实施例4理化性质检测1.氨基酸含量以实施例2中样品s1与对比例1中样品c1为实验样品，进行氨基酸含量测定，采用氨基酸自动分析仪进行，结果如表1所示。表1不同样品中氨基酸含量对比从表中可以看出，本发明制备的糙米发酵液s1中的小分子氨基酸含量明显高于传统提取法获得的样品c1。2.γ-氨基丁酸含量以实施例2中样品s1、实施例3中样品s2与对比例1中样品c1，对比例2中样品c2，对比例3中样品c3为实验样品，采用邻苯二甲醛柱前衍生法进行γ-氨基丁酸含量测定，hplc条件：色谱柱：hypersilodsc18，柱温：40℃；流动相：0.75%乙酸钠:乙腈（75:25），流速：1.0ml/min，检测波长：338nm；色谱图如图1所示，其中，a）为标准品（γ-氨基丁酸含量浓度为2g/l），b）为s1，c）为s2，d）为c1，e）为c2，f）为c3；结果如表2所示。表2常规发芽糙米提取法与发酵法γ-氨基丁酸含量比较s1s2c1c2c3含量（g/l）1.912.150.0510.410.54由表2数据可知，样品s1和s2中γ-氨基丁酸含量明显高于c1、c2、c3，由此表明采用本发明工艺方法所获得的产品中活性成分含量明显高于常规大米酶解方法中的活性成分，发酵中通过添加辅酶以及补加谷氨酸来调节ph可以有效提高产品中γ-氨基丁酸的含量。3.抗氧化活性分别精密量取dpph溶液5.0ml和不同浓度s1样品溶液5.0ml置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95%乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取dpph溶液5.0ml和纯化水5.0ml混合，操作同上。计算方法如下：清除率（%）=1-结果如表3所示。由表中数据可知，在添加0.5%-3%的浓度梯度下，样品s1具有较高的清除自由基的能力，3%浓度下可达49%，有较好的抗氧化性。表3清除dpph自由基活性原液浓度（%）0.5123清除率（%）101733494.美白效果细胞培养液：含10%fbs的1640培养液；naoh裂解液：用10%的dmso溶液配制浓度为0.1mol/l的裂解液；毛猴素溶液：用细胞培养液配制20μm的毛猴素溶液；样品溶液：用毛猴素溶液将糙米提取液配制成4%的母液，临用前稀释成目标浓度；mtt：用pbs配制mtt作用液，0.22µm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存备用。将b16细胞以1×105个/ml密度接种于6孔板，37℃、5%co2条件下培养24h。加入样品反应72h后，用naoh裂解液裂解细胞，80℃加热30min，酶标仪检测吸光度。同时在96孔板内接种相同体积密度的细胞作为增殖对照，考察样品对单位细胞内黑色素水平的影响。结果如表4所示。由表中数据可知，样品s1在1%-4%的浓度下具有较好的黑色素抑制率，在4%时达到80%左右，大部分黑色素均被抑制。表4糙米发酵提取液对单位细胞内黑色素水平的影响糙米浓度（%）单位细胞黑色素抑制率（%）1.034.462.068.054.080.835.促进细胞修复效果细胞培养液：含10%fbs的dmem培养液。样品溶液：用细胞培养液将糙米提取液配制成4%的母液。将hacat细胞以5×104个/ml的密度接种于24孔板，37℃、5%co2条件下培养24h。在接近融合的单层细胞上，用200µl枪头在24孔板的每个孔内垂直划线。弃去孔中液体，加入样品溶液（最终血清含量2.5%），继续培养24h、48h后拍照观察。结果如图2所示，其中，a为c1处理组初始，b为c1处理组24h，c为c1处理组48h，d为s1处理组初始，e为s1处理组24h，f为s1处理组48h。与c1相比，s1在浓度为4.0%时与受损细胞接触48h后能更好地促进细胞的迁移与自我修复，形态大部分完好，呈现长梭状。实施例5（1）称取5kg糙米浸入8.5kg水催芽20h，然后70℃烘干8h、粉碎为全部过200目的糙米粉，水分为5.7%；（2）取步骤（1）中5kg糙米粉加100l水混为米浆，然后加入α-淀粉酶液和α-糖化酶液共100ml，酶解，每0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，获得米浆酶解液，其残糖含量为59.4g/l；（3）在上述米浆酶解液中添加5g/l豆饼粉做氮源，1g/l磷酸氢二钾作为培养液，将实施例1中的酵母菌菌体接入，同时添加0.8g四氢叶酸，中间补加谷氨酸粉末38g，使ph维持在5.0-5.5之间，25℃发酵20h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液；（4）发酵液以1500rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤可得糙米发酵原液除杂、除菌获得糙米发酵原液，相对密度为1.01，其γ-氨基丁酸含量为1.71g/l。实施例6（1）称取6kg糙米浸入10kg水催芽12h，然后80℃烘干10h、粉碎为全部过100目的糙米粉，水分为5.0%；（2）取步骤（1）中糙米粉5kg加50l水混为米浆，然后加入α-淀粉酶液和α-糖化酶液共50ml，酶解，每0.5h测葡萄糖含量，至不再变化时，获得米浆酶解液，其残糖含量为64.8g/l；（3）在上述米浆酶解液中添加5g/l酵母粉做氮源，1g/l磷酸氢二钾作为培养液，将实施例1中的酵母菌菌体接入，同时添加0.5g焦磷酸硫胺素，中间补加谷氨酸粉末46g，使ph维持在5.0-5.5之间，35℃发酵15h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液；（4）发酵液以5000rpm离心去除杂质，上清液再以0.22μm聚醚砜滤芯过滤可得糙米发酵原液除杂、除菌获得糙米发酵原液，相对密度为1.02，其γ-氨基丁酸含量为1.98g/l。当前第1页12