本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种基于pamam树状分子负载胰岛素的纳米经皮制剂的制备及其在治疗糖尿病方面的应用。
背景技术：
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，已成为继心脑血管疾病和肿瘤之后危害人类健康的“第三杀手”。根据国际糖尿病联盟(idf)的报告，2017年全球糖尿病患者4.25亿人，其中中国糖尿病患病人数高达1.144亿人，患病人数高居世界第一，到2040年预计将增长到1.507亿人。对糖尿病患者来说一旦血糖长期控制不佳，很可能会导致严重的并发症：糖尿病视网膜病变将导致患者失明、糖尿病肾病将导致患者慢性肾功能衰竭等。2017年我国有130万人死于糖尿病及其并发症，糖尿病治疗刻不容缓。
纵观全球降糖药市场，前40大降糖药中，胰岛素（insulin）市在糖尿病用药中占据50%以上的市场份额。由此看出目前治疗糖尿病的药物中胰岛素仍是一线药物，是糖尿病患者中后期必须和不可替代的药物。目前胰岛素在治疗糖尿病领域中具有明显的降血糖效果，被广大人民群众所认可。胰岛素是胰岛β细胞分泌的一种多肽类激素，目前是机体内唯一能降低血糖的激素。人胰岛素分子依靠两个二硫键结合a链（21个氨基酸）与b链（30个氨基酸），如果二硫键被打开则失去活性。胰岛素分子量约为5807，等电点为5.35-5.45，在水中难溶。胰岛素制剂市场上有注射剂、肺部吸入给药制剂、植入剂、口服或口腔黏膜吸收给药制剂等。目前胰岛素的使用剂型仍是采用注射剂，这种通过肌肉注射的注射剂一般为白色或类白色的混悬液，静置后分层，振荡后沉淀均匀分散，制剂中使用了较大量的添加剂助悬，并且生物利用度较低。通过注射给药的途径降低血糖所带来的副作用却不容忽视。胰岛素长期注射部位会导致脂肪垫的形成，这种脂肪垫的存在，严重影响局部胰岛素的吸收使出现胰岛素抵抗导致药效降低。同时还会出现诸如水肿，局部淤青，皮肤感染等等问题。这些都是注射胰岛素在目前技术条件下出现不可避免的问题。
因此降低注射胰岛素所带来的副作用一直是药物研究的一大热点。通过将胰岛素纳米化可以大幅度提高其溶出速率，从而显著提高药物的生物利用度，减少个体差异，减低毒副作用。聚酰胺-胺（pamam）树状大分子是一类由中心向外对称发散并高度分枝的新型纳米生物材料，由于具有纳米尺度、高水溶性、单分散性以及结构可调性，可通过分子自组装形成大小适宜的纳米粒子，提高药物的生物相容性、生物利用度，因此可用做药物的输送载体。目前pamam的应用仍然是以药物载体为主，本发明采用pamam树状分子作为胰岛素的载体。此外，低代pamam的空间位阻效应远远小于高代pamam，这就为其末端修饰提供了便利。但pamam自身是不能成纳米胶束的，因此，利用疏水性药物与其偶联，使其具有两亲性特性，并进一步形成纳米胶束。从而能够在水性环境下形成稳定的纳米胶束结构。
为了克服注射胰岛素所带来的副作用，本发明通过添加一些辅料将所制得的胰岛素纳米颗粒制成经皮给药的制剂。经皮给药制剂为一种活性药物通过皮肤吸收进入全身血液循环而发生治疗作用的缓缓释制剂，经皮给药制剂由活性成分和载体构成，其透皮性能的优劣，除了活性成分的性能外，主要决定于用于负载活性成分的载体。
技术实现要素：
本发明的目的在于，克服由于皮下注射胰岛素所带来的副作用，包括胰岛素注射给病人带来的生理病痛、低血糖、长期注射形成脂肪垫等等。本发明制备了一种基于pamam树状分子负载胰岛素的纳米颗粒，旨在利用其缓释特性，能够延长药物作用时间，保证药物作用的前体下减少给药剂量，减轻或避免药物毒副作用。同时将胰岛素纳米颗粒装载于经皮给药系统中，使用更加方便。
本发明的第一个技术问题是提供了一种基于pamam树状分子负载胰岛素的纳米经皮制剂，其由背衬层、载药层和防粘层组成，载药层组分包括纳米化胰岛素、pamam树状分子、压敏胶、促渗剂、交联剂、抑菌剂和基质，载药层以凝胶形式被封闭于背衬层和防粘层之间；载药层纳米颗粒的粒径为150-200nm。
所述的纳米化胰岛素包括动物胰岛素、人胰岛素和胰岛素类似物。
所述的pamam树状分子为高代pamam树状分子或低代pamam树状分子。
所述亲水性辅料包括下列物质中的两种或两种以上：泊洛沙姆、海藻酸盐、阿拉伯胶、明胶、羧甲基纤维素、油酸、油酸钠和大豆卵磷脂；冻干保护剂包括甘露醇、乳糖、葡萄糖中的两种或两种以上。
所述的交联剂包括n,n-亚甲基双丙烯酰胺。
所述的基质包括聚维酮、聚乙二醇、海藻酸钠、阿拉伯胶、西黄蓍胶、琼脂、明胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚丙酸钠和卡波姆中的一种或两种。
所述的载药层压敏胶的材料为硅酮压敏胶、聚羟丙甲基纤维素压敏胶、丙烯酸压敏胶、聚丙烯酸酯压敏胶、聚异丁烯压敏胶、聚乙烯基吡咯烷酮压敏胶和聚羧甲基纤维素压敏胶中的一种或几种的组合。
所述的背衬材料是铝-聚酯膜、聚乙烯-铝-聚酯/乙烯-乙酸乙烯复合膜、聚乙烯（或聚酯）-聚乙烯复合膜、多层聚酯膜、聚酯-乙烯醋酸乙烯复合膜、无纺布、弹力布中一种或两种组合。
所述的防粘层材料硅化聚脂薄膜、氟聚合物涂聚酯薄膜、铝箔-硅纸复合物、硅化铝箔、硅纸中的一种或两种的组合。
所述的pamam树状分子胰岛素纳米经皮制剂，其剂型不仅限于贴剂，还可用于经皮的软膏剂、硬膏剂、巴布剂、涂剂、气雾剂、喷雾剂、泡沫剂和微型海绵剂及微针贴剂等剂型。
所述经皮促渗剂选自氮酮及其类似物、吡咯烷酮类、亚砜类、氨基酸及其酯、萜烯类、胺类、表面活性剂类、醇类和磷脂类中一种或几种，优选氮酮及其类似物、表面活性剂、醇类的一种或几种组合。其中各组分在载药层中的含量为下列范围：按重量分数计，氮酮及其类似物0-20%、表面活性剂0-20%、醇类0-40%。
本发明的第二个技术问题是提供了一种基于pamam树状分子负载胰岛素的纳米经皮制剂的制备方法，包括以下步骤：
a:将胰岛素原料药溶解于可与水共溶的有机溶剂中，配制成浓度为1-10mg/ml的原料药溶液，然后滴加入pamam水溶液，控制1滴/秒，室温下搅拌1h,，胰岛素溶液与pamam水溶液的体积比为1/5-1/20；
b:取5-6wt%促渗剂、5-6.5wt%基质、10wt%亲水性辅料、50wt%冻干保护剂、0.2wt%交联剂、5-8wt%压敏胶与a步骤中得到的pamam胰岛素纳米溶液，搅拌均匀即得载药层；
c:将b步骤中得到的载药层均匀的涂布在背衬层上，盖上保护层，检测合格后，抽真空密封，即得所述制剂。
其中a步骤中的有机溶剂为乙醇、丙二醇、丙三醇、丙酮、乙酸和苹果酸中的一种或几种。
本发明的优点在于
1、本发明制备的pamam树状分子胰岛素纳米缓释经皮制剂提高了药物的溶解度。
2、本发明制备的pamam树状分子胰岛素纳米缓释经皮制剂所载的药物颗粒为纳米级，可以提高药物缓释释放。
3、本发明制备的pamam树状分子胰岛素纳米缓释经皮制剂具有缓释的特性，同时制剂使用方便，具有易撤性，能够降低和减少患者的用药次数，避免由于注射给患者带来的生理和心理痛苦。
附图说明
图1是pamam树状分子胰岛素纳米的粒径分布图；
图2是pamam树状分子胰岛素纳米的电势分布图；
图3是pamam树状分子胰岛素纳米的原子力图像；
图4是pamam树状分子胰岛素纳米的释放；
图5是pamam树状分子胰岛素纳米的累积渗透率。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案作进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：
a：称取胰岛素55mg溶于5ml75%（v/v）乙醇中，形成含药的有机溶液；称取125mgpamam溶液溶于5ml水中；称取甘油0.1ml，羧甲基纤维素200mg，甘露醇1g，氮酮100mg，卡波姆5mg，聚丙烯酸酯压敏胶150mg，n,n-亚甲基双丙烯酰胺3mg。
b：将辅料甘油、羧甲基纤维素、甘露醇、氮酮、卡波姆、聚丙烯酸酯压敏胶、n,n-亚甲基双丙烯酰胺加入到pamam水溶液中，取5ml胰岛素乙醇溶液逐滴滴加到pamam水溶液中，在室温条件下搅拌1h，即得载药层。
c：将载药层均匀涂布在背衬层上，盖上保护层，检验合格，抽真空密封，即得。
实施例2
a：称取胰岛素55mg溶于5ml75%（v/v）乙醇中，形成含药的有机溶液；称取125mgpamam溶液溶于5ml水中；称取甘油0.1ml，羧甲基纤维素160mg，甘露醇1g，氮酮100mg，卡波姆5mg，聚丙烯酸酯压敏胶150mg，n,n-亚甲基双丙烯酰胺3mg。
b：将辅料甘油、羧甲基纤维素、甘露醇、氮酮、卡波姆、聚丙烯酸酯压敏胶、n,n-亚甲基双丙烯酰胺加入到pamam水溶液中，取5ml胰岛素乙醇溶液逐滴滴加到pamam水溶液中，在室温条件下搅拌1h，即得载药层。
c：将载药层均匀涂布在背衬层上，盖上保护层，检验合格，抽真空密封，即得。
实施例3
a：称取胰岛素55mg溶于5ml75%（v/v）乙醇中，形成含药的有机溶液；称取125mgpamam溶液溶于5ml水中；称取甘油0.1ml，羧甲基纤维素100mg，甘露醇1g，氮酮100mg，卡波姆5mg，聚丙烯酸酯压敏胶150mg，n,n-亚甲基双丙烯酰胺3mg。
b：将辅料甘油、羧甲基纤维素、甘露醇、氮酮、卡波姆、聚丙烯酸酯压敏胶、n,n-亚甲基双丙烯酰胺加入到pamam水溶液中，取5ml胰岛素乙醇溶液逐滴滴加到pamam水溶液中，在室温条件下搅拌1h，即得载药层。
c：将载药层均匀涂布在背衬层上，盖上保护层，检验合格，抽真空密封，即得。
实施例4
将1ml载药层置于截留分子量为10000的透析袋中，同时将透析袋置于ph为7.4的30mlpbs的磷酸盐缓冲溶液中，再将pbs缓冲溶液置于37℃恒温的摇床中，转速236r/min，在不同的时间点取样1ml，同时再补加1ml的空白pbs。采用紫外分光光度仪检测其在波长276nm的吸光度，计算累积量。
实施例5
制备12张完整的小鼠腹部皮肤，采用扩散池实验，根据公式计算渗透量
(q，μg.cm2)
式中，cn为第n个取样点测得的药物浓度；ci为第i个取样点测得的药物浓度；a为有效接触面积(cm2)；v为接收池体积(ml)；v0为取样体积(ml)。
以单位面积累计渗透量(q)为纵坐标，时间(t)为横坐标，绘制经皮吸收实验。
实施例6
称量实验小鼠的体重，按150mg/kg剂量进行经皮治疗，实验小鼠固定在木板上，除去腹部的毛后，紧贴pamam胰岛素纳米经皮制剂，每次面积为3cm2，经皮时间为30min，经皮给药结束后擦拭腹部，直接将小鼠放回笼子饲养。
经皮制剂的刺激性观察：实验小鼠经pamam胰岛素纳米经皮制剂治疗后，无明显的精神状态不正常现象，连续观察2天后，未发现经皮部位皮肤出现红肿和发炎等现象。
实施例7
体内降血糖的考察：将高血糖小鼠随机分为4组纳米经皮制剂高、中、低剂量组以及对照组，在给药后的1h,2h,4h,8h后，分别从眼眶取血，测定不同组别小鼠的血糖浓度。所测得的结果为见表1。
图1是pamam树状分子胰岛素纳米颗粒的粒径分布图，其平均粒径为165.1nm，pdi为0.256，分布较为均匀。
图2是pamam树状分子胰岛素纳米颗粒的电势分布图，其电势为-31mv.
图3是pamam树状分子胰岛素纳米颗粒的原子力图像，显示其形状为圆球状，分布较为均匀。
图4是pamam树状分子胰岛素纳米颗粒释放实验结果图，0-5h的释放较快，到第8h释放量超过了80%.
图5是用小鼠腹部皮肤进行体外经皮实验24h药物累积经皮量的结果图，前12h药物的释放量逐渐增加，12-24h时间段药物释放趋于平缓。
表1是一次给药后各组小鼠的血糖值随时间变化情况。