本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肿瘤在全球范围内有很高的发病率，预测在全球范围内肿瘤患者从2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，2035年将达到2400万，仅中国就新增307万癌症患者并造成约220万人死亡，分别占全球总量的21.9％和26.8％。如此严峻的形势下，全球的科学工作者都在研究治疗肿瘤的方法，尤其是寻找高效的抗肿瘤小分子靶向药物成为当今的研究热点。
akt的异常表达是导致肿瘤发生的重要分子靶点之一，抑制akt的活性，可以控制akt下游信号传递，阻断akt信号传导通路。akt的作用底物之一gsk-3β是细胞内多种信号转导通路的重要成分。研究发现，磷酸化的gsk-3β不仅在恶性肿瘤发生发展及侵袭转移中扮演着重要角色，而且还参与了肿瘤细胞化疗的耐药过程。akt在调节细胞存活和增殖中占有很重要的地位，在超过50％的人类肿瘤中均发现有高活性的akt，因此akt是当今研究抗肿瘤药物的一个重要的靶点。
目前，新研发的akt小分子肿瘤抑制剂并不多，大多是现有药物在药理学研究中被发现具有抑制akt活性而被开发用作akt的抑制剂，且结构多样，作用机制不尽相同，构效关系尚不明确。对此，本论文针对自主设计合成小分子样品库中的新吡嗪酮类小分子化合物进行分子模拟和体外筛选，将筛选出针对akt靶点的抑制物从细胞水平上进行作用机制的研究，并初步达到了预期的研究目标，从而为抗癌药物的研发提供了新线索。
技术实现要素：
本发明的目的是从新合成的吡嗪酮类小分子抑制剂库中筛选出一种有效的肿瘤抑制剂cotpaea，发现其具有显著抑制肿瘤细胞生长的作用。cotpaea可以靶向akt，阻断akt信号通路的传导，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。基于以上的发现，本发明的目的是提供吡嗪酮类肿瘤抑制剂cotpaea在抗肿瘤药物中的应用，进而为激酶抑制剂类的抗肿瘤小分子药物的研制和开发提供新的思路和机理。
本发明所述的吡嗪酮类小分子抑制剂为cotpaea，其化学结构式如下所示：
本发明所述的吡嗪酮类小分子抑制剂在制备抗肿瘤的药物中的应用，所述药物的活性成分为吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea，以及还包括药学上能接受的辅料或载体。
本发明开发的吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea，能够：
(1)显著的抑制宫颈癌细胞hela细胞、卵巢癌skov-3细胞和非小细胞肺癌a549细胞的增殖，浓度为50.0um时，这三种肿瘤细胞的存活率几乎为零；
(2)可与akt空间结构的活性部位中的3个氢键结合，分别是lys276、asn279和thr291，另外与akt底物gsk-3β有1个氢键结合位点是arg4；
(3)靶向于akt激酶，显著降低高表达akt的hela细胞内全蛋白磷酸化和gsk-3β的磷酸化水平，从而抑制与细胞存活相关的信号通路传导；
(4)可激活肿瘤细胞内凋亡相关蛋白caspase3、caspase8和caspase9，从而诱导hela细胞凋亡；
本发明的突出特点为：本发明的吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea能够靶向于akt激酶，具有良好的抗肿瘤活性。因此，本发明可用于制备抗肿瘤的药物，有望将其开发为新的抗肿瘤药物，并为激酶抑制剂类的抗肿瘤小分子药物的研制和开发提供新的思路和机理。
附图说明
图1：浓度为50.0um的吡嗪酮类小分子抑制剂处理hela、skov-3和a549细胞24h，细胞的存活率柱形图。(a)吡嗪酮类小分子抑制剂处理hela细胞24h，hela细胞存活率柱形图；(b)吡嗪酮类小分子抑制剂处理skov-3细胞24h，skov-3细胞存活率柱形图；(c)吡嗪酮类小分子抑制剂处理a549细胞24h，a549细胞存活率柱形图。横坐标表示51种吡嗪酮类小分子抑制剂，数字0为阴性对照，cotpaea和my-03-01分别是51种吡嗪酮类小分子抑制剂中的第三种和第七种吡嗪酮类小分子抑制剂，纵坐标为细胞的存活率。
图2：分子对接方法的可靠性验证：akt的原始配体anp重新对接到akt的受体位置的晶体结构模拟图。1代表akt的原始配体anp与akt对接模拟，2代表akt的原始配体anp重新与akt对接模拟。
图3：cotpaea与akt和gsk-3β之间表面和带状相互作用的模拟图。3代表akt，4代表gsk-3β，5代表cotpaea。
图4：cotpaea与akt和gsk-3β之间形成的氢键相互作用模拟图。6代表akt，7代表gsk-3β，8代表cotpaea，9代表cotpaea与akt和gsk-3β之间形成的氢键。
图5：分别用0.0(即control)、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4um的cotpaea处理hela细胞24h，dapi染色观察细胞染色质形态变化的荧光显微镜照片。
图6：分别用0.0(即control)、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4um的cotpaea处理hela细胞12、24、36h，流式细胞术检测细胞凋亡的散点图。
图7：akt质粒扩增的结果图。(a)akt质粒扩增的琼脂糖凝胶电泳图；(b)akt质粒线性化的琼脂糖凝胶电泳图。marker表示dnamarker，是分子量不同的dna片段，akt表示提取的akt质粒。
图8：akt在hela细胞内表达水平的westernblot图。control表示未转染akt基因的hela细胞，t-hela表示转染akt基因的hela细胞。
图9：cotpaea对t-hela细胞内p-tyr和p-gsk-3β表达水平影响的westernblot图。(a)浓度为0.8um的cotpaea处理t-hela细胞0min即control、10min、15min和30min，检测cotpaea对t-hela细胞内p-tyr表达水平影响的westernblot图；(b)浓度为0.8um的cotpaea处理t-hela细胞0min即control、10min、15min和30min，检测cotpaea对t-hela细胞内p-gsk-3β表达水平影响的westernblot图。
图10：cotpaea对hela细胞内caspase家族蛋白活性影响的柱形图。浓度为0um即control、0.8um的处理hela细胞24h，caspase活性检测试剂盒检测hela细胞内caspase3、caspase8、caspase9的活力变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1药品的配置
吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea(由沈阳药科大学宋宏瑞教授课题组合成)固体粉末用适量的二甲基亚砜(dmso)溶解，得到浓度为5mm的药物溶液，然后用dmem培养基(购自gibco公司)将药物浓度稀释100倍，得到50μm的药物溶液，然后以该浓度作为药物的初筛浓度。其他浓度均在该浓度的基础上用dmem培养基(购自gibco公司)进行更小浓度的稀释。
实施例2细胞的复苏、培养和传代
从液氮罐里取出保存有hela细胞的冻存管后，立即放入37℃盛有无菌蒸馏水的烧杯中，待冻存管里的细胞迅速融化后将细胞转移到离心管中，然后向离心管中加入10ml的dmem培养基(购自gibco公司)，轻轻混匀，转速1500rpm离心3min。弃掉离心后的上清，用1ml含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)将离心得到的细胞沉淀重悬，将其接种于含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)的直径为10cm的培养皿中，将培养皿放入37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中进行培养。当细胞生长至80％-90％的密度时，弃去原dmem培养基(购自gibco公司)，再用无菌的磷酸盐缓冲液即pbs洗涤两次，然后加入2ml胰酶，置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中消化2min。消化完成后向每个培养皿中加入3ml含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)终止胰酶消化，将贴壁细胞吹打散，并将细胞悬液转移到离心管中，1500rpm离心3min。用3ml的含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)重悬细胞沉淀，向每个10cm培养皿中加入1ml的细胞悬液，共三个培养皿，再向每个培养皿中补加9ml含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)，使培养皿的最终体积为10ml，最后将细胞置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中进行培养，获得贴壁的hela细胞。
实施例3吡嗪酮类小分子抑制剂抗癌活性的初步筛选
抗癌活性的检测是采用mtt的方法。
检测原理：mtt法又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。mtt可以被活细胞线粒体中含有的琥珀酸脱氢酶还原成紫色的甲瓒颗粒，这种颗粒是不能够溶于水的，但是死细胞的线粒体却不能够将其还原，dmso能溶解甲瓒颗粒，用酶标仪在492nm波长下测定其吸光值，即od值，可间接反映细胞数量。因而，我们可以通过该反应颜色的变化对细胞的生存以及死亡情况进行评价。
具体步骤：
(1)首先将实施例2得到的贴壁的细胞用胰酶消化后并收集，用血球计数板对细胞进行计数，按照5×103个/孔的数量接种于96孔板中。
(2)将上述96孔板置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养。
(3)待培养的细胞贴壁后，吸出孔里的原有的dmem培养基(购自gibco公司)，再向每孔中加入含有浓度为50.0um的吡嗪酮类小分子抑制剂的dmem培养基(购自gibco公司)，每孔200μl，做三组平行，同时设置阴性对照组即control组，control组即为细胞中只加入dmem培养基(购自gibco公司)，不含有吡嗪酮类小分子抑制剂。
(4)在37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养24h后，向每孔加入15μl的mtt溶液，在37℃避光条件下反应4h以后，弃上清，然后每孔加入150μl的dmso，放入到酶标仪中检测。
(6)酶标仪波长选择492nm，检测吸光度，即od值。最终根据各孔的od计算细胞的存活率和抑制率，计算公式如下：
存活率＝实验组od平均值/对照组od平均值×100％
抑制率＝(对照组od平均值－实验组od平均值)/对照组od平均值×100％
根据细胞抑制率实验结果，应用graphpadprism软件可算出ic50值。
吡嗪酮类小分子抑制剂抗肿瘤活性的初步筛选是选用本实验室保存的人宫颈癌细胞系hela细胞、人卵巢癌细胞系skov-3和人非小细胞肺癌细胞系a549细胞。采用mtt法对合成的51种吡嗪酮类小分子抑制剂进行细胞毒性评价。发现有两种小分子化合物对三种肿瘤细胞具有非常显著的抑制生长的作用，分别命名为cotpaea和my-03-01(第八个柱的指示位置已改)。50.0um的cotpaea处理hela、skov-3和a549细胞24h后，这三种肿瘤细胞的存活率几乎为零，抑制效果最好(图1，横坐标：51种吡嗪酮类小分子抑制剂；纵坐标：细胞的存活率)。在本发明中，主要是对cotpaea的抗肿瘤活性以及机制进行深入探究。
实施例4分子对接模拟吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea与胞内激酶相互作用
利用autodock4生物信息学软件进行模拟。
测定原理：分子对接是指配体与受体之间通过能力匹配和几何匹配而相互识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华作用等。近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项技术。autodock4软件是目前全球应用最广泛的计算机辅助设计平台之一，最主要应用于配体-蛋白分子对接。
测定方法：利用autodock4生物信息学软件模拟吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea的化学结构与肿瘤发生密切相关的20种蛋白激酶之间的相互作用。
分子对接模拟的结果如表1所示，通过比较cotpaea与不同种类激酶之间的自由结合能，发现该药物与akt激酶(ekk)之间的自由结合能最低，表明cotpaea可能与akt激酶结合最紧密，推测cotpaea发挥其抗肿瘤效果的作用靶点可能是akt激酶。因此，我们将进一步的对cotpaea与akt激酶进行分子对接模拟。
表1：20种激酶与cotpaea之间的自由结合能
虽然使用autodock4软件进行分子对接模拟试验成功的例子很多，但仍然需要更多的证据来证明该软件在特定生物系统中的可靠性。为了验证该方法的可行性，进行了由对接原始配体放回蛋白的配体结合位点的一个分子对接模拟。首先，根据赋力场参数从akt的晶体结构中提取出配体anp；然后，配体anp通过autodock4软件重新对接到akt的受体中，autodock软件采用的是马克遗传算法来进行分子自动对接，重新对接的akt蛋白与anp的构象可以在晶体结构中很清晰的观察到，如图2所示，anp重新对接到晶体结构后，与原晶体结构中的位置比较，其rmsd值均小于
通过分子对接可靠性的分析进而利用对接软件autodock4进行cotpaea与akt活性位点的对接模拟。从结果看出较低的负能量值(△g值)表示akt和cotpaea之间有很强的相互作用，低的抑制常数(ki值)也显示出了cotpaea与akt的活性中心有很高的亲和力，从表2可以观察到，cotpaea具有的结合自由能值和ki值比anp要低，表明cotpaea有较强的抑制akt的能力。对接结果图3表明，cotpaea被紧紧束缚在akt的活性位点，配体与蛋白活性中心之间形成氢键通常会形成稳定的底物-酶复合物。从图4可以看出，cotpaea与晶体结构之间形成4个氢键，分别是akt的lys276、asn279、thr291和gsk-3β的arg4，通过对形成的氢键分析如表3所示，cotpaea与akt产生的氢键是重要的氢键。这些在cotpaea与akt之间可能存在的氢键表明：cotpaea通过与akt结合、抑制akt信号通路的方式抑制肿瘤细胞的活性。该结果显示，cotpaea很可能是以akt为靶点的抗肿瘤抑制剂。
表2：anp和cotpaea与akt之间的自由结合能和抑制常数
表3：akt和gsk-3β与cotpaea晶体结构之间形成的氢键
实施例5吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea作用hela细胞的形态学观察
细胞形态学的检测利用dapi染色的方法。
测定原理如下：dapi是一种荧光染料，化学名称为4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，该染料可以穿透细胞膜与细胞核中的双链dna结合产生非常强的荧光信号，从而对细胞的dna进行标记，被dapi标记了的细胞核在荧光显微镜下观察，呈现蓝色荧光。
具体操作步骤：
(1)将贴壁的hela细胞经胰酶消化并收集起来，血球计数板对收集的细胞进行计数，按照4×104/孔的细胞数量接种于6孔板中，每孔加入2ml含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)，置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养24h。
(2)弃掉6孔板孔中的dmem培养基(购自gibco公司)，加入含有不同作用浓度cotpaea(0.0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4um)的dmem培养基(购自gibco公司)，将6孔板置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养24h。
(3)弃去6孔板内的dmem培养基(购自gibco公司)，每孔加入75％(v/v)的乙醇1ml，置在4℃冰箱中固定。
(4)固定10min后用pbs清洗一遍，向每孔加入300μl含0.1μg/ml的dapi甲醇溶液，室温条件下染色10min。
(5)10min后用pbs清洗细胞两次，在荧光显微镜下观察并拍照。
荧光显微镜拍照的结果如图5所示，与不加入小分子抑制剂的组即阴性对照组control相比，加入cotpaea作用细胞后，hela细胞内产生明显的染色质凝集、核皱缩的现象，而且随着药物浓度的增加，这些现象越明显，这些现象正是细胞出现凋亡的形态学特征。
实施例6吡嗪酮小分子抑制剂cotpaea诱导hela细胞凋亡的测定
利用annexinv-fitc/pi双染法检测细胞凋亡。
检测原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。annexinv是一种ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此，annexinv被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将annexinv进行荧光素(fitc)标记，以标记了的annexinv作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidiumiodide,pi)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，pi能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此，将annexinv与pi联合使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在测定过程中，annexinv-fitc阳性细胞为早期凋亡细胞，pi阳性细胞为坏死细胞，双阳性细胞为晚期凋亡细胞。
具体步骤如下：
(1)将贴壁的hela细胞用胰酶消化并收集，按照5×105/孔的细胞数量接种于6孔板中，每孔加入2ml含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)，将6孔板置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养过夜。
(2)弃掉6孔板孔中的dmem培养基(购自gibco公司)，加入含有不同作用浓度cotpaea(0.0、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4um)的dmem培养基(购自gibco公司)，将6孔板置于细胞培养箱中分别培养12、24、36h。
(3)弃掉孔内的dmem培养基(购自gibco公司)，用pbs洗涤细胞一次，胰酶消化并收集细胞。
(4)细胞计数并收集1×106个细胞，加入400ul结合缓冲液悬浮细胞。
(5)向上述400ul的体系中加入5μlannexinv-fitc混匀后，放在避光处孵育20min。
(6)再向上述反应体系中加入5μlpi，混匀，.室温、避光、孵育5min。
(7)最后向上述反应体系中加入100μl的结合缓冲液，配成500μl的体系，用200目筛网过滤到流式管中，在1h内用流式细胞仪测定分析。
流式细胞仪检测细胞凋亡的结果如图6所示，cotpaea能够明显诱导hela细胞产生凋亡。随着cotpaea作用浓度的增加，在12h时，被处理的hela细胞就已经出现不同程度的凋亡状态，而且随着cotpaea的作用时间增长，hela细胞逐渐从早期凋亡进入晚期凋亡。因此，通过此结果可以确定cotpaea能够有效的诱导hela细胞凋亡。
实施例7建立稳定转染akt基因的hela细胞系
采用电穿孔的方法进行细胞转染建立稳定表达akt基因的hela细胞系。
原理如下：电穿孔法是通过短期的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞膜的暂时穿孔，dna被认为是穿过孔扩散到细胞内的，电脉冲和场强的优化对于转染成功非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲法用于各种细胞。
具体步骤如下：
(1)质粒扩增
1)转化dh5α感受态细胞：取akt质粒1μl加入到100μl的dh5α感受态细胞中。冰上静置30min，42℃水浴热激90s，冰上静置2min，再加入800μl无抗生素的lb培养基(成分包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠)于感受态细胞中，于37℃，180rpm摇床中孵育1h。
2)取出孵育的感受态细胞均匀涂在含有氨苄抗性的lb固体培养基(成分包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂)平板上，静置30min，然后置于37℃恒温培养箱中，平板倒置过夜培养。
3)取出培养平板，挑出单克隆菌落，加入到带有氨苄抗性的液体lb培养基中，在37℃，180rpm摇床中培养12h。
4)提取质粒，经bglⅱ单酶切鉴定后，质粒进行测序即得到akt质粒。
(2)细胞转染
1)贴壁的hela细胞经胰酶消化后收集，细胞计数并收集2.5×106个细胞，取400μl含有2.5×106个细胞的悬液放入电转杯中冰浴30min。
2)设置电穿孔仪的电转化参数：u＝200-250v；c＝1050vf；r＝i–j。
3)用装有pbs的电转杯，先进行放电3次。
4)向装有400ul细胞悬液的电转杯加入40μl的akt质粒，放电一次。
5)从电转杯中取出细胞悬液，转入到10cm培养平板中，加入10ml的含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)，将培养平板放于37℃，5％(v/v)co2的细胞培养箱内培养48h。
(3)转染细胞筛选
1)待细胞增长接近混合时进行细胞传代，继续培养，待细胞密度生长至70％时，将电转后的细胞经胰酶消化并收集制备成细胞悬液，按照2.5×104/孔的细胞数量接种于24孔板中，在37℃，5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养6h左右，开始加入不同浓度的g418进行筛选，g418浓度分别为：100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml。
2)确定最佳筛选浓度，在筛选的10-14天内能够杀死所有细胞的最小g418的浓度，即为最佳浓度。在筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后进行单克隆筛选。
3)单克隆筛选，贴壁的细胞消化并收集制备成细胞悬液，细胞计数，用dmem培养基(购自gibco公司)稀释细胞到1个/10μl，在96孔板中加入培养液150μl/孔，再加入细胞悬液10μl/孔，待其逐渐扩增后转入到含有最适浓度的g418培养液中的24孔板中继续扩大培养。
4)单克隆鉴定，待细胞大量扩增后，提取细胞总蛋白，利用蛋白免疫技术检测目的基因。
建立稳定转染akt基因的hela细胞系。首先将得到的akt质粒进行扩增(图7a)，然后将扩增的akt质粒经bglⅱ单酶切使其线性化电转到hela细胞内(图7b)，通过单克隆阳性筛选，使用蛋白免疫印迹方法检测，发现在转染hela细胞系中的akt蛋白表达水平要比未转染akt基因的hela细胞即control高(如图8所示)，因此，成功得到稳定表达akt基因的hela细胞系，将其命名为t-hela。
实施例8吡嗪酮类小分子抑制剂cotpaea靶向akt检测结果
利用蛋白免疫印迹(westernblot)的技术手段检测了胞内蛋白的表达变化。
蛋白免疫印迹即westernblot技术是分子生物学、生物化学和免疫遗传中常用的一种实验方法。其基本原理是通过对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物nc膜或pvdf膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
具体步骤如下：
(1)将贴壁的hela细胞经胰酶消化并收集，收集的细胞用血球计数板计数，按照7×104/孔的数量铺于六孔板中，每孔加入2ml的含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基(购自gibco公司)，置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养。
(2)待细胞贴壁以后，用无菌的pbs洗涤细胞两次，加入含有0.8um的cotpaea的dmem培养基(购自gibco公司)，置于37℃、5％(v/v)co2的细胞培养箱中培养0、10、20、30min。
(3)胰酶消化并收集上述细胞，1500rpm，离心3min，弃去上清。
(4)用4℃预冷的pbs洗涤离心的细胞沉淀两次，1500rpm，离心3min，弃去上清。
(5)向细胞沉淀(作用时间0、10、20、30min，样品共4个，)加入100ul的细胞裂解液ripa(ripa里含有1ul的蛋白酶抑制剂，购自北京鼎国公司)进行裂解，这一过程全程在冰上进行。
(6)待细胞完全裂解后，4℃条件下，12000rpm，离心10min，轻轻吸取蛋白上清液转移到新的离心管中，并做好标记。
(7)采用bca蛋白定量的实验方法，将不同样品之间的蛋白浓度按照最低的蛋白样品浓度进行稀释，最终使样品的蛋白浓度一致。
(8)向每个样品中加入5×sdsloadingbuffer(上样缓冲液，成分包括甘油、sds、dtt、tris-base、溴酚蓝)放入100℃水浴锅，煮沸10min。
(9)待样品冷却以后，准备进行12％(v/v)的sds-page电泳，统一所有样品的上样体积。
(10)电泳槽浓缩胶采用80v恒压，分离胶采用120v恒压，待溴酚蓝前沿迁移到凝胶底部时停止电泳，准备转膜。
(11)采用湿转的方法转膜，使用0.45μm的pvdf膜，该膜在使用之前需要在甲醇溶液中激活1min，之后将膜浸泡到转移液中至少30min，同样预先需要把转膜所需的海绵、滤纸在转移液浸泡30min。
(12)取出跑好的凝胶，按照海绵-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵的顺序，在湿法转移仪中放置好，准备电转，电转条件一般设置为恒流250ma，于4℃冰浴中电转2h。
(13)用pbst溶液(一种洗涤液，由pbs和tween-80配置而成)和脱脂奶粉配制成质量浓度为3％的封闭液，将pvdf膜取出，按照所需蛋白的分子量裁膜，并放入封闭液中，待膜全部浸湿后，封闭至少1.5h。
(14)孵一抗，用pbs配制靶蛋白特异性的一抗溶液，将封闭后的pvdf膜与一抗4℃过夜。
(15)用pbst洗涤pvdf膜3次，每次10min。
(16)孵二抗，用pbs配制靶蛋白特异性的二抗溶液，在室温下孵育45min。
(17)用pbst缓冲液洗涤pvdf膜3次，每次5min。
(18)将清洗后的pvdf膜取出，将ecl发光液均匀地滴加在膜上，用凝胶成像仪器进行曝光。
为了验证分子对接模拟结果，检测了t-hela细胞的全蛋白磷酸化水平即p-tyr。因为蛋白磷酸化是一个很快的过程，一般在30min内结束，所以选择cotpaea作用t-hela细胞的时间为0min、10min、15min和30min。检测结果如图9-a所示，加入cotpaea的t-hela细胞内的p-tyr明显比没有加入cotpaea即control的t-hela细胞内的p-tyr低，而且15min时磷酸化现象比10min时更低，在30min时磷酸化现象逐渐消失。t-hela细胞中akt基因高表达，根据这一磷酸化现象初步假设可能是因为akt为cotpaea作用hela的靶点之一，为了验证这一假设，我们又检测了gsk-3β的磷酸化变化，因为gsk-3β是akt下游的重要靶分子，其磷酸化水平的改变充分体现了细胞内akt激酶活性的变化。从图9-b可以发现，10min时t-hela细胞中gsk-3β的磷酸化变化明显比阴性对照即control低，而且随着时间的延长，磷酸化现象也逐渐消失。因此，结果表明cotpaea是通过结合akt等激酶的活性部位，抑制其底物磷酸化的方式，进而抑制其过表达的信号通路，导致hela细胞发生凋亡，其中，cotpaea的作用靶点之一可能是akt。
实施例9caspase3、8、9活性测定
利用caspase活性检测试剂盒检测caspase3、8、9蛋白的活性。
检测原理是caspase是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。caspase活性检测试剂盒是基于caspase可以催化其底物产生有颜色的底物，从而可以通过测定吸光度来检测caspase的活性。
具体步骤如下：
(1)用胰酶消化加药处理的细胞，1500rpm，4℃，离心5min，
(2)弃掉上清，用预冷的pbs洗涤细胞沉淀一次，并用血球计数板计数；
(3)按2×106个/100μl裂解液(购自贝博公司)的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴中裂解15min；
(4)4℃，12000rpm离心15min，将上清液转移至预冷的离心管中；
(5)按照蛋白浓度为3mg/ml，分别加入caspase3检测缓冲液ac-devd-pna或caspase8检测缓冲液ac-ietd-pna或caspase9检测缓冲液ac-lehd-pna(购自贝博公司)后混匀；
(6)37℃恒温培养箱孵育120min，分别对caspase3、caspase8、caspase9进行405nm的吸光度测定。
结果如图10所示，加入0.8μm的cotpaea处理hela细胞后，caspase3的相对活性为3.37±0.01，caspase8的相对活力为2.31±0.01，caspase9的相对活性为2.66±0.01说明cotpaea可以同时激活caspase3、caspase8和caspase9从而诱导hela细胞发生凋亡。