本发明涉及医药技术领域，具体涉及薯蓣皂苷在制备抑制骨性关节炎药物中的应用。
背景技术：
骨性关节炎是一种由关节软骨以及软骨下骨组织进行性破坏引起的疾病，具体表现为关节的僵硬，疼痛，变形。全球范围内约有237万人罹患有骨性关节炎，并且必然会伴随人口老龄化的加剧而提高。骨性关节炎对患者的生活质量造成了极大的影响且尚缺乏有效的治疗手段。目前的药物治疗主要针对于骨性关节炎疼痛的缓解，而关节置换手术作为一种立竿见影的治疗手段也无法避免内植物磨损及需要翻修等缺点的存在。因此探求一种能够缓解骨性关节炎症状并且能够放缓关节炎进程的药物就显得十分重要。薯蓣皂苷是一种天然甾体皂苷类化合物，富含于薯蓣科植物中。薯蓣皂苷抗炎症，降低血脂，抗肿瘤以及肝脏保护的功效均已被报道。但迄今为止，薯蓣皂苷在骨性关节炎治疗以及骨性关节炎药物制备应用方面的结果仍未见报道。
技术实现要素：
为了探求一种能够缓解骨性关节炎症状并且能够放缓关节炎进程的药物，本发明研究并公开了一种天然甾体皂苷类化合物的应用——薯蓣皂苷，其在抑制骨性关节炎中的应用具有显著效果。
具体的，对于上文所述的应用是指薯蓣皂苷在制备缓解及逆转关节药物损伤中的应用。
具体的，对于上文所述的应用是指薯蓣皂苷在制备缓解及逆转关节面的软骨损伤药物中的应用。
具体的，对于上文所述的应用是指薯蓣皂苷在制备针对骨关节面的抗炎，抗氧化，抗内质网应激以及抗软骨细胞凋亡的药物中的应用。
具体的，对于上文所述的应用是指薯蓣皂苷在制备通过下调wnt/β-catenin信号通路及上调ppar-γ的方式保护并维持软骨代谢稳态的药物中的应用。
具体的，在大鼠中的薯蓣皂苷有效浓度为40-80mg/kg，根据此研究的内容推算，在人体内发挥作用的薯蓣皂苷有效浓度为3.2-9.7mg/kg，每天一次，口服。
在本发明实施例中，将薯蓣皂苷分别以40mg/kg、80mg/kg的剂量，每天一次给大鼠灌胃给药4周，能够明显缓解甚至逆转碘乙酸关节内注射造成的关节损伤，且疗效呈剂量依赖性。与单纯碘乙酸关节内注射组相比，薯蓣皂苷能显著性的缓解关节面的软骨损伤(结果见图1-2)。薯蓣皂苷应用于骨性关节炎的治疗保护作用是通过抗炎，抗氧化，抗内质网应激以及抗软骨细胞凋亡的作用产生的(图3-7)。此外，薯蓣皂苷在骨性关节炎的治疗应用中能够通过下调wnt/β-catenin信号通路及上调ppar-γ的方式保护并维持软骨代谢的稳态(图8)。
附图说明
图1.肉眼所观察到的薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠的股骨髁(f)与胫骨平台(t)的影响
图2.光学显微镜下对软骨切片进行he、番红/快绿、甲苯胺蓝暗蓝染色以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠软骨的影响。
图3.蛋白免疫印记及定量pcr检测ii型胶原蛋白、软骨蛋白聚糖以及金属基质蛋白酶-13以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠关节内细胞外基质的影响。
图4.凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-9以及bcl-2表达水平经由蛋白印记检测以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠关节内细胞凋亡的影响。
图5.血清sod，gsh，mda，ldh活性的检测以及nox4，p22phox蛋白表达的检测以观察的影响薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠氧化应激水平的影响。
图6.蛋白免疫印记检测磷酸化p65以及总p65、iκb-α和tnf-α的蛋白表达水平以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠nf-κb通路激活的影响。
图7.蛋白印记检测grp78、atf4、chop、atf6蛋白表达水平以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型内质网应激的影响。
图8.定量pcr检测wnt/β-catenin表达水平以及蛋白印记检测ppar-γ蛋白水平以观察薯蓣皂苷对碘乙酸所致关节炎模型大鼠的促软骨生长的影响。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
12周龄无特定病原(spf)雄性sprague-dawley大鼠：体重190～220g，n＝32；大连医科大学实验动物中心提供。
统计分析
结果表示为平均值±sd。所有统计学比较均使用spss19.0统计软件(chicago，il)进行。所有的数据在不同的组中使用单因素方差分析进行比较，然后进行lsd后测。p＜0.05时认为差异有统计学意义。
实施例1
1动物模型建立
所有的动物护理和实验程序都是遵循大连医科大学实验动物科学中心的动物管理和使用委员会(iacuc)要求进行的。选取12周龄无特定病原(spf)雄性sprague-dawley大鼠进行研究。动物房环境设定在(22-25℃)的温度，每天12小时/12小时的白夜循环，动物在笼中可自由汲取水与食物以及，大鼠有一周适应新环境，之后按如下处理持续4周。
2骨性关节炎模型的构建及干预
随机将大鼠分为两组：第1组(n＝8)只进行膝关节暴露(空白组)；组2(n＝24)接受关节内mia注射。腹膜内注射10％水合氯醛(5ml/kg)进行麻醉后。经右膝髌下韧带于关节内注射mia(3mg/50μl；sigmauk)诱导关节内软骨损伤。注射后，使动物完全从麻醉中恢复，并在将它们送回笼子之前进行适当监测。第2组随机分为3组，每组8只，分笼饲养：笼号(1)mia对照组；(2)mia+薯蓣皂苷40mg/kg；(3)mia+薯蓣皂苷80mg/kg(薯蓣皂苷；南京京珠生物科技有限公司)。手术后一天，大鼠通过灌胃方式给药(薯蓣皂苷溶解于0.5％羧甲基纤维素(cmc-na)，笼号(2)和笼号(3)中的大鼠每日灌胃给薯蓣皂苷一次。笼号(1)的空白组的大鼠用相同给药方法的方法给予不含薯蓣皂苷的羧甲基纤维素溶液(每日剂量0.5％cmc-na，2.5ml/kg天)处理。4周后，将所有大鼠安乐死。分离右膝关节用以评估总体形态学，组织学，蛋白质印迹和qrt-pcr分析。通过心脏穿刺收集全血。将末端血样离心(4℃，2000g，10分钟)以获得血清用于后期分析。
3大体形态观察
大鼠安乐死后，股骨和胫骨骨被立即分离。在显微镜下操作仔细去除所有多余的软组织，以防损伤关节软骨。每个骨的关节表面用磷酸盐缓冲盐水(pbs)冲洗后，对胫骨和股骨进行的拍摄并存片。图1.大鼠股骨髁(f)与胫骨平台(t)的光学影像。mia模型组关节面的破坏与畸形明显，而在应用薯蓣皂苷后关节软骨的破坏随着薯蓣皂苷剂量的升高得到缓解。关节表面的大致情况如图1所示。肉眼的大致观察可见在假手术组中(正常组)腓骨软骨的表面光亮完整，而在mia诱导的骨关节炎组中，软骨表面几乎消失并显露出软骨下层的骨组织。在40mg/kg的薯蓣皂苷治疗组中，软骨表面的缺损相对于模型组有所减少。而在80mg/kg的治疗组中，关节的软骨表面有着更少的缺损病灶并保留有大部分的软骨组织。关节的破坏以及畸形在mia诱导的骨关节模型组中十分严重，然而在应用薯蓣皂苷组中确被减轻。
4组织学评估
拍摄结束后，将获取的右侧胫骨近端置于10％福尔马林中固定72小时，然后在10％edta中脱钙4周并用石蜡包埋。通过用苏木精和伊红(he)，番红o/快绿以及甲苯胺蓝染色的连续4μm厚的纵向切片的显微镜检查评估组织形态学变化。最后，应用mankin评分系统以量化大鼠关节损伤程度(得分范围：0-14，从正常到最严重的反应)。图2.软骨组织切片染色结果。(a)番红o/快绿染色切片用于评估软骨中的胶原蛋白含量。(b)h&e染色结果作为常用的组织染色方法评估整体形态。(c)甲苯胺蓝染色切片用以评估软骨的情况。(d)mankin评分结果用以对小鼠关节损伤状况进行量化评估。图2显示了组织学染色所示的不同程度的软骨破坏情况。在mia组中可见减少的油红o染色区域，软骨缺失，表面的不规则。蛋白多糖含量下降随着对大鼠应用的薯蓣皂苷计量的提高而逐渐减轻。图2a中he染色显示了薯蓣皂苷对小鼠的大致情况，在以80mg/kg的高剂量作用时，切片中软骨的边缘光滑如正常组(2b)。此外在甲苯胺蓝染色中，粘多糖以及蛋白多糖的含量在mia组中均下降明显。然而在薯蓣皂苷应用组中，mia对以上成分的造成的破坏得到减轻(2c)。以上整体的关节软骨损伤情况以mankin评分系统进行评分。如图2d所示，mankin评分在mia组中显著的升高(p＜0.01)，但是在应用薯蓣皂苷保护时，相比于模型组有着显著的下降。
5氧化损伤相关标志物及抗氧化剂活性测定
使用检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)按照生产商的方案检测超氧化物歧化酶(sod)，谷胱甘肽(gsh)活性，血清丙二醛(mda)含量和培养液上清乳酸脱氢酶(ldh)活性。
6western印迹分析
样品在低温的pbs中洗涤3次，用蛋白质提取试剂盒(南京keygen生物技术有限公司，南京，中国)提取总蛋白质，蛋白质浓度用双辛酸蛋白质测定试剂盒(boster生物技术有限公司，中国武汉)。蛋白质样品在100℃变性5分钟，并通过sds-page分离。随后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并与第一抗体在4℃孵育过夜。在用pbs洗涤三次之后，将膜与抗小鼠或抗兔二抗(1∶1000；ab克隆，中国武汉)室温孵育2小时，并用biotoolecl蛋白质印迹检测底物试剂盒(biotool生物技术研究所)。
7实时定量逆转录pcr(qrtpcr)测量基因表达
低温研磨从大鼠的软骨组织用以获得提取rna的样品，随后使用rnaisoplus提取总rna。使用带有gdnaeraser的primescripttmrt试剂试剂盒，将来自每个样品的1微升总rna在10ml含有gdnaeraser缓冲液，gdnaeraser，无rnasedh2o的反应混合物中在42℃下转录成cdna2分钟。定量实时pcr在含有sybr1premixextaqtm，特异性引物(每种10mm)，roxreferenxedyeii，dh2o和2.0mlcdna模板的20ml反应混合物中使用具有sybr1premixextaqtm(tlirnasehplus)试剂盒放在abiprism7500fast(appliedbiosystems，fostercity，ca)上。使用以下循环参数进行pcr：94℃30秒的一个循环和94℃5秒和60℃34秒的40个循环。特异性引物示于表1中。使用2-δδct方法进行col-2，聚集蛋白聚糖，mmp-13，nox4，wnt和β-连环蛋白的相对定量评价，并相对于gapdh进行测定。
图3.细胞外基质相关分子的蛋白质印记及定量pcr检测结果。(a)ii型胶原，软骨蛋白聚糖以及金属基质蛋白酶-13的蛋白表达水平。(b)ii型胶原，软骨蛋白聚糖以及金属基质蛋白酶-13的mrna转录水平。以上结果均以gapdh作为内参。柱值以平均数±标准差的形式表示(每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05and**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图3中细胞外基质相关的蛋白以及mrna水平通过蛋白印记以及定量pcr的方法进行了检测分析。经由图3的结果我们发现ii型胶原蛋白以及聚蛋白多糖这两种细胞外基质主要成分的水平在应用80mg/kg的组中相较于mia模型组有着显著的提升(p＜0.01)。并且在应用40mg/kg的处理组中，其ii型胶原的表达水平也有这显著的提升(p＜0.05)。mmpi3的mrna以及蛋白水平在mia模型组中有着急剧的下降，然而在40mg/kg以及80mg/kg的薯蓣皂苷给药组中，mmp13的水平有着显著的下降。这些结果显示薯蓣皂苷可以以计量依赖的形式保护细胞外基质免受损伤。
图4.薯蓣皂苷对凋亡的作用。凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-9以及bcl-2表达水平经由蛋白印记检测。(a)caspase-3表达水平；(b)caspase-9表达水平；(c)bcl-2表达水平。以上结果均以gapdh作为内参。平均数±标准差(每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05以及**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图4中caspase-3，caspase-9以及bcl-2参与了软骨细胞的凋亡。因此，在本实验中这些凋亡相关蛋白也以免疫印迹法进行分析用以评估薯蓣皂苷对软骨细胞凋亡的影响。如图4所示，caspase-3，caspase-9在mia所致模型组中有着显著的上升。在应用40mg/kg以及80mg/kg的薯蓣皂苷时，caspase-3，caspase-9的表达均有显著的下降(p＜0.01)。而bcl-2的情况则是在由mia组中显著提高变为显著的下降(p＜0.01)，以上结果提示薯蓣皂苷有着抗凋亡的作用。
图5.薯蓣皂苷对sod，gsh活性，mda水平以及ldh释放的影响。(a)mda水平；(b)ldh水平；(c)nox4的蛋白表达水平；(d)nox4的mrna表达水平；(e)p22phox的蛋白表达水平；(f)血清sod水平；(g)血清gsh的水平。以上结果均以gapdh作为内参。柱值以平均数±标准差的形式表示(每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05以及**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图5为了研究薯蓣皂苷对抗氧化应激的作用，我们检测了大鼠体内mda，ldh，sod以及gsh的含量。nox4是活性氧簇(ros)的主要来源，而p22phox作为nox4活化的一个必须基团，为此在本实验中也进行了检测。如图5所示氧化应激指标mda和ldh在mia组中有着显著的提高。在应用薯蓣皂苷后，两者均有着显著的下降(p＜0.01)。抗氧化酶sod和gsh有着清除氧化产物的能力。如图5f，g所示，可见在40mg/kg以及80mg/kg薯蓣皂苷给药组中sod以及gsh的增高。相对的，薯蓣皂苷能够通过下调氧化产物以及上调抗氧化物的方式来发挥其抗氧化的作用。
图6.薯蓣皂苷对nf-κb通路激活以及tnf-α蛋白表达的影响。(a)磷酸化p65以及总p65的蛋白表达水平；(b)iκb-α的蛋白表达水平；(c)tnf-α的蛋白表达水平；以上结果均以gapdh作为内参。柱值以平均数±标准差的形式表示每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05以及**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图6中nf-κb是数类炎症基因转录的关键因子，其中iκb-α和p65作用于nf-κb激活的上游。如图6a，c所示mia模型组中上升的p65与总p65的比值以及iκb在应用薯蓣皂苷后有着显著的下降。在mia组中显著升高的炎症因子tnf-α的表达水平在应用薯蓣皂苷后有着显著的下降。以上结果显示薯蓣皂苷对炎症的抑制作用。
图7.薯蓣皂苷对内质网应激激活的作用。(a)grp78蛋白表达水平；(b)atf4蛋白表达水平；(c)chop蛋白表达水平；(d)atf6蛋白表达水平。以上结果均以gapdh作为内参。柱值以平均数±标准差的形式表示(每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05以及**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图7中grp-78被应用于提示内质网应激的严重水平。atf4，atf6以及chop对内质网应激的激活以及其所致的凋亡有着重要的作用。因此，本实验中，atf4，atf6，grp-78以及chop被检测用以了解薯蓣皂苷对mia诱导的内质网应激的作用。如图7所示，蛋白印记结果可见grp-78，atf4，atf6和chop的蛋白水平在薯蓣皂苷给药组中相较于mia组有着显著性的下降，这提示薯蓣皂苷有着降低mia所诱导的内质网应激的作用。
图8.薯蓣皂苷对wnt/β-catenin信号通路以及ppar-γ表达的作用。(a)wnt3a的mrna转录水平；(b)β-catenin的mrna转录水平；(c)ppar-γ蛋白的表达水平。以上结果均以gapdh作为内参。柱值以平均数±标准差的形式表示(每组个数为8)实验重复三次。##p＜0.01与空白组比较，*p＜0.05以及**p＜0.01与mia诱导oa组比较。图8中wnt/β-catenin以及ppar-γ已被证实与骨性关节进程相关的氧化应激以及软骨的紊态相关。如图8所示wnt3a以及β-catenin的水平在mia组中有着显著的增高(p＜0.01)，但是在应用80mg/kg的薯蓣皂苷时，以上给药组中的wnt3a以及β-catenin均有着显著的下降(p＜0.01)。mia所致的ppar-γ的下降在应用40mg/kg以及80mg/kg的薯蓣皂苷给药组中有着显著的提升，以上结果显示薯蓣皂苷可以抑制wnt/β-catenin信号通路以及增高ppar-γ的蛋白表达。
总之，薯蓣皂苷以40mg/kg的低剂量及80mg/kg的高剂量胃肠给药于大鼠后能够明显缓解甚至逆转碘乙酸关节内注射造成的关节损伤且疗效在40mg/kg及80mg/kg的给药剂量中呈现计量依赖性。对照单纯碘乙酸关节内注射构建的骨关节炎模型大鼠，薯蓣皂苷能够显著性的缓解关节面的软骨损伤(结果见图1-2)。薯蓣皂苷应用于骨性关节炎的治疗保护作用是经由抗炎，抗氧化，抗内质网应激以及抗软骨细胞凋亡的途径完成的(图3-7)。此外，薯蓣皂苷在骨性关节炎的治疗应用中能够通过下调wnt/β-catenin信号通路及上调ppar-γ的方式保护并维持软骨代谢的稳态(图8)。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。