一种基于黑磷和明胶的复合水凝胶及其在骨组织工程方面的应用的制作方法

本发明属于组织工程技术领域。更具体地，涉及一种基于黑磷与明胶的复合水凝胶与其制备方法和其在骨组织工程方面的应用。

背景技术：

由创伤、癌症、畸变等引起的骨损伤发病率呈逐年增加趋势，急需有效的治疗策略。尽管一直以来认为自体骨移植是骨修复的金标准，但此方法会影响原本健康的组织，带来二次创伤，同时供体来源有限且成本高；而同种异体骨移植也面临着生物活性降低、感染风险增加，且样品制备、处理和储存的成本高等局限。目前，随着科学技术发展和基础研究的深入，包括天然生物材料、合成生物材料和复合材料在内的各种材料已被用于理想骨修复材料的构建。但从第一代以替换受损组织为目的的骨修复材料开始发展至今，只有少数研究被转化为可真正投入市场的临床产品，而其他大部分的研究均因大规模生产加工或实际手术过程中的局限无法真正投入临床使用。

组织工程这一概念由josephp.vacanti和robertlanger教授最先提出，旨在通过干细胞、支架材料和生长因子等关键因素，构建适宜的生物材料来替换或修复受损器官。骨组织工程技术旨在利用工程学及生命科学的理论与方法研究骨的结构、功能及生长机制，开发安全可靠的策略以进行有效的骨损伤修复治疗。作为组织工程的重要分支，骨组织工程也同样涉及细胞、支架材料及植入物与体内微环境的整合。其中，骨组织工程支架不仅为细胞的粘附、增殖提供了结构支持，更能诱导干细胞分化，构成组织再生的微环境。

随着生物医学工程技术的不断发展，设计出安全性好又高效可控型的多功能组织工程支架以解决骨修复方面的现实问题成为当前的重点研究方向。这要求支架材料满足：1、安全无毒，可支持细胞生长；2、可为细胞活动输送营养；3、可根据创伤需要调节其组分构成；4、具有生物相容性、安全性；5、具备可加工性和操作简便性，可以适应不同条件的创伤；6、可控响应性，可根据机体需要控制骨修复进程。开发基于骨骼天然成分及其生理状态的仿生骨修复材料以诱导骨组织再生修复成为骨缺损治疗中极其重要的策略。而生物相容性好、成分可调控、塑型性高的水凝胶材料成为骨修复材料领域的热点。但目前，水凝胶类生物材料诱导骨再生仍面临材料机械性能动态匹配程度低，骨修复过程缓慢不可控，降解速率与修复速度不一致且降解产物或对机体有害等挑战。因此，如何获得安全无毒、可控、生物相容性、并具备促进骨修复效果的生物支架材料成为组织工程亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种基于黑磷与明胶的复合水凝胶。本发明所述的复合水凝胶具备多孔结构、良好的力学性能和生物性能，安全性高、可操作性强，有良好的可控促成骨能力，为临床上实现可控骨修复提供了可能。

本发明的目的是提供一种基于黑磷与明胶的复合水凝胶。

本发明另一个目的是提供上述复合水凝胶的制备方法。

本发明再一个目的是提供上述复合水凝胶在骨组织工程方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种基于黑磷和明胶的复合水凝胶，所述复合水凝胶包括黑磷和经双键修饰的明胶；其中，所述经双键修饰的明胶的总含量为5%～99.9%。

优选地，所述经双键修饰的明胶的总含量为5%～50%。

更优选地，所述经双键修饰的明胶的总含量为5%～20%。

本发明以黑磷和经双键修饰的明胶作为骨组织工程支架材料，并通过调整黑磷及经双键修饰的明胶的组成和比例保证水凝胶支架材料同时具备良好的机械性能、力学性能和生物学性能，可支持细胞的生长及成骨分化，有明显的促进新生骨的生成、骨缺损修复的作用。本发明不仅能通过化学修饰明胶有针对性地构建具备适宜性能的水凝胶基体；同时可通过光控制，利用黑磷在光、氧、水同时存在时的氧化特性控制水凝胶的降解速率及并利用其对钙元素的诱导作用控制水凝胶的矿化速度，从而实现骨修复过程的有效调控，可制备满足不同条件的可控型骨组织工程支架材料，用于骨修复的临床研究及实践中。

优选地，所述经双键修饰的明胶为甲基丙烯酸酯化明胶。

更优选地，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：按质量体积比1.5～7.5：1将甲基丙烯酸酐与明胶溶液反应，反应产物透析干燥后得到白色松软的海绵状产物即为甲基丙烯酸酯化明胶（gelma）。

更优选地，30～60℃水浴下，将明胶溶于磷酸盐缓冲液（pbs）中配成质量体积浓度为5%～20%的溶液后，与甲基丙烯酸酐反应。

本文中，术语“甲基丙烯酸酯化程度”指的是存在于甲基丙烯酸衍生化聚合物中的羧酸基团的量，该羧酸基团能反应产生甲基丙烯酸酯基团。

更具体优选地，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：将明胶在30～60℃水浴下溶于pbs缓冲液中，制成质量体积浓度为5%～20%的溶液；以0.1～1ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐（甲基丙烯酸酐与明胶溶液的质量体积比为7.5：1），于45～55℃水浴中搅拌反应4～24h，加入3～5倍量的pbs停止反应；所得液体透析7～10d后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为甲基丙烯酸酯化明胶。

优选地，所述黑磷的直径为250nm～5μm。

优选地，所述黑磷在复合水凝胶中的含量为0.001%～5%。

更优选地，所述黑磷在复合水凝胶中的含量为0.005%～1%。

更进一步优选地，所述黑磷在复合水凝胶中的含量为0.005%～0.05%。

优选地，所述复合水凝胶中还含有聚酯酰胺（pea）。本发明所述复合水凝胶中可加入促进细胞相互作用的成分以提高其功能。

更优选地，所述聚酯酰胺（pea）为基于精氨酸的不饱和聚酯酰胺（arg-upea）。

优选地，所述复合水凝胶的弹性模量为0.05～1mpa。

本发明还提供了上述复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1.制备黑磷固体颗粒：将黑磷于n-甲基吡咯烷酮中研磨1～60min，超声处理0～10h，功率为300～1000w，于1000～8000r/min下离心5～20min，所得沉淀部分即为黑磷颗粒、黑磷纳米片或黑磷量子点；

s2.将明胶与甲基丙烯酸酐或丙烯酰氯反应，得到可光交联的经双键修饰的明胶；将经双键修饰的明胶消毒并溶解后，加入光引发剂，得到预聚液；

s3.向预聚液中加入黑磷，溶解、分散均匀后超声除去气泡，置于模具中，在紫外光照射下引发聚合反应，即可得到所述的复合水凝胶。

优选地，步骤s1中，于1000～8000r/min下离心5～20min后，再取上清液于10000～30000r/min离心5～10min。

优选地，步骤s2中，所述明胶的分子量为5000～500000。

更优选地，步骤s2中，所述明胶的分子量为10000～100000。

优选地，步骤s2中，所述明胶与甲基丙烯酸酐反应，得到甲基丙烯酸酯化明胶；所述甲基丙烯酸酯化明胶的接枝率为50%～80%。实验发现，甲基丙烯酸酯化明胶的接枝率较高时，产物的光交联性能提升，有利于提高水凝胶的强度，制成的水凝胶更有利于不同条件下的骨组织修复。

优选地，所述甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：按质量体积比1.5～7.5：1将甲基丙烯酸酐与明胶溶液反应，反应产物透析干燥后得到白色松软的海绵状产物即为甲基丙烯酸酯化明胶（gelma）。

更优选地，30～60℃水浴下，将明胶溶于磷酸盐缓冲液（pbs）中配成质量体积浓度为5%～20%的溶液后，与甲基丙烯酸酐反应。

本文中，术语“甲基丙烯酸酯化程度”指的是存在于甲基丙烯酸衍生化聚合物中的羧酸基团的量，该羧酸基团能反应产生甲基丙烯酸酯基团。

更具体优选地，甲基丙烯酸酯化明胶的制备方法为：将明胶在30～60℃水浴下溶于pbs缓冲液中，制成质量体积浓度为5%～20%的溶液；以0.1～1ml/min的速度加入甲基丙烯酸酐（甲基丙烯酸酐与明胶溶液的质量体积比为7.5：1），于45～55℃水浴中搅拌反应4～24h，加入3～5倍量的pbs停止反应；所得液体透析7～10d后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为甲基丙烯酸酯化明胶。

优选地，步骤s2中，所述预聚液中甲基丙烯酸酯化明胶的含量为5%～99.9%

更优选地，步骤s2中，所述预聚液中甲基丙烯酸酯化明胶的含量为5%～20%。

优选地，步骤s2中，所述预聚液中光引发剂的含量为0.01%～5%。

优选地，所述光引发剂为i2959、二苯甲酮、安息香丁醚、异丙基硫杂蒽酮、二苯基乙酮或苯甲酰甲酸甲酯中的一种或多种。

更优选地，所述光引发剂为i2959。

优选地，向所述预聚液中加入促进细胞相互作用的成分以提高其功能性。

更优选地，所述促进细胞相互作用的成分为聚酯酰胺（pea）。

更进一步优选地，所述促进细胞相互作用的成分为基于精氨酸的不饱和聚酯酰胺（arg-upea）。

优选地，步骤s3中，紫外光照10～300s形成水凝胶。

相应地，所述复合水凝胶在作为或制备骨组织工程材料中的应用，也在本发明的保护范围之内。

优选地，所述骨组织工程材料为骨填充材料、骨修复用生物医用材料或骨再生用生物医用材料。

本发明所制备的复合水凝胶除了具备传统水凝胶制品的形态及传统复合水凝胶的吸水性和可塑性外，还具有以下有益效果：

1、本发明通过对生物相容性极好的明胶进行筛选和加工改性，可根据实际骨损伤的需要调整组分，制备稳定、高强度且生物性能良好的复合水凝胶。

2、本发明的复合水凝胶加入可控尺寸的黑磷材料，利用黑磷在光、氧、水同时存在时的氧化特性控制其降解速率及并利用其对钙元素的诱导作用控制水凝胶的矿化速度，从而实现骨修复过程的有效控制。

3、本发明的产品可根据实际需要可通过对黑磷的尺寸、浓度和构成水凝胶的组分、比例进行精确调控，选择适合的光照时间，配合不同模具，可实现不同形状、不同厚度的复合水凝胶的快速制备。

4、本发明所制备的复合水凝胶呈均匀的孔状结构，适宜细胞黏附生长，有明显的促进新生骨的生成、骨缺损修复的作用；有良好的力学性能，可支持细胞的生长及成骨分化，可承受生理活动中产生的压力；具有良好的生物降解性、生物相容性和极低的细胞毒性，适宜细胞的黏附生长与增殖；具有良好的光响应性，适宜骨修复过程的有效控制。

附图说明

图1为黑磷复合水凝胶（左起依次为不含黑磷的复合水凝胶、含低浓度（0.005%）黑磷的复合水凝胶及含较高浓度（0.05%）黑磷的复合水凝胶）。

图2为基于黑磷和明胶的复合水凝胶扫描电镜图。

图3为黑磷复合水凝胶材料制备成圆柱体进行力学测试的结果（bp为含黑磷的复合水凝胶，gelma水凝胶即为不含黑磷以甲基丙烯酸酯化明胶为主体的水凝胶）。

图4为黑磷复合水凝胶材料mtt测试结果图（bp为含黑磷的复合水凝胶，gelma水凝胶即为不含黑磷以甲基丙烯酸酯化明胶为主体的水凝胶）。

图5为黑磷复合水凝胶材料表面接种细胞培养时显微镜下观察结果（a为不含黑磷的复合水凝胶，b为含黑磷的复合水凝胶）。

图6为黑磷复合水凝胶材料表面接种细胞培养后使用rhodaminephalloidin和dapi染色的荧光图像（左图为不含黑磷的复合水凝胶，右图为含黑磷的复合水凝胶）。

图7为基于黑磷和明胶的复合水凝胶植入兔颅骨缺损模型3个月后的骨组织h&e染色结果（左图为不含黑磷的复合水凝胶组，右图为含黑磷的复合水凝胶组）。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1黑磷-明胶复合水凝胶的制备

1、一种基于黑磷和明胶的复合水凝胶，由以下步骤制备而成：

（1）制备黑磷纳米片：取黑磷于n-甲基吡咯烷酮中研磨10min，超声处理10h，功率为1000w，于8000r/min下离心10min，取上清液于15000r/min离心，所得沉淀部分即为黑磷纳米片，其直径为250～300nm；

（2）制备预聚液：将分子量为10000的明胶甲基丙烯酸酯化后用纯水溶解配制成10%的甲基丙烯酸酯化明胶溶液，加入0.17%（w/v）的溶于dmso的光引发剂i2959，混匀，即得到预聚液；

其中，将明胶甲基丙烯酸酯化的方法为：将分子量为10000的明胶在50℃水浴下溶于pbs缓冲液中，制备成15%（w/v）浓度的溶液，以0.7ml/min的速度缓慢滴加甲基丙烯酸酐，其与明胶的比例为7.5：1（w/v），在50℃水浴中搅拌反应12h后加4倍量的pbs停止反应。将所得乳白色液体装入透析袋（8～14kd）中，于蒸馏水中透析7d待溶液透析至透明状后，冷冻干燥得到白色松软的海绵状产物，即为甲基丙烯酸酯化明胶（gelma）材料；其中，甲基丙烯酸酯化明胶的接枝率为50%～80%；

（3）复合水凝胶的制备：将上述得到的预聚液与黑磷纳米片混合，使得黑磷含量为0.001%；除去气泡后置于模具中，紫外光照60s，即可制备成复合水凝胶。

实施例2性能测试

1、对本发明的复合水凝胶进行性能检测

（1）如图1所示，本发明制备的水凝胶形状完整，呈透明状，机械性能好，同时形成的水凝胶根据黑磷含量的不同显示不同深浅的银黑色。

（2）如图2所示，由sem图像可知，本发明制备的水凝胶具备良好的孔隙结构，可为骨细胞提供适宜的生长空间，骨细胞可良好地粘附、生长，便于细胞的生长繁殖。

（3）如图3所示，力学性能测试证明，相同条件下，含黑磷的复合水凝胶（bphydrogel）的压力承受能力明显好于不含黑磷的复合水凝胶组（gelmahydrogel），说明本发明制备的水凝胶具备良好的机械性能，植入骨缺损部位后可承受生理活动带来的压力。

（4）如图4所示，通过mtt法检测细胞毒性可看出，本发明制备的复合水凝胶吸光度值与不加水凝胶的空白组相比无显著性差异，表明本发明的复合水凝胶无细胞毒性，生物相容性好。

（5）如图5所示，在水凝胶上接种骨细胞培养2天后直接于显微镜下观察，可见骨细胞在水凝胶上生长状态良好；如图6所示，进一步染色后在倒置荧光显微镜下观察，可见骨细胞铺展完全，细胞数目较多。而且，与不含黑磷的复合水凝胶相比，在含黑磷的复合水凝胶中，骨细胞的数目明显增多，生长状态明显更好。

（6）另外发现，接枝率为50%～80%的甲基丙烯酸酯化明胶，可提升产物的光交联性能，有利于提高复合水凝胶的强度，使复合水凝胶更有利于不同条件下的骨细胞生长；另外研究发现，明胶的分子量过小时所制备的水凝胶较脆，分子量过大则不易进行改性等操作形成的水凝胶也较软黏，均不适宜制备骨修复材料，分子量为5000～500000的明胶，其经双键修饰后构成的复合水凝胶具备较适宜的机械性能，可承受骨缺损部位在修复过程中的生理活动带来的压力，而分子量为10000～100000时的明胶最为适用于改性及构建复合水凝胶，操作方便且所得复合水凝胶的综合性能最优。

以上结果表明，本发明制备的水凝胶生物相容性好、安全性高，同时兼有良好的力学性能和功能性，适合骨细胞生长，可作为骨支架材料为骨细胞的生长分化提供良好的支撑和营养，可支持细胞的生长及成骨分化，有明显的促进新生骨的生成、骨缺损修复的作用。另外，本发明可以通过光控制，利用黑磷在光、氧、水同时存在时的氧化特性控制水凝胶的降解速率及并利用其对钙元素的诱导作用控制水凝胶的矿化速度，从而实现骨修复过程的有效调控。

2、体内实验

（1）颅骨缺损模型的构建：取健康成年新西兰兔，以3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，全麻成功后，剔除头部毛发，清洁表面皮肤，从中线小心依次切开皮肤及皮下组织，剥离骨膜后于颅骨上用高速旋转骨钻制造10mm的2个左右对称的骨缺损模型。

（2）颅骨缺损修复手术：在骨缺损处植入复合水凝胶，缝合，术毕清洁并用碘伏消毒创口部位。术后定时观察记录其生理状况。自手术起1个月、2个月、3个月时将各批次中2只的兔子麻醉放血处死，采用骨钻圈取修复部位颅骨，生理盐水清洗周围血液，4%多聚甲醛固定48h后对取得的骨组织样品进行组织学观察和免疫组化分析，判断骨组织工程支架材料对颅骨缺损修复的效果。

（3）结果：

如图7所示，在兔颅骨缺损部位植入复合水凝胶3个月后取对应骨组织部位切片并进行h&e染色可见，含黑磷的复合水凝胶植入后新生骨明显更多，骨组织修复状态明显好于不含黑磷的复合水凝胶组。

实施例3加入arg-upea的黑磷-明胶复合水凝胶

制备方法其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：在复合水凝胶的制备方法步骤（3）中，向得到的预聚液中加入2%（w/v）的基于精氨酸的不饱和聚酯酰胺（arg-upea），溶解后与黑磷纳米片混合，使得黑磷含量为0.001%。

结果发现，不加入arg-upea的复合水凝胶与加入了arg-upea的复合水凝胶均具备良好的生物相容性和成骨能力；与不加入arg-upea的复合水凝胶相比，加入了arg-upea的基于黑磷和明胶的复合水凝胶进一步提高了黑磷的控制释放能力，原因可能是arg-upea的带电性增强了细胞间的相互作用。

实施例4不同甲基丙烯酸酯化明胶比例对黑磷-明胶复合水凝胶的影响

制备方法其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：以甲基丙烯酸酯化明胶的总含量为单因素，分别制备甲基丙烯酸酯化明胶的总含量为0.01%、1%、5%、10%、20%、50%、99.9%的一系列复合水凝胶。

结果发现，含量为0.01%和1%时，获得的产物的机械性能较差，而含量为5%时的产物，具有较好的机械性能，抗压能力和弹性模量适中，孔隙结构较好地适于骨细胞生长；含量为10%时，所制备的复合水凝胶抗压能力和弹性模量继续提升，孔壁稍有变厚，适于骨细胞生长；含量为20%时，所制备的复合水凝胶抗压能力和弹性模量继续提升，孔壁更厚，但仍适于骨细胞生长；含量为50%时，所制备的复合水凝胶机械性能继续提升，但孔隙结构改变较大，不利于骨细胞的生长；而随着含量的继续升高，含量为99.9%时，水凝胶质地坚硬，无法塑型。

实施例5不同浓度黑磷-明胶复合水凝胶的制备

制备方法其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：黑磷的含量分别为0.0005%、0.001%、0.05%、1%、5%、10%。

研究发现，黑鳞的含量偏高或偏低均会明显影响到复合水凝胶的综合性能，当黑磷的含量为0.001%～5%时，复合水凝胶的机械性能、力学性能、生物学性能和骨缺损修复效果较好，而当黑磷的含量为0.005%～0.05%时，复合水凝胶的机械性能、力学性能、生物学性能和骨缺损修复效果最好。

对比例1

制备方法其他条件同实施例1，唯一不同之处在于：所用的明胶不经过改性，用的不是10%的甲基丙烯酸酯化明胶，而是直接使用10%的明胶。

结果发现，与使用甲基丙烯酸酯化明胶相比，直接使用10%的明胶时，其无法在紫外光照条件下成胶，仅在低于10℃的条件下呈固态，很难作为骨修复材料使用，整体结果较差。