本发明涉及生物医药领域，具体地说是涉及一种人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法及应用。
背景技术
外泌体是由胞吐作用释放到细胞外的纳米级外脂质双层囊泡，可存在于多种类型的细胞外体液中，如血液、尿液、羊水、唾液、脑脊液甚至母乳。研究发现，外泌体中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞，从而改变其它细胞的功能。如：外泌体参与神经元通信、抗原呈递、免疫反应、器官发育和生殖等基本的生理过程的调控，还参与调控癌症进展、心血管疾病、炎症、神经退行性疾病、病毒感染和朊病毒传播等病理过程。
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是干细胞家族的重要成员，是中胚层来源的非造血细胞。其来源丰富，可由胎盘、乳牙、脂肪、骨髓、骨小架、骨膜、骨骼肌、皮肤、外周血和脐带等组织器官中分离得到。mscs可分泌多种生长因子(如表皮生长因子、血管内皮生长因子、胶原蛋白和纤维粘连蛋白等)及炎性因子(干扰素γ、白细胞介素9及肿瘤坏死因子α等)，在抑制皮肤老化、美白肌肤、辅助脂肪移植、促进毛发再生等诸多抗衰老方面均有较显著的效果。mscs具有很强的自我更新能力及多向分化潜能，因此具有促进损伤组织再生修复的能力。更重要的是，mscs可以通过旁分泌机制以及mscs与免疫细胞间的相互作用，介导调节免疫反应平衡。mscs可以广泛调节多种免疫细胞，如mscs不仅抑制t淋巴细胞增殖，同时能抑制初始t细胞向th1和th2细胞亚群分化，促进调节性t细胞的产生；mscs还可以通过影响树突状细胞间接诱导treg；mscs通过旁分泌作用b细胞，将b细胞控制在g0/g1期抑制b细胞的增殖和分化，同时显著降低b细胞趋化因子和趋化因子受体的表达，以降低炎症部位b细胞介导的免疫损伤；mscs也可以促进促炎的i型巨噬细胞向抗炎症ii型巨噬细胞转换，进而起到治疗败血症的作用，此外，mscs还可以下调il-2或il-15诱导的自然杀伤细胞活化。
mscs除了能调控免疫细胞外在炎症反应过程中也起着平衡的作用，在炎症初期或者慢性炎症炎性较弱的时候，mscs能够激活免疫系统，促进炎症的发生，而当炎症比较激烈可能会引起机体自身损伤时，mscs又表现出抗炎的一面，抑制炎症的进一步发生，维持机体的免疫系统的平衡。在高炎症环境下，ifn-γ与tnf-α等因子刺激mscs表达ido、inos及cxcr3和ccr5的配体，其中趋化因子招募t细胞到达mscs周围，借以表达的免疫抑制因子抑制t细胞功能。而il-17则通过调节rna结合蛋白auf1提高mscs中inosmrna的稳定性，显著促进mscs的免疫抑制功能。
随着干细胞工程和外泌体研究的深入开展，人们也相应的了解了间充质外泌体在人类健康与疾病方面极其复杂和深奥的作用机理，进而聚焦于外泌体对于疾病防治、免疫调控以及抗衰老方面的临床应用和美容应用。已有研究表明间充质干细胞所分泌的胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素1和肿瘤坏死因子α能激活机体整体上处于休眠状态下的各种细胞群，以替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成的组织细胞的衰退和老化，达到组织器官功能的恢复，改善因衰老等因素造成的细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的信息传递，增强和加快个组织细胞的新老更替等作用。浙江大学医学院的王本、骆严教授及其团队综述了外泌体的形成和摄取基本过程，并阐述了外泌体的生理学和病理学作用，介绍了如何将外泌体改造成为转化医学中的游离工具，使得外泌体成为当下最有望应用于医美和临床治疗的细胞衍生囊泡。
市场上大多数美容制剂的活性成分单一，个体针对性不强，产品效果不佳，且产品同质化严重等问题。而干细胞分泌的因子可提供细胞生长和分化所需要的各种营养和物质信息，可快速激活人体的修护系统，根据不同肌肤问题进行智能修护。因此，开发一种能够发挥媲美干细胞因子的最佳修护功效的美容制剂是亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法及应用，该方法制作工艺简单，即用即配；通过该方法制备的美容制剂能有效的利用外泌体的生物活性成分，使医美制品能够发挥媲美干细胞因子的最佳修护功效。
本发明的第一个目的在于提供一种人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂，按重量份数计，所述美容制剂包括92-108份人间充质干细胞外泌体、8-13份甘露糖醇、0.42-0.55份寡肽-32、1.3-2.5份四肽-4、0.7-1.3份棕榈酰三肽-1、0.8-1.2棕榈酰五肽-4，所述人间充质干细胞来源于脐带。
进一步地，按质量分数计，所述美容制剂包括100份人间充质干细胞外泌体、10份甘露糖醇、0.5份寡肽-32、2份四肽-4、1份棕榈酰三肽-1、1份棕榈酰五肽-4。
本发明的另一目的在于提供上述任一项所述一种人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法，该制备方法按重量份数取人间充质干细胞外泌体、甘露糖醇、寡肽-32、四肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4混合搅拌均匀后，滤膜过滤，分装后冷冻干燥，得到所述人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂。
进一步地，所述人间充质干细胞外泌体是通过以下方法制备的：
(1)间充质干细胞分离培养：在无菌条件下，将脐带剪成小段，充分洗涤，去除动静脉获得wharton胶，将wharton胶剪碎直至肉眼看不见组织块；碎块wharton胶中加入消化酶消化；将消化好的悬液混匀后，用pbs稀释至不粘稠，离心；沉淀在含fbs和青链双抗的低糖dmem培养基中混匀后过滤，将间充质干细胞接种于培养皿中培养，待间充质干细胞融合达70～80％后，用胰酶消化，进行传代培养；
(2)收集间充质干细胞：选择增殖能力强的、状态好的第3-5代的间充质干细胞，无血清培养48h后收集培养上清液，得到间充质干细胞条件培养基；
(3)外泌体分离纯化：取收集的培养上清液，除去细胞碎片后，无菌滤膜过滤至超滤离心管中浓缩，将浓缩液移至加有质量浓度为300g/l蔗糖的超速离心管中离心，底部沉淀用pbs稀释后，再次浓缩滤膜过滤除菌，于-80℃冷藏备用。
进一步地，所述滤膜过滤分为两步，第一步采用孔径为0.45μm的滤膜过滤，第二步采用孔径为0.22μm的滤膜过滤。
进一步地，所述冷冻干燥的温度为-50℃～-80℃，冷冻压力为10pa的真空度，冷冻时间为12～48h。
本发明第三个目的是提供人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法的应用，所述人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法应用于生物美容制剂的制备领域。
本发明最后提供了所述人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的使用方法，是采用外敷方式将外泌体美容制剂敷在表皮层或采用微针、滚针或水光针中任一种方式将外泌体导入表皮深层和真皮层。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂利用immureg技术，实现对肌肤免疫状态的精准调节，从而清除老化细胞，修复岁月痕迹，使肌肤细胞年轻化。
(2)本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂能很好保持人间充质干细胞外泌体的形态和活性，并且能有效的利用外泌体的生物活性成分，使医美制品能够发挥媲美干细胞因子的最佳修护功效，实现肌肤的焕新。
(3)本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂配方中结合了外泌体、具有高渗透性的寡肽、多种美容功能的多肽，能够使外泌体与寡肽、多肽协同作用，进一步促进对皮肤的再造与修复；同时更加高效地将生物活性大分子如各种细胞因子和亚细胞器如外泌体导入皮肤的表皮层或真皮层，从而极大地穿越了一直困扰人们的皮肤屏障，使大分子和更大的亚细胞器都能真正地和皮肤中的各种细胞接触和相互作用，发挥它们的生物学和生理学功能，达到改善皮质、均匀和美白肤色的功效，使美容制剂不仅能通过微针、滚针或水光针被肌肤吸收，即使是外敷也同样能起到皮肤修复抗衰老的作用。
(4)本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备方法工艺简单，即用即配、安全有效。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。
实施例1：人间充质干细胞外泌体的制备
1.间充质干细胞的培养
a)用含5％的青霉素-链霉素的pbs缓冲液浸泡新鲜脐带，反复冲洗3-5遍，直至无血液及其它杂质；
b)将脐带剪成3-4cm的小段，沿脐带切断出可肉眼观察到到其中包含三条血管，其中两条动脉在静脉两端，沿其中一条动脉剥离开脐带外模，此时将动脉撕下，可见动脉与静脉间粘稠状物质，即wharton胶，将此胶一点点撕下放置滴有少量pbs的培养皿上；
c)同样的方法分离另一动脉与静脉间的wharton胶，最后将静脉剥离出来，分离最后留在外膜上的wharton胶；
d)将分离所得的所有wharton胶剪碎，直至肉眼看不见组织块，剪碎过程保持wharton胶处于湿润环境中；
e)将碎块wharton胶移至新的培养皿中，加入0.1％ⅰ型胶原酶后将组织放入培养箱，38℃消化约9-12小时；
f)将消化好的悬液混匀后，用pbs稀释至不粘稠，即1ml悬液加20mlpbs，混匀后2000rpm，10min；最后将沉淀用pbs混匀，1500rpm，5min离心；
g)加入dmem/f12+10ng/mlbfgf+10％fbs+1％(v/v)的完全培养基混合均匀后，70μm滤网过滤，计数后按照5*105/ml接种于培养皿中；
h)待细胞贴壁后48h进行半量换液；
i)待原代细胞达到80-90％融合后，用0.25％胰蛋白酶消化进行传代。
j)将获取的间充质干细胞进行流式鉴定，检测结果显示所分离获取的干细胞表面cd90、cd105表达率为98％，cd19、cd34、cd45的表达率为1％。
2.间充质干细胞条件培养基的收集
选择增殖能力强的、状态好的第3-5代的间充质干细胞，无血清培养48h后收集培养上清液，得到间充质干细胞条件培养基。
3.外泌体的分离纯化(超速离心法)
取30ml收集的培养上清液，1000g*15min除去细胞碎片等，在经0.45μm无菌滤膜过滤到20ml规格的超滤离心管中，4℃条件下1000g*70min离心得到含外泌体的浓缩液，将浓缩液移至加有200μl质量浓度为300g/l蔗糖的超速离心管中，4℃条件下，100000g*70min离心，收集底部沉淀用pbs稀释后，再次100000g*70min离心，最后将收集的外泌体浓缩液进行定量，0.22μl滤膜过滤除菌，分装，于-80℃冷藏备用。
外泌体的分离纯化也可以采用peg法沉淀，具体方法如下：收集间充质干细胞条件培养基的上清，2000g*20min离心除去细胞以及碎片等，再经0.22μm无菌滤膜过滤到离心管中，加入10％终浓度的聚乙二醇溶液，漩涡混匀后，4℃条件下4000g*20min离心12h，小心倾倒上清液，用1/100培养体积的dpbs重悬沉淀；然后吸入1.5mlep管中，再加入8％终浓度的聚乙二醇溶液4℃孵育1h后，10000g*10min条件下用dpbs清洗沉淀表面，200μldpbs重悬沉淀，分装-80℃保存。
4.外泌体鉴定
将20μl磁珠加入到1.5mlep管中混匀，加入200μl0.1％bsa溶液冲洗磁珠，将ep管置于磁极上1min，吸取上清，加入100μl分离纯化后的外泌体浓缩液(通过传通超速离心方法获得)混匀，4℃过夜。加入300μl0.1％bsa清洗，置于磁极上1min吸掉上清，所得悬液与cd81、cd63、cd166、cd90、cd73、cd105、cd29单克隆抗体温育，同时用同型igg作为阴性对照，经流式细胞仪检测。结果显示外泌体cd29和cd73表达基本保持不变，表明通过上述人间充质干细胞外泌体的制备方法制备的外泌体可以有效地维持所得外泌体的生物活性。
实施例2：人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备
1、配方
9.2g人间充质干细胞外泌体、0.8g份甘露糖醇、42mg份寡肽-32、130mg份四肽-4、70mg份棕榈酰三肽-1、80mg份棕榈酰五肽-4
本发明中的以人间充质干细胞外泌体为主要成份的美容制剂，以适量的甘露糖醇作为赋形剂，在冻干产品中加入甘露醇可以起到良好的效果，改变冻干产品的形态，同时对于多肽类的产品还可以起到一定的保护作用，有利于产品的稳定。并且本发明中甘露糖醇的用量可以忽略其本身的药理作用。
本发明的美容制剂中添加了皮肤渗透性更好、更易被吸收的寡肽-32，能够与自由基联结，使之随人体的代谢排出体外，从而让细胞获得营养成分，其活性也大大地增强。因此，寡肽-32的存在能使人体衰老的细胞、破损的细胞得以再造和修复。
本发明的美容制剂中添加了多种多肽如四肽-4、棕榈酰三肽-1、棕榈酰五肽-4，能大量促进胶原蛋白的生产，显著减少脸面皱纹，增强面部弹性，同时促进细胞活性，提高肌肤含水量，改善肤色。通过从内至外的重建来逆转皮肤老化的过程。
2、制备方法
取实施例1纯化后的人间充质干细胞外泌体(超速离心法)9.2g，加入0.8g份甘露糖醇、42mg份寡肽-32、1300mg份四肽-4、70mg份棕榈酰三肽-1、80mg份棕榈酰五肽-4，混匀后，依次经0.45μm、0.22μm的微孔膜过滤后，在温度为-50℃，冷冻压力为10pa的真空度的条件下冷冻真空干燥12h，得到所述美容抗衰老的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂，室温保存。
实施例3：人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备
1、配方
10g人间充质干细胞外泌体、1g份甘露糖醇、50mg份寡肽-32、200mg份四肽-4、100mg份棕榈酰三肽-1、100mg份棕榈酰五肽-4
2、制备方法
取实施例1纯化后的人间充质干细胞外泌体(超速离心法)10g，加入1g份甘露糖醇、50mg份寡肽-32、200mg份四肽-4、100mg份棕榈酰三肽-1、100mg份棕榈酰五肽-4，混匀后，依次经0.45μm、0.22μm的微孔膜过滤后，在温度为-65℃，冷冻压力为10pa的真空度的条件下冷冻真空干燥30h，得到所述美容抗衰老的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂，室温保存。
实施例4：人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂的制备
1、配方
10.8g人间充质干细胞外泌体、1.3g份甘露糖醇、55mg份寡肽-32、250mg份四肽-4、130mg份棕榈酰三肽-1、120mg份棕榈酰五肽-4
2、制备方法
取实施例1纯化后的人间充质干细胞外泌体(超速离心法)10.8g，加入1.3g份甘露糖醇、55mg份寡肽-32、250mg份四肽-4、130mg份棕榈酰三肽-1、120mg份棕榈酰五肽-4，混匀后，依次经0.45μm、0.22μm的微孔膜过滤后，在温度为-80℃，冷冻压力为10pa的真空度的条件下冷冻真空干燥48h，得到所述美容抗衰老的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂，室温保存。
实施例5：外泌体的形态检测
实施例1制备的人间充质干细胞外泌体在超低温冰箱(-80℃)保存，实施例2、3、4中制备的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂均室温保存，一月后，实施例1的人间充质干细胞外泌体融化作检测，实施例2、3、4中美容制剂用pbs缓冲溶液复溶作检测。
采用原子力显微镜对外泌体进行形态学观察。待检测的外泌体经纯水按一定比例稀释后，取10μl稀释液滴加到新解离的云母表面。静置约30min后，用纯水小心冲洗并用氮气吹干。原子力显微镜成像采用振幅调制轻敲模式(共振频率为56khz，弹性系数为0.24n/m)。
结果显示，实施例2、3、4制备得到的外泌体美容制剂复溶后，其中的外泌体与一直超低温保存后融化的外泌体的形态大小相似，没有显著性差异。
实施例6：美容制剂促进人面部皮肤的改善
采用水光微针将本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂导入表皮深层和真皮层时，人面部皮肤的改善实验，具体实施步骤如下：用75％的医用酒精消毒皮肤，将微针浸泡在75％的医用酒精消毒液中约15-30min，分别取实施例2、3、4中的美容制剂与外泌体复苏液1：3融合后，涂抹在面部皮肤。继而，用微针按顺序由下至上滚动，每个部位约2次，然后呈米字型全脸洗一遍。然后敷美塑专用面膜40-60min，无须清洗。用后7、30天用皮肤镜(cbs-807皮肤分析系统)检测皮肤的弹性、毛孔大小、水分、皱纹和肤色。结果见表1显示这些指标均有明显的改善。
表230人次使用间充质干细胞培养液前后的面部皮肤改善情况
由上表可知，采用水光微针将本发明的人间充质干细胞来源的外泌体美容制剂导入表皮深层和真皮层，可以有效改善面部皮肤弹性、水分、皱纹、斑点和毛孔粗大等问题，对面部皮肤具有修复作用。
采用外敷将外泌体美容制剂敷在表皮层时，人面部皮肤的改善实验，具体实施步骤如下：对取实施例3中的美容制剂与外泌体复苏液1：3融合后，涂抹在面部皮肤(受试者为痘痘肌)。每天早晚涂抹相应样品2次，每次分别涂抹0.3g，在连续使用28d后，观察受试者皮肤状况。结果显示，受试者使用实施例3中的美容制剂后，皮肤粗糙度显著下降，皮肤弹性增强，肤色更均匀，毛孔减小，且面部痘痘有明显改善。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。