本发明涉及一种中药组合物在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。
背景技术：
：手足口病是一种由肠道病毒感染引起的常见传染病。该病多发生于5岁以下儿童，发病初期在患儿四肢末端以及口腔等处引起疱疹或溃疡，患儿多在1-2周内痊愈。少数患儿可在发病1-5天左右出现脑膜炎、无菌性脑炎、脑干脑炎、脑脊髓炎、肺水肿以及循环障碍等，极少数病例病情危重，可致死亡，存活病例可留有后遗症。该病以手、足和口腔粘膜疱疹或破溃后形成溃疡为主要临床症状。手足口病是由小RNA病毒科、肠道病毒属病毒引起的，对婴幼儿健康及公共卫生安全有极大威胁的传染病。自2000年以来，我国和亚洲地区都出现了多次儿童手足口病的大规模爆发流行，对数以万计的儿童生命健康造成巨大威胁。手足口病可由柯萨奇病毒A4,A5,A9,A10,B2,B5和肠道病毒71等肠道病毒引起，但主要由肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒16型(Cox.A16)引起。目前临床主要采取对症治疗的策略，用丙球蛋白及抗病毒药物，如阿昔洛韦、更昔洛韦、干扰素等，预防主要用巴氏消毒液进行消毒；尚没有直接靶向病毒的特效药物。但这些药物大多是治疗表征，使用这些药物后重症患儿死亡率仍然较高。随着对中医药认识的不断深入，中医药对本病的治疗优势不断显效，中医认为该病主要归属为“湿毒”、“温病”、“时疫”的范畴，因此，根据“湿毒”、“温病”、“时疫”的中医治则，开发一种可用于治疗手足口病的中药制剂具有重要的现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种中药组合物的药物新用途。所述药物组合物的新用途是其在制备预防和/或治疗手足口病药物中的应用。所述手足口病由下述至少一种病毒引起：肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、柯萨奇病毒A4型、柯萨奇病毒A5型、柯萨奇病毒A组9型、柯萨奇病毒A组10型、柯萨奇病毒B2型和柯萨奇病毒B5型。本发明所述的中药组合物由下述质量份的原料制成：柴胡4-36份、黄芩2-18份、板蓝根4-36份、葛根2-18份、金银花2-20份、水牛角1-9份、连翘2-22份和大黄1-9份。所述中药组合物可进一步由如下原料制成：柴胡10-30份、黄芩5-15份、板蓝根10-30份、葛根5-15份、金银花5-17份、水牛角2-8份、连翘6-18份和大黄2-8份。所述中药组合物更进一步由如下原料制成：柴胡16-24份、黄芩8-12份、板蓝根16-24份、葛根8-12份、金银花9-14份、水牛角4-6份、连翘9-14份和大黄4-6份。最优选的原料组成为：柴胡20份、黄芩10份、板蓝根20份、葛根10份、金银花11份、水牛角5份、连翘12份和大黄5份。制成上述药物组合物的各原料药是按照质量份作为配比，在生产时可按照相应的比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或减小，但各组成之间的原料药质量配比比例不变。上述中药组合物是按照包括下述步骤的方法制备的：1)将柴胡、金银花、连翘三味药混合后，采用蒸馏法提取挥发油，收集挥发油、蒸馏后的水溶液及药渣；2)先将水牛角加水单独煎煮2-4小时，再将水牛角药渣及煎煮液与步骤1)所述药渣及其余黄芩、板蓝根、葛根、大黄四味药共同煎煮，收集煎液；3)将步骤1)得到的蒸馏后的水溶液与步骤2)得到的煎液合并，浓缩成清膏，放冷，然后在所述清膏中加入乙醇使其体积含量达到50％-80％，搅匀，静置，取上清液，回收乙醇并浓缩至适量，与步骤1)得到的挥发油合并，即得到所述中药组合物。该中药组合物药液可以直接服用或者加入适量矫味剂和/或纯净水制成合剂或口服液。其中，步骤1)所述蒸馏法(水蒸汽蒸馏法)中，所加入的水量通常为柴胡、金银花和连翘药材总质量的5-10倍，加入水后浸渍20-60分钟，再加热蒸馏。步骤2)所述单独煎煮中，所加入的水量为水牛角质量的8-12倍(通常条件为加10倍量水，煎煮3小时)。所述共同煎煮可进行1-3次，每次煎煮的时间为1-3小时，每次煎煮所加入的水量为八味药材总质量的5-8倍。步骤3)中所述清膏为85℃测定的相对密度为1.20-1.25的清膏。所述静置的时间可为24-72小时。为了进一步得到固态的药物，所述方法还包括：将所述中药组合物浓缩成稠膏，干燥，粉碎，过80-120目筛，得到中药组合物粉末的步骤。本发明中所使用的药材均为净制后的药材。以上述中药组合物为活性成分制成的预防和/或治疗手足口病的药物也属于本发明的保护范围。通过上述过程制备得到的药液和药粉，直接或者加入辅料，可制成任何药学上可接受的剂型，例如合剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、丸剂、滴丸剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。以制备合剂为例，将本发明方法制备中药组合物药液加入适量矫味剂，调节pH值为4.5～7.0，并加水稀释至1000ml(含量0.233-2.092g生药/ml)，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得。用法与用量：口服。一岁以内一次2.5～5ml，一岁至三岁一次5～10ml，三岁至七岁一次10～15ml，七岁至十二岁一次15～20ml，一日3～4次。本发明提出的中药组合物，毒副作用小，能够有效地抑制手足口病病毒引起的细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒载量、减少或消除感染小鼠死亡、延长生存率等。该中药组合物弥补了现有药物在治疗或预防手足口病方面的空白与缺陷，具有广泛的应用前景。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的柴胡、黄芩、板蓝根、葛根、金银花、水牛角、连翘、大黄均符合《中国药典》(2015年版)一部正文各药材项下的有关规定。投料前，通过鉴定，各味药材实物与名称相符，质量符合标准。一、制剂实施例实施例1、制备中药组合物的合剂(口服液)取250g柴胡、137.5g金银花、150g连翘加入3225ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角62.5g加625ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(125g)、板蓝根(250g)、葛根(125g)、大黄(62.5g)四味加水6975ml共同煎煮两次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达65％，搅匀，静置48h，取上清液，回收乙醇，浓缩至适量，与挥发油合并，加入适量的蔗糖、甜菊素、山梨酸钾，调节pH值至7.0，加水至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得。性状：本品为红棕色的澄清液体；气香，味甜、微苦。实施例2、制备中药组合物的合剂(口服液)取200g柴胡、112.5g金银花、175g连翘加入2925ml水，浸渍20分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角50g加600ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(150g)、板蓝根(200g)、葛根(150g)、大黄(50g)四味加水8700ml共同煎煮两次，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达50％，搅匀，静置72h，取上清液，回收乙醇，浓缩至适量，与挥发油合并，加入适量的蔗糖、甜菊素、山梨酸钾，调节pH值至6.0，加水至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得。性状：本品为红棕色的澄清液体；气香，味甜、微苦。实施例3、制备中药组合物的合剂(口服液)取300g柴胡、175g金银花、112.5g连翘加入3525ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角75g加750ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(100g)、板蓝根(300g)、葛根(100g)、大黄(75g)四味加水6187.5ml共同煎煮1小时，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达80％，搅匀，静置24h，取上清液，回收乙醇，浓缩至适量，与挥发油合并，加入适量的蔗糖、甜菊素、山梨酸钾，调节pH值至6.5，加水至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得。性状：本品为红棕色的澄清液体；气香，味甜、微苦。实施例4、制备中药组合物的合剂(口服液)取125g柴胡、212.5g金银花、75g连翘加入412.5ml水，浸渍60分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角100g加1000ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(62.5g)、板蓝根(375g)、葛根(62.5g)、大黄(100g)四味加水6675ml共同煎煮两次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达65％，搅匀，静置48h，取上清液，回收乙醇，浓缩至适量，与挥发油合并，加入适量的蔗糖、甜菊素、山梨酸钾，调节pH值至5.0，加水至1000ml，混匀，静置，滤过，灌装，灭菌，即得。性状：本品为红棕色的澄清液体；气香，味甜、微苦。实施例5、制备中药组合物的合剂(口服液)取375g柴胡、62.5g金银花、225g连翘加入3975ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角25g加250ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(187.5g)、板蓝根(125g)、葛根(187.5g)、大黄(25g)四味加水7275ml共同煎煮两次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达75％，搅匀，静置48h，取上清液，回收乙醇，浓缩至适量，与挥发油合并，加入适量的蔗糖、甜菊素、山梨酸钾，调节pH值至7.0，加水至1000ml，混匀、静置，滤过，灌装，灭菌，即得。性状：本品为红棕色的澄清液体；气香，味甜、微苦。实施例6、制备中药组合物的糖浆剂取50g柴胡、37.5g金银花、275g连翘加入2175ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角112.5g加1125ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(225g)、板蓝根(50g)、葛根(225g)、大黄(12.5g)四味加水5925ml共同煎煮两次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达65％，搅匀，静置48h，取上清液回收乙醇，浓缩液加水适量，蔗糖600g，苯甲酸钠3g，煮沸使溶解，滤过，放冷，加入上述挥发油，搅匀加入适量的蔗糖，加水调整总量至1000ml，搅匀，即得。实施例7、制备中药组合物的颗粒剂取450g柴胡、250g金银花、25g连翘加入3625ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角12.5g加125ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(25g)、板蓝根(450g)、葛根(25g)、大黄(112.5g)四味加水8100ml共同煎煮两次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达65％，搅匀，静置24h，取上清液，回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.20～1.35(80℃)的清膏，干燥、粉碎，加蔗糖、糊精适量，混匀制成颗粒，干燥，喷入上述挥发油，混匀，即得1000g颗粒剂。实施例8、制备中药组合物的片剂取250g柴胡、137.5g金银花、150g连翘加入5375ml水，浸渍30分钟后，加热蒸馏2小时提取得到挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集。取水牛角62.5g加625ml水煎煮3小时后，再与上述柴胡等三味的药渣及其余黄芩(125g)、板蓝根(250g)、葛根(125g)、大黄(62.5g)四味加水6975ml共同煎煮两次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液与上述水溶液合并，浓缩至相对密度为1.20～1.25(85℃)，放冷，加乙醇使乙醇体积含量达65％，搅匀，静置48h，取上清液，回收乙醇，并浓缩成相对密度为1.15～1.35的稠膏，干燥、粉碎，得药物粉末(过100目筛)，将挥发油用淀粉吸附，并与上述药物粉末混匀，制粒，加硬脂酸镁，混匀，压片，包糖衣或薄膜衣，得片剂。二、药效实施例实施例9、本发明的中药组合物对EV71、CoxA16病毒体外抑制作用的考察1、实验材料1.1受试药物和试剂：本发明实施例1所制备的中药组合物合剂，用0.22μm的微孔滤膜滤过，放于4℃保存。阳性对照药物利巴伟林颗粒，购自四川百利药业有限责任公司，以培养基溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤，放于4℃保存。细胞培养基：DEME培养液加10％胎牛血清。1.2细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero)购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。1.3病毒：EV71和CoxA16购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)2、实验方法2.1细胞毒性试验将药物母液用培养液做1∶2～1∶256倍比稀释后，加到已长成单层的Vero细胞培养板中，100μL/孔，每个稀释度药液做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况(CPE)，确定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数(最大无毒浓度)，按Reed-Muench法计算50％细胞毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。2.2体外抗病毒药效试验(CPE法)取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养基，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，分别接种不同稀释度的肠道病毒液，每种毒株100μL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中吸附1h后，再加入相应稀释度的疏风解毒颗粒100μL/孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，并以利巴韦林为阳性对照。置37℃、5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，当病毒对照组细胞病变达到4时记录试验结果。细胞病变按6级标准判断，并按照Reed-Muench法计算50％抑制浓度(IC50)。治疗指数(TI)＝TC50/IC50。-：细胞生长正常，无病变出现；±：细胞病变少于整个单层的10％；1：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；2：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；3：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；4：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。3、实验结果实施例1制备的中药组合物合剂在体外对肠道病毒EV71株及CoxA16株致Vero细胞病变均具有明显的抑制作用。见表1。表1药物的体外抗肠道病毒作用实施例10、本发明的中药组合物对手足口病病毒感染BALB/c乳鼠的治疗保护作用1、实验材料1.1受试药物：本发明实施例1所制备的中药组合物合剂，用0.22μm的微孔滤膜滤过，存于西林瓶中，放于-40℃冰箱备用；体内实验根据3岁小儿临床用量(0.64g/kg)折合成小鼠高、中、低剂量分别为18.92，9.46，4.73g/kg(相当于等效剂量的2，1，0.5倍))按灌胃给药20mL/kg，体外试验前用高纯水配制成50g/L的母液，过滤除菌后备用，试验时按需要做倍比稀释。阳性对照药物利巴伟林颗粒，购自四川百利药业有限责任公司，体内实验根据3岁小儿临床用量(0.12g/kg)折合成小鼠等效剂量为1.26g/kg，按灌胃给药20mL/kg；体外试验前用高纯水配成50g/L母液，试验时做倍比稀释。1.2病毒：EV71和CoxA16购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)1.3动物：BALB/c乳鼠，3～5日龄，每窝8只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。2、实验方法BALB/c乳鼠按窝随机分为正常对照组、病毒对照组、利巴韦林对照组、本发明中药组合物高、中、低剂量组，每组4只，各给药组按剂量和20mL/kgig，1次/d，连续3d，正常对照组和病毒对照组给予蒸馏水；给药第4天除正常对照组外，其余各组ip手足口病病毒原液进行感染，0.4mL/只，每次给药或感染后均用75％乙醇喷洒乳鼠包裹垫料后，放回笼中与母鼠共同饲养，感染后每日观察乳鼠的生存状态，共观察14d，并根据下列标准评分，计算感染的严重程度0分：健康；1分：弓背、竖毛(长出毛后观察)、消瘦、活动减少等；2分：后肢力量减弱；3分：单侧后肢麻痹或瘫痪；4分：双侧后肢麻痹或瘫痪；5分：濒死或死亡。计算各组死亡率和生命延长率并用SPSS软件进行统计分析。死亡率＝死亡数/动物总数×100％；生命延长率＝(试验组存活天数－病毒对照组存活天数)/病毒对照组存活天数)×100％3、实验结果模型组在观察的14d内，动物均死亡或呈濒死状态，死亡率为100％，其感染程度积分、死亡率与正常组比较均具有显著性差异；利巴韦林治疗性给药后，动物出现消瘦、活动减少，后肢力量减弱，单侧后肢瘫痪或双侧后肢瘫痪的症状，有1只动物死亡，其感染程度积分、死亡率与模型组比较均具有显著性差异；采用本发明中药组合物进行治疗性给药后，其高、中、低剂量的死亡率分别为0，12.5％，25％，生命延长率分别为76.15％，50.58％，40.22％，本发明提供的中药组合物3个剂量组感染程度均明显减轻，其中高剂量组的感染程度和死亡率与模型组比较具有显著性差异。表2、药物对肠道病毒EV71感染BALB/c乳鼠感染程度的保护作用(n＝8)注：与模型组比较，a)P＜0.05，b)P＜0.01。表3、药物对肠道病毒EV71感染BALB/c乳鼠的保护作用(n＝8)注：与模型组比较，a)P＜0.05，b)P＜0.01。实施例11、本发明的中药组合物治疗手足口病的临床疗效观察1、诊断标准以《中医药治疗手足口病临床技术指南(2012年版)》为诊断标准，诊断为手足口病患者。临床表现为：口腔粘膜出现分散状疱疹，米粒大小，疼痛明显；手掌、脚掌或臀部出现米粒大小疱疹，疱疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；有些患儿先以发热起病，一般为38℃左右，有些患儿伴随有恶心、呕吐等反应。2、疗效标准临床痊愈：全身症状消失，皮疹愈合，实验室各项生化指标恢复正常；显效：全身症状好转，皮疹未完全愈合，实验室各项生化指标好转；有效：全身症状好转，皮疹未完全愈合，实验室各项生化指标基本无变化；无效：全身症状无好转或加重，实验室各项生化指标明显异常。3、给药方法(1)样品组：采用本发明实施例1制备的中药组合物合剂，用法用量：口服，一次10ml，一日3次，连续服用6天；(2)对照组：按说明书服用利巴韦林口服液，每次5ml，每天3次，连续服用6天，加强对症治疗，做好口腔护理，合并感染者给予头孢类药物进行抗菌治疗。4、应用结果a、各组患儿治疗后临床表现比较观察并记录各组患儿治疗后退热时间、手足疱疹消退时间、口腔溃疡愈合时间及平均住院时间，并行t检验，见表4。表4各组患儿治疗后临床表现比较(天，x±s)注：与对照组比较，**P＜0.05，*P＜0.01。b各组患儿治疗后临床效果比较记录各组患儿治疗后的临床效果，将显效和有效病例相加，计为总有效病例，见表5。表5各组患儿治疗后临床效果比较组别例数(例)显效有效无效总有效率样品组3018(60％)10(33％)2(7％)93％对照组3012(40％)12(40％)6(20％)80％由表5可见，本发明实施例1制备的中药组合物合剂的总有效率明显优于对照组。由表4及表5的数据可知，与利巴韦林相比，本发明实施例1所制备的中药组合物对手足口病的治疗效果更好。当前第1页1 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