二盐酸小檗胺在制备埃博拉病毒抑制剂中的应用的制作方法
本发明涉及二盐酸小檗胺的用途，特别涉及二盐酸小檗胺在制备埃博拉病毒抑制剂中的应用。
背景技术：
病毒性出血热是一组由病毒所引起的自然疫源性疾病，以发热、出血和休克为主要临床特征。此类疾病在世界上分布很广，临床表现多较严重，病死率很高，目前世界上已发现十多种。常见病毒性出血热包括埃博拉出血热、马堡出血热、拉沙热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热、登革出血热、黄热病及天花等。
埃博拉出血热(埃博拉病毒病)是由丝状病毒科的埃博拉病毒(ebolavirus，ebov)所引起的一种急性出血性传染病，死亡率高达90％，是人类最致命的病毒性传染病之一。ebov可以分为5个种:扎伊尔型(zaireebolavirus,zebov)、苏丹型(sudanebolavirus,sudv)、塔伊森林型(taiforestebolavirus,tafv)、本迪布焦型(bundibugyoebolavirus,bdbv)和莱斯顿型(restonebolavirus,restv)。其中，扎伊尔型埃博拉病毒致病力最强。
马尔堡出血热是由马尔堡病毒(marbergvirus,marv)引起的一种急性发热性疾病，有严重的出血表现。它和埃博拉出血热属于同一家族，都是高致死性传染病。马尔堡病毒和埃博拉病毒属于丝状病毒科(filoviridae)的丝状病毒属(filovirus)。
拉沙热是由拉沙病毒(lasv)引起，主要经啮齿类动物传播的一种急性传染病。拉沙病毒属于沙粒病毒科(arenaviridae)哺乳类沙粒病毒属(mammarenavirus)。
包膜糖蛋白(glycoprotein,gp)指由病毒自身编码的、包被在病毒外层的糖蛋白。gp是一种多功能蛋白质，在病毒的吸附和穿入宿主细胞、致病性、下调宿主细胞表面蛋白质表达和增加病毒装配和出芽过程中起着至关重要的作用。
目前对病毒性出血热主要采取对症和支持治疗，尚没有经系统临床验证有效的特异性治疗药物和疫苗。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何抑制埃博拉病毒、马尔堡病毒和/或拉沙病毒等引起病毒性出血热的病毒。
为了解决以上技术问题，本发明提供了二盐酸小檗胺的用途。
二盐酸小檗胺的结构式如图1所示，其cas登录号为6078-17-7。
本发明所提供的二盐酸小檗胺的用途为u1至u5中的任一种；
u1.二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐在制备病毒抑制剂中的应用；所述病毒可为能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒；
u2.二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐在抑制病毒中的应用；所述病毒可为能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒；
u3.二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防病毒性出血热产品(如药物、疫苗或药物制剂)中的应用；所述病毒性出血热可为由如下病毒所致疾病：能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒；
u4.二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐在治疗和/或预防病毒性出血热中的应用；所述病毒性出血热可为由如下病毒所致疾病：能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒；
u5.二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐在制备与病毒激活态的包膜糖蛋白结合的产品(如药物、疫苗或药物制剂)中的用途。
上述用途中，所述病毒可为丝状病毒科和/或沙粒病毒科的病毒，如引起病毒性出血热的病毒。所述引起病毒性出血热的病毒可为埃博拉病毒、马尔堡病毒和/或拉沙病毒。
上述用途中，所述病毒性出血热可为埃博拉出血热、马堡出血热和/或拉沙热。
上述用途中，所述病毒抑制剂、所述治疗和/或预防病毒性出血热产品和与病毒激活态的包膜糖蛋白结合的产品，除含有二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
本发明还提供了药用化合物。
本发明所提供的药用化合物为二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐。
上述药用化合物中，所述药用化合物可用于抑制病毒感染动物。所述病毒可为能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒。所述病毒可为丝状病毒科和/或沙粒病毒科的病毒，如引起病毒性出血热的病毒。所述引起病毒性出血热的病毒可为埃博拉病毒、马尔堡病毒和/或拉沙病毒。
本发明还提供了抑制病毒感染动物的方法。
本发明所提供的抑制病毒感染动物的方法，包括给受体动物施用二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐以抑制病毒感染动物；所述病毒可为能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒。进一步，所述病毒可为丝状病毒科和/或沙粒病毒科的病毒，如引起病毒性出血热的病毒。所述引起病毒性出血热的病毒可为埃博拉病毒、马尔堡病毒和/或拉沙病毒。
本发明还提供了治疗和/或预防病毒性出血热的方法。
本发明所提供的治疗和/或预防病毒性出血热的方法，包括给受体动物施用二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐进行治疗和/或预防病毒性出血热；所述病毒性出血热可为由如下病毒所致疾病：能通过激活态的包膜糖蛋白与二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐结合的病毒。
本发明中，所述动物可为哺乳动物，如人；所述动物还可为除哺乳动物以外的所述病毒感染的其他动物，如禽。
本发明中，术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，s.m.berge,etal.,j.pharmaceuticalsciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。
本发明中，所述埃博拉病毒可为扎伊尔型、苏丹型、塔伊森林型、本迪布焦型和/或莱斯顿型埃博拉病毒。
本发明中，所述抑制病毒也可称为抗病毒。所述抑制病毒可为抑制病毒侵入细胞。所述抑制病毒侵入细胞可为抑制病毒激活态的包膜糖蛋白(gpcl)介导的病毒进入细胞。
本发明以埃博拉病毒激活态的包膜糖蛋白(ebov-gpcl)为靶点，通过基于结构的虚拟筛选得到具有与ebov-gpcl结合能力的抗病毒的活性化合物，该化合物为二盐酸小檗胺。二盐酸小檗胺能够通过与靶蛋白ebov-gpcl结合从而特异性抑制埃博拉重组病毒的进入，达到抗埃博拉病毒感染的效应。二盐酸小檗胺抗ebov的半最大效应浓度(ec50)为0.49μm，说明二盐酸小檗胺对ebov具有较强的抑制作用。
附图说明
图1：二盐酸小檗胺的结构式。
图2：实施例1中二盐酸小檗胺对ebov-zairegp/hiv-luc重组病毒的进入具特异性抑制作用。图2中，vsvg表示vsv-g/hiv-luc，ebola-gp表示ebov-zairegp/hiv-luc，病毒感染率＝1-抑制率，dmso表示空白对照处理，tet表示粉防己碱处理，1-22分别表示22种化合物处理，其中10为二盐酸小檗胺处理。
图3：实施例2中细胞生长实验验证二盐酸小檗胺对293t细胞生长的影响。图3中，dmso表示空白对照处理，tet表示粉防己碱处理，eei-10表示二盐酸小檗胺处理。
图4：实施例3中二盐酸小檗胺对ebov-zairegp/hiv-luc重组病毒的抑制作用具有良好的剂量依赖性。
图5：实施例4中药物作用时间点实验表明二盐酸小檗胺作用于病毒的进入阶段。图5中，tet表示粉防己碱处理，eei-10表示二盐酸小檗胺处理，rt表示依法韦仑处理。
图6：实施例5中二盐酸小檗胺对marv-gp/hiv-luc重组病毒和lasv-gp/hiv-luc重组病毒均有抑制作用。
图7：生物膜层光学干涉技术体外测定不同浓度的二盐酸小檗胺与靶蛋白gpcl的动力学结合曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
二盐酸小檗胺为一种已知化合物，可购自市售产品，具体的获取手段为现有技术，本发明对此不作特别限定。下述实施例中的二盐酸小檗胺为targetmol公司产品。
下述实施例中的真核表达载体pcdna3.1(+)为invitrogen公司产品。
下述实施例中的携带荧光素酶报告基因的hiv-luc质粒pnl4-3luc(r-e-)(ma,l.,etal.(23may2018)."identificationofsmallmoleculecompoundstargetingtheinteractionofhiv-1vifandhumanapobec3gbyvirtualscreeningandbiologicalevaluation."scirep8(1):8067)，公众可以从中国医学科学院医药生物技术研究所获得该生物材料。该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
前人的研究表明埃博拉病毒包膜糖蛋白(ebov-gp)进入溶酶体后会发生酶切，酶切之后的激活态的包膜糖蛋白(primedgp,gpcl)可以和内吞体受体-人源胆固醇转运蛋白(niemann-pickc1，npc1)直接相互作用，从而引发病毒与宿主细胞内的膜融合过程。在本发明中，发明人根据ebov-gpcl(埃博拉病毒激活态的包膜糖蛋白)与npc1-c相互作用，采用全新药物设计方法设计合成与ebov-gpcl特异性结合并且能抑制埃博拉病毒进入细胞的活性多肽。发明人根据活性多肽与ebov-gpcl之间的氢键、静电相互作用和疏水相互作用等构建药效基团模型，建立了一个靶向ebov-gpcl的埃博拉病毒进入抑制剂的虚拟筛选方法，以期找到与ebov-gpcl特异性结合的小分子化合物，从而抑制ebov-gpcl与npc1-c的结合，进而抑制埃博拉病毒的复制。利用此模型对数据库进行筛选，经过多软件打分最终得到目标化合物，对其进行生物学活性检测，最终得到以ebov-gpcl为靶点抗病毒的活性化合物，该化合物为二盐酸小檗胺，其具有与ebov-gpcl结合的能力。
ebov被列为危险性四级病毒，因此本发明使用假病毒技术这种安全有效的研究手段对小分子化合物进行体外水平的生物学活性评价。利用毒性最强的扎伊尔型ebov的gp蛋白包裹hiv核心制备复制缺陷型假病毒ebov-gp/hiv-luc，通过荧光报告基因检测技术来判断样品的抗病毒活性。与此同时，采用vsvg/hiv-luc重组病毒模型分析小分子化合物的特异性。在排除细胞毒性后，采用药物作用时间点实验进一步验证小分子化合物的作用机制。最后利用基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉技术体外测定小分子化合物与靶蛋白gpcl的结合能力，验证小分子化合物的靶向性。具体实验方法和结果如下。
实施例1、ebov进入抑制剂筛选模型验证二盐酸小檗胺能够特异性抑制ebov活性。
利用细胞水平重组病毒技术，将zaire-ebov的gp与hiv核心质粒(pnl4-3.luc)共表达，制备重组病毒，应用靶向gp蛋白的ebov进入抑制剂的高通量筛选模型评价化合物的抗病毒活性。具体步骤为：
取293t细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25％胰酶和0.02％edta的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10％fbs(购自gibco)的高糖dmem培养基(gibico)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2×105个/ml，接种于6孔板，2ml/孔。24h后(细胞丰度约为70％)转染，质粒用量：2μgpzebov-gp与3μg携带荧光素酶报告基因的hiv-luc质粒pnl4-3luc(r-e-)，转染试剂为lipofectamine2000(invitrogen公司),根据使用说明书进行转染，产生埃博拉假型病毒，将该埃博拉假型病毒命名为ebov-zairegp/hiv-luc。在转染后48小时收集含有假型病毒的上清液，合并，通过低速离心从漂浮的细胞和细胞碎片中澄清，并通过0.45μm孔径的过滤器过滤。通过使用elisa测定法测量病毒相关的hivp24水平来定量假病毒颗粒。
其中，pzebov-gp是将zaireebolavirusisolateh.sapiens-wt/gin/2014/makona-gueckedou-c07的gp基因(genbankaccessionno.kj660347.2(updatedatedec18,201401:25pm)的第5900-8305位插入到载体pcdna3.1(+)得到的表达zaire-ebov的糖蛋白(gp)的重组表达质粒。
将ebov-zairegp/hiv-luc假病毒颗粒与293t细胞一起温育到96孔板中。48小时后，收集细胞并裂解以测量萤火虫萤光素酶活性。萤光素酶活性的值代表病毒感染。
将化合物用dmso溶解后分别与ebov-zairegp/hiv-luc假病毒混合加入到293t细胞中，使化合物含量为10μm。48小时后，裂解293t细胞，通过测量荧光素酶活性评估化合物对病毒的抑制率。以溶剂dmso为空白对照，同时引入ebov进入抑制剂粉防己碱(tetrandrine，tet)作为对照。粉防己碱用dmso溶解后与ebov-zairegp/hiv-luc假病毒混合加入到293t细胞中，粉防己碱的含量为1μm。48小时后，裂解293t细胞，通过测量荧光素酶活性评估化合物对病毒的抑制率。化合物对病毒的抑制率＝1-相对荧光素酶活性。相对荧光素酶活性是指相对于空白对照的荧光素酶活性。荧光素酶活性实际代表的就是病毒感染性。
目前已知的ebov抑制剂大多是广谱性抗病毒药物，为了寻找针对ebov的窄谱抑制剂，需要对筛到的活性化合物进行特异性分析。由于水泡性口膜炎病毒外壳糖蛋白(vesicularstomatitisvirusglycoprotein,vsvg)和ebov-gpcl作用相似，在病毒和受体的识别中发挥重要作用，因此使用表达vsvg的假病毒vsv-g/hiv-luc对化合物进行特异性分析。在排除细胞毒性因素后，同样利用荧光素酶原理检测化合物对vsv-g/hiv-luc假病毒的抑制活性，方法同上。若化合物只对ebov-gpcl介导的病毒进入有明显抑制作用，而对vsv没有抑制或抑制率很低，则说明此化合物对ebov具有特异性。
实验重复三次，结果如图2所示,化合物二盐酸小檗胺对ebov-zairegp/hiv-luc假病毒的抑制率高于80％，相同浓度下对vsv-g/hiv-luc假病毒几乎没有抑制作用。这说明二盐酸小檗胺对ebov-zairegp/hiv-luc假病毒具有特异性抑制作用。作为阳性对照的ebov进入抑制剂粉防己碱(tet)具有与二盐酸小檗胺相似的选择性抑制作用。
其中，表达vsv-gp的假病毒vsv-g/hiv-luc的制备方法与ebov-zairegp/hiv-luc的制备方法的区别仅在于将ebov-zairegp/hiv-luc的制备方法中的pzebov-gp替换为pvsv-gp，其它操作完全相同。pvsv-gp是将水泡性口膜炎病毒外壳糖蛋白gp基因(genbankaccessionno.v01214.1(updatedatefeb4,2011)的第14-1567位插入到载体pcdna3.1(+)得到的表达水泡性口膜炎病毒外壳糖蛋白的重组表达质粒。
实施例2、二盐酸小檗胺的抗病毒活性与其细胞毒性无关。
为了排除由于化合物毒性而产生的非特异性差异，采用细胞计数试剂盒-8(cellcountingkit-8，cck-8)评估二盐酸小檗胺对293t细胞生长的影响。
cck-8试剂盒是检测细胞增殖、细胞存活和细胞毒性的试剂盒，是一种基于wst-8(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒，为mtt法的替代方法，试剂盒中采用水溶性四唑盐-wst-8，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。通过酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。具体步骤为：
将293t细胞在96孔板中培养并与二盐酸小檗胺(用dmso溶解)孵育，二盐酸小檗胺在培养基中的含量分别为10μm、2.5μm、0.625μm。48小时后，细胞上清更换为含有10％cck-8试剂的细胞培养液，细胞在37℃、5％co2孵箱中继续培养1h。在微孔板读数器(thermo，varioskanflash)上记录450nm处每孔的光密度(od)值。
以粉防己碱(tet)作为对照，将293t细胞在96孔板中培养并与粉防己碱(用dmso溶解)孵育，粉防己碱在培养基中的含量分别为10μm、2.5μm、0.625μm。48小时后，细胞上清更换为含有10％cck-8试剂的细胞培养液，细胞在37℃、5％co2孵箱中继续培养1h。在微孔板读数器(thermo，varioskanflash)上记录450nm处每孔的光密度(od)值。
以溶剂dmso为空白对照(dmso)。将空白对照的od450nm记作细胞活力为100％。
实验重复三次。结果如图3所示，在最高浓度10μm(远远高于测得的ic50值)，二盐酸小檗胺对细胞活性均无明显影响。由此说明，二盐酸小檗胺的抗病毒活性与其细胞毒性无关。
实施例3、二盐酸小檗胺对ebov的抑制作用具有良好的剂量依赖性。
参照实施例1中的方法，将二盐酸小檗胺用dmso溶解后分别与实施例1中的ebov-zairegp/hiv-luc混合后加入到293t细胞中，使二盐酸小檗胺的含量分别为0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20μm。48小时后，裂解293t细胞，通过测量荧光素酶活性评估二盐酸小檗胺的抗ebov活性。以溶剂dmso为空白对照(dmso)，将空白对照的荧光素酶活性作为细胞存活力为100％。实验重复三次，结果如图4所示，二盐酸小檗胺呈剂量依赖性地显著抑制ebov-zairegp/hiv-luc假病毒活性。二盐酸小檗胺抗ebov的半最大效应浓度(ec50)为0.49μm。
实施例4、通过药物作用时间点实验确定二盐酸小檗胺作用于病毒的进入阶段。
二盐酸小檗胺对ebov-zairegp/hiv-luc假病毒的特异性抑制作用表明它们可能充当ebvo进入抑制剂。为了验证这点，通过药物作用时间点(timeofaddition，toa)实验研究二盐酸小檗胺在病毒感染周期中的作用阶段。具体步骤为：
感染前一天,将293t细胞按细胞数6×104个/孔接种到96孔板中,分别加入实施例1的ebov-zairegp/hiv-luc50μl感染细胞。在感染(-1小时)，感染期间(0小时)以及感染后于2、4、6、8、10、12、14和16h时间点加入二盐酸小檗胺(用dmso溶解，在培养基中的含量(终浓度)为1×10-5mol·l-1),以ebov进入抑制剂粉防己碱(tetrandrine，tet)(用dmso溶解，在培养基中的含量为1×10-7mol·l-1)、非核苷类逆转录酶抑制剂依法韦仑(efavirenz，efv)(用dmso溶解，在培养基中的含量为1×10-9mol·l-1)为对照，dmso为溶剂对照；感染48h后，检测报告基因荧光素酶活性反映重组病毒复制水平。
通过测定ebov单次感染时药物的失效时间可初步判断药物的作用环节。如图5所示，二盐酸小檗胺在病毒进入的早期表现出非常强的抑制作用，在病毒完成吸附过程之后对病毒感染无抑制作用。这与ebov进入抑制剂粉防己碱的作用时间一致。非核苷类逆转录酶抑制剂依法韦仑在6h时依然对病毒有抑制作用。这些结果表明二盐酸小檗胺是在病毒与宿主结合之后，病毒与宿主发生膜融合之前发挥作用。
实施例5、应用马尔堡重组病毒和拉沙重组病毒模型对化合物进行评价。
埃博拉病毒属于丝状病毒家族，基于重组病毒技术，建立了另外两株丝状重组病毒模型，分别是马尔堡重组病毒(表达marv-gp的假病毒marv-gp/hiv-luc)和拉沙重组病毒(表达lasv-gp的假病毒lasv-gp/hiv-luc)。其中，表达marv-gp的假病毒marv-gp/hiv-luc以及表达lasv-gp的假病毒lasv-gp/hiv-luc的制备方法均与ebov-zairegp/hiv-luc的制备方法的区别仅在于将ebov-zairegp/hiv-luc的制备方法中的pzebov-gp分别替换为pmarv-gp以及plasv-gp，其它操作完全相同。
pmarv-gp是将马尔堡病毒外壳糖蛋白gp基因(genbankaccessionno.nc_001608.3)(updatedate12-nov-2014)的第5941-7986位插入到载体pcdna3.1(+)得到的表达马尔堡病毒外壳糖蛋白的重组表达质粒。
plasv-gp是将拉沙病毒外壳糖蛋白gp基因(genbankaccessionno.j04324.1)(updatedatejun23,2010)的第1872-3347位插入到载体pcdna3.1(+)得到的表达拉沙病毒外壳糖蛋白的重组表达质粒。
参照实施例3的方法，应用marv-gp/hiv-luc和lasv-gp/hiv-luc重组病毒模型测定二盐酸小檗胺抗马尔堡病毒和拉沙病毒的半最大效应浓度。如图6所示，二盐酸小檗胺可抑制马尔堡病毒和拉沙病毒进入宿主，ec50分别为0.99μm和2.64μm。本研究提示，二盐酸小檗胺具有广谱抗病毒作用。通过蛋白序列比对结果可见，两株埃博拉病毒与马尔堡病毒gp蛋白的序列同源性仅为23％。应用多株病毒模型评价化合物将有利于广谱抗病毒药物的发现，并将有助于药物的作用机制研究。
实施例6、采用生物膜层光学干涉技术体外测定二盐酸小檗胺与靶蛋白gpcl的结合能力。
埃博拉病毒囊膜表面糖蛋白gp在内吞体里经过宿主蛋白酶cathepsin的酶切处理，变成激活态糖蛋白gpcl，暴露出受体结合位点。为了验证二盐酸小檗胺是通过与靶蛋白gpcl结合从而特异性抑制病毒的进入，利用基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉(biolayerinterferometry,bli)技术体外测定二盐酸小檗胺与靶蛋白gpcl的结合能力。bli技术能够实时跟踪生物分子间的相互作用，是研究蛋白质和其它生物分子相互作用的理想选择。具体步骤为：
由于实验选用superstreptavidin(ssa)生物传感器，首先需要对靶蛋白gpcl进行生物素化处理。将生物素(ez-linktmnhs-lc-lc-biotin，cat.#21343,thermoscientifictm)与纯化后的靶蛋白gpcl按摩尔比3:1进行混合，室温反应1小时后过脱盐柱(zebatmspindesaltingcolumns，cat.#89883,thermo)除去未反应的生物素，得到生物素化的靶蛋白gpcl。
结合实验采用octetred96(fortebio，inc.，ca，usa)仪器，主要通过以下步骤进行实验：1)检测基线将ssa传感器浸没在缓冲溶液中静置120s以达平衡；2)将生物素化的靶蛋白gpcl孵育到传感器上将传感器探针移动到生物素化后的gpcl蛋白溶液(50μg/ml)中静置600s，使蛋白固定在ssa传感器上；3)封闭传感器将传感器移动到含5μm生物胞素(ez-
图7中的横坐标为反应时间，单位为秒。纵坐标为gpcl与化合物二盐酸小檗胺的相互作用的信号强度，单位为nm。结果表明二盐酸小檗胺能够与gpcl蛋白结合。
虽然本发明以ebvo为例具体说明本发明技术方案的抗病毒机理，但本发明对二盐酸小檗胺或其药学上可接受的盐的用途的保护范围并不限于ebov。任何适用上述抗病毒机理的病毒均在本发明所述病毒的范围之内，例如可以是ebov的其他四种亚型以及马尔堡病毒(marburgvirus,marv)、拉沙病毒(lassavirus,lasv)等其它丝状病毒。
以上对本发明进行了详述。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
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