宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用。

背景技术

肺纤维化是一种以肺部永久性损伤为特征的、并伴随着高死亡率的严重疾病，通常是由于严重的外部创伤、自发免疫反应或药物不良副反应等因素引起肺的永久性损伤。研究表明，肺纤维化的进程大致分为以下3个阶段：第一阶段，肺脏受到损伤或其他有害刺激，成纤维细胞的细胞外基质(ecm)使细胞被活化；第二阶段，活化的ecm使细胞发生结构和表型的改变，产生大量ecm，胞内的促分裂素原活化蛋白激酶和核转录因子通路被激活，同时t细胞被激活，产生各种细胞因子；第三阶段，损伤因素持续存在，成纤维细胞继续被激活，产生更多的ecm，细胞因子持续不断的引起组织炎症和胶原过度表达，ecm不断沉积，肺纤维化逐渐形成，最终导致特发部位肺功能丧失^[1]。

肺纤维化发病过程是一个复杂的病理过程，且有多种细胞及细胞因子参与。tnf-α(肿瘤坏死因子)是临床检验肺纤维化的一个重要指标；研究发现，在纤维化的肺部组织中，tnf-α的mrna水平显著高于正常肺组织^[2]，抑制tnf-α的合成及功能可减轻或调节肺纤维化进程，延缓进入肺纤维化急性期。也有研究表明，il-6(白细胞介素-6)能促进肺纤维化的发生，il-6的表达增加可引起严重的炎症反应，导致肺组织的某些区域结构被破坏，造成严重损伤，ecm不断沉积，逐渐形成肺纤维化。而il-10(白细胞介素-10)则能抑制肺纤维化，il-10可减少由tgf-β刺激产生的ⅰ型胶原的表达，从而阻止博来霉素诱导的肺纤维化进程。

近些年，虽然随着技术手段的进步，肺纤维化机制和治疗药物的研究取得一定进展，但是发病机理尚未完全阐释清楚，并且缺乏有效的治疗方法。有学者指出，在损伤-炎症-修复三期过程中，任何一项或多项过程的失调，均可以导致肺纤维化的发生，提示我们可通过干预以上过程来预防纤维化的形成^[3]。目前，肺纤维化的主要治疗策略有抗炎、抗纤维化和抗氧化等，治疗手段主要有药物治疗和手术治疗等。但是，药物治疗具有较大的副作用；而肺移植作为目前治疗肺纤维化最有效的手段，由于捐献器官资源缺乏、排斥反应、感染、并发症和费用昂贵等缺陷，限制了其应用。

最近有文献报道脐带间充质干细胞、胚胎干细胞等治疗可改善博来霉素诱导的肺纤维化症状，但目前尚无报道：宫内膜干细胞在预防或治疗肺纤维化中的应用。

参考文献

[1]潘有禄，黄文海，沈正荣等.肺纤维化发生机制及治疗研究进展[j].中国药学杂志.2012,47(23):1873-76.

[2]higginsdf，kimurak，bernhardtwm，etal.hypoxiapromotesfibrogenesisinvivoviahif-1stimulationofepithelial-to-mesenchymaltransition[j].jclininvest.2007,117(12):3810-20.

[3]wilsonms,wynnta.pulmonaryfibrosis:pathogenesis,etiologyandregulation.[j].mucosalimmunol.2009,2(2):103-21.

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用，宫内膜干细胞可明显改善肺纤维的现象。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：宫内膜干细胞(emsc)在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用。

另外，本发明还提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，其包含宫内膜干细胞。

作为上述技术方案的改进，药物组合物中所述宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁵～5.0×10⁶个/ml。优选地，药物组合物中所述宫内膜干细胞的密度为2.0×10⁵～2.0×10⁶个/ml。

作为上述技术方案的进一步改进，药物组合物中所述宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁶个/ml。

作为上述技术方案的进一步改进，药物组合物的溶剂为氯化钠水溶液。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.8％～1.0％。

作为上述技术方案的更进一步改进，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

作为上述技术方案的改进，所述宫内膜干细胞取自于原代培养至传代第十二次培养的宫内膜干细胞。

另外，本发明还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，培养宫内膜干细胞；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

另外，本发明还提供一种包含所述的药物组合物的药物制剂，所述药物制剂还包含药学上可接受的辅料，所述药物制剂的剂型是静脉注射的溶剂或腹腔注射的溶剂。

在上述技术方案中，“药学上可接受的辅料”包括任何和所有生理上相容的抗细菌、抗真菌剂，以及含少量的能提高货架期或有效性的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

本发明的有益效果在于：本发明提供宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用，宫内膜干细胞能下调肺组织中α-sma、collagen、il-6的表达水平，上调肺组织中il-10的表达水平；同时，还下调脾组织tnf-α的表达水平；宫内膜干细胞能明显改善肺纤维化现象。

附图说明

图1显示肺组织的he染色结果；

图2显示α-sma的表达水平；图2a为α-sma的免疫印迹图谱，其中β-tublin(微管蛋白)作为对照；图2b定量统计α-sma的表达量；

图3定量统计collagen、il-6、il-10和tnf-α的表达量；图3a定量统计collagen的表达量；图3b定量统计il-6的表达量；图3c定量统计il-10的表达量；图3d定量统计tnf-α的表达量。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括原代培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁵个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例2

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括原代培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁶个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例3

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括原代培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为5.0×10⁶个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例4

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第六次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁵个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.8％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例5

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第六次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁶个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例6

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第六次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为5.0×10⁶个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为1.0％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例7

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第十二次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为1.0×10⁵个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例8

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第十二次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为2.0×10⁵个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例9

本实施例提供一种用于预防或治疗肺纤维化的药物组合物，药物组合物包括传代第十二次培养的宫内膜干细胞和氯化钠水溶液，药物组合物中宫内膜干细胞的密度为2.0×10⁶个/ml；氯化钠水溶液中氯化钠的质量体积比为0.9％。

本实施例还提供所述药物组合物的制备方法，其包括以下步骤：

s1)将氯化钠加入水中溶解，并进行除菌，即得氯化钠水溶液；

s2)在无菌条件下，将宫内膜干细胞(emsc)接种于10cm细胞培养皿，并将培养皿置于37℃、co2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；当宫内膜干细胞的密度达到80％～100％(优选为90％～95％)时，用用胰蛋白酶消化，并收集宫内膜干细胞；

s3)在无菌条件下，将收集的宫内膜干细胞悬于氯化钠水溶液中，分装至1ml注射器备用；宫内膜干细胞与氯化钠水溶液混合时的温度为20～26℃。

实施例10药物组合物对博来霉素诱导的肺纤维化的治疗作用

1实验材料

1.1实验动物

c57bl/6小鼠：spf级、6～8周龄、雄性；购买于广东省实验动物中心，合格证号为：no.44007200042765。

1.2治疗组合物

取实施例5的药物组合物。

1.3主要试剂

博来霉素(bleomycin，国药集团药业股份有限公司)；emsc培养基(杭州易文赛生物技术有限公司)；氯化钠(美国sigma公司)；磷酸盐缓冲液(pbs，美国gibco公司)；二甲基亚砜(美国gibco公司)；bca蛋白浓度测定试剂盒(beyotimebiotechnology)；抗α-sma抗体(英国abcam公司)；抗β-tubulin抗体(美国cst公司)；二抗(山羊抗兔，美国cst公司)；primerscript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser反转录试剂盒(大连宝生物有限公司)；premixextaq^tmii(大连宝生物有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

1.4主要仪器

超净工作台、co2培养箱(美国thermo公司)；倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)；低速离心机、高速离心机(德国eppendorf公司)；chemidoc^tmtouchimagingsystem、电泳装置(美国bio-rad公司)；荧光定量pcr仪(美国应用生物系统公司)。

2方法

2.1肺纤维化模型的建立、分组及干预

取6～8周龄雄性c57bl/6小鼠17只，其中12只给予腹腔注射1.5μg/ml博来霉素，每周1次，连续给药3周后建立肺纤维化小鼠模型；另外5只作为对照组给予腹腔注射生理盐水。12只给予腹腔注射1.5μg/ml博来霉素的小鼠于第一次给药3天后随机分成模型组和emsc组，每组6只，emsc组给予尾静脉注射药物组合物，对照组和模型组给予尾静脉注射灭菌的0.9％氯化钠水溶液，每周干预1次，连续干预3周；并于第21天颈椎脱臼处死后取材用于以下实验。

2.2蛋白免疫印记

2.2.1蛋白提取及定量

取肺组织进行组织研磨提取总蛋白，加入适量裂解液(含1％pmsf)，冰上孵育30分钟；12000rpm冷冻离心30分钟，将上清液转移至新的离心管；取2μl进行蛋白定量，其余蛋白加入适量的loadingbuffer，混匀后至于100℃中加热变性5分钟，-20℃保存。

蛋白定量过程如下：用裂解液50倍稀释待测样品，取100μl加入96孔细胞培养板，按照bca法蛋白浓度测定试剂盒说明书，分别取a液、b液(a液和b液比例为1：50)于离心管中，用移液器轻轻吹打均匀后配成混合液，在上述加样孔中每孔加100μl混合液；盖上薄膜，37℃水浴孵育30分钟，于酶标仪570nm波长下检测吸光度值；根据吸光度值绘制标准曲线并计算各待测样品的蛋白浓度。

2.2.2蛋白电泳及免疫印迹

配制10％分离胶，待分离胶凝固后配制浓缩胶，加至分离胶上层，插入梳子，待胶体凝固后轻轻把梳子拔出；在10％sds-page各孔分别加入蛋白marker和样品，80v电泳30分钟后，120v电泳1.5小时；在恒压100v室温条件下转膜(硝酸纤维素膜)90分钟；取下膜，标记正反面后用5％bsa室温封闭2小时；用1×tbs-t清洗3次，每次5分钟；根据抗体说明书用5％bsa稀释至工作浓度，与硝酸纤维素膜4℃杂交过夜；用1×tbs-t清洗3次，每次5分钟；1：1000稀释二抗后室温杂交1小时；用1×tbs-t清洗3次，每次5分钟；曝光；扫描并用软件imagej(v1.45)计算各组蛋白条带灰度值。

2.3实时荧光定量pcr

2.3.1总rna提取及反转录

取少量组织，研磨后加入适量的trizol裂解；室温下放置3分钟，待液化后将裂解液移至干净的无酶微量离心管中。加入预冷的三氯甲烷0.2ml，迅速用力上下颠倒混匀，冰上静置5分钟，使蛋白复合体全部裂解，离心(4℃，13000g，15分钟)。吸取上层水相，转移到另一个无酶离心管中，加入400μl异丙醇，迅速用力上下颠倒混匀，-20℃静置30分钟，沉淀rna。离心(4℃，13000g，10分钟)，管底可见少许白色沉淀，去上清，加入1ml的70％乙醇，上下颠倒混匀后洗涤去杂，冰上放置5分钟。离心(4℃，7600g，5分钟)，尽量吸干乙醇，室温下干燥5分钟，待残余的乙醇挥发完全至rna沉淀透明，最后加入30μl无核酸酶水，溶解rna。取1μlrna测定rna浓度及纯度，260/280比值介于1.8～2.0之间表明rna质量良好，然后根据反转录试剂盒说明书中的程序进行cdna的合成，用作实时荧光定量pcr的模板。

2.3.2实时荧光定量pcr

在15μl的实时反应体系中含有：3μl的sybrgreen(5×)，上下游引物的各0.6μl(10μmol/l)，1：15稀释的cdna1.5μl，9μlh2o，0.3μlrox。在荧光定量pcr仪内扩增40个循环，变性、退火、延伸所需温度、时间分别为95℃，30s；60℃，30s；72℃，90s。每个样品重复测定3次。mrna的相对量用ct值表示，平均相对表达量通过2^－△△ct计算方法分析；所用引物序列如表1所示，表1中β-actin仅作为对照。

表1

2.4肺组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色

取材后，肺组织用10％甲酸固定，常规脱水，石蜡包埋，制作蜡块，用石蜡切片机进行石蜡样本的切片，厚度为3.5μm，连续切片，染色程序为烤片干燥20分钟，二甲苯2次×10分钟，无水乙醇2次×2分钟，95％乙醇1分钟，80％乙醇1分钟，70％乙醇1分钟，水洗1分钟，苏木素8分钟，苏木素10分钟，水洗2次×1分钟，0.5％盐酸酒精10秒，水洗10分钟，伊红2分钟，水洗1分钟，80％、85％、90％乙醇各5秒，95％乙醇1分钟，无水乙醇2次×2分钟，无水乙醇3分钟，二甲苯2次×2分钟，结束染色后直接中性树胶封片，镜检。

2.5统计学方法

图片数据应用imagej软件进行处理分析，其他数据应用统计软件spss17.0进行统计处理分析，p＜0.05差异具有统计学意义。

3结果

3.1药物组合物对肺组织纤维化情况的影响

如图1所示，he染色结果显示，对照组小鼠肺组织结构清晰，未见肺泡间隔增宽；模型组小鼠肺组织结构破坏严重，部分肺泡融合，肺泡间隔明显增厚，肺间质内出现大量宽带状及片状胶原纤维，呈弥漫性肺纤维化；emsc组小鼠肺组织仍有纤维化形成，但纤维化程度明显比模型组减少，且未见弥漫性纤维化，病变部位呈局灶性分布。

3.2药物组合物对肺组织α-sma表达的影响

如图2所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织纤维化标志物α-sma蛋白表达水平显著升高(p＜0.01)，说明小鼠肺纤维化模型成功建立；与模型组比较，emsc组小鼠整体肺组织α-sma蛋白表达水平显著下降(p＜0.05)，表明本发明药物组合物可有效缓解肺纤维化。

3.3药物组合物对肺组织纤维化相关基因及脾组织tnf-α表达的影响

如图3所示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中胶原蛋白(collagen)的mrna表达水平显著升高(p＜0.05)，与模型组比较，emsc组小鼠整体肺组织胶原的mrna表达水平显著下降(p＜0.05)，表明emsc组合物可有效缓解肺纤维化。此外，与模型组比较，emsc组小鼠肺组织il-6表达显著下调(p＜0.05)，且il-10表达显著上调(p＜0.05)，同时脾组织tnf-α的mrna表达水平显著下调(p＜0.01)，表明本发明的药物组合物在治疗肺纤维化炎症过程发挥着重要的作用；其中，cd3和β-actin作为内参，图3未示出。

另外，本发明其他实施例的药物组合物也能取得类似的实验效果。

4结论

博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型通过本发明药物组合物干预处理，可显著改善肺纤维化症状：1)明显改善肺纤维化现象，具体表现为下调肺组织中α-sma蛋白和collagen的表达水平，2)在治疗肺纤维化炎症过程发挥着重要的作用，具体表现为下调肺组织中il-6及上调il-10的表达水平，及下调脾组织中tnf-α的表达水平。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110>南方医科大学

<120>宫内膜干细胞在制备用于预防或治疗肺纤维化药物的应用

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