一种褪黑素神经导管组合物、神经导管及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物材料领域，具体地说，是一种褪黑素神经导管、制备方法及其应用。
背景技术：
各种生物医用导管，目前包括降解和非降解的导管，如聚乙烯管就曾经被用来做神经导管研究神经再生情况，由于导管的不降解，神经再生完成后，导管如果不处理，可能造成组织纤维化，引起炎症等毒副作用，临床应用效果不是十分理想。目前发展到各种生物可降解材料制备各种生物医用导管，如胶原蛋白、聚乳酸等，但是由于这些材料单独使用也存在一些问题如，强度、神经再生的速度以及毒副作用等缺点。到最近发展到对这些导管进一步研究，如在导管的表面或内部进行各种有利于体内各种腔道损伤的再生，如在导管的表面进行细胞修饰、载各种促进腔道生长的活性物质，如神经导管的神经生长因子、血旺细胞等。静电纺丝是在盛有聚合物溶液的毛细管施加高压直流电源，在电场的作用下，毛细管末端悬挂的液滴发生变形，形成taylor锥体，当施加的电场超过某一临界值时，电场力克服溶液的表面张力，形成较细的表面带电的射流，射流在电场的作用下，向接地的收集器运动，在运动过程中，射流不断地拉伸，某些情况射流会发生分裂，分裂成更细的射流，同时溶剂不断挥发，最后在收集器上得到直径为几微米到几十纳米，甚至几纳米的纤维。通过静电纺丝制备的神经导管支架材料不仅可以模拟细胞外基质中的胶原纤维结构，而且具有高孔隙率和比表面积，有利于细胞黏附、生长和增殖。神经导管尽管已经取得一定的研究进展，如中国发明专利cn100479785c公开了一种制备神经导管的方法，但是与自体神经修复还存在一定的距离。另外还有多个专利公开了不同的制备方法(如中国发明专利cn101439205a，公开日2009.5.27；cn101507842a，公开日2009.8.19、cn106668938a，公开日2017.05.17；cn106924820a，公开日2017.07.07)，但是这些导管要么存在强度、毒副作用、质量控制或成本等问题。中国专利2010800025691公开了用于制备三维多孔管状支架的方法及设备，具体公开3d管状支架可以由非生物可降解聚合物、生物可降解聚合物或者其组合来制造，生物可降解聚合物包括，例如，聚乳酸(pla)、聚乙醇酸(pga)等，3d管状支架可加入激素，激素的实例有褪黑素等，3d管状支架也可以用作外周神经导管来引导受损的神经再生；该专利虽然公开采用褪黑素和聚乳酸制备神经导管，但未公开褪黑素促进神经修复作用。现有技术公开的神经导管，都不具有理想的生物医学导管。理想的导管应该具有：具有足够的强度、弹性、硬度等；可降解性且在体内等到所损伤的组织再生完全，而完全降解，不需要再次进行手术取出；材料尽量无毒副作用；合适降解周期；能引导组织朝合适的方向生长；有防止不需要的组织再生等。技术实现要素：本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种褪黑素神经导管。本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种制备褪黑素神经导管的组合物。本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述的组合物在制备生物材料中的应用。本发明的第四个目的是针对现有技术中的不足，提供褪黑素在制备生物材料中的应用。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种褪黑素神经导管，所述褪黑素神经导管采用如下方法制备：取生物降解材料重量百分比90-99.5％、褪黑素重量百分比0.5-10％，将生物降解材料用3-6倍重量的有机溶剂溶解，然后加入褪黑素充分混匀，注入注射仪，利用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到不断转动的棒状模具上，成管后将神经导管从模具脱下，烘干挥发溶剂，切割成不同长度规格的褪黑素神经导管；所述生物降解材料为聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚己内酯、丝蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖中的一种或多种的组合；所述有机溶剂为二氯甲烷或乙酸乙酯。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种制备褪黑素神经导管的组合物，由生物降解材料和褪黑素组成，重量百分比为：生物降解材料90-99.5％、褪黑素0.5-10％；所述生物降解材料为聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚己内酯、丝蛋白、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖中的一种或多种的组合。在上述制备褪黑素神经导管的组合物中，作为一个优选方案，重量百分比为：生物降解材料95-99％、褪黑素1-5％；所述褪黑素是指单层褪黑素、多层褪黑素或单层和多层褪黑素混合物。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：如上任一所述的组合物在制备生物材料中的应用，所述生物材料用于神经损伤后促进外周神经再生。在上述具体应用中，作为一个优选方案，所述生物材料具体指神经导管。本发明还提供一种褪黑素神经导管，利用上述任一所述的组合物进行3d打印或静电纺丝制备褪黑素神经导管，包括如下步骤：制备生物降解材料和褪黑素混悬液或把褪黑素加入熔融的生物降解材料里混匀得混和物；将上述混悬液或混和物加入到3d打印或静电纺丝设备中，进行打印或静电纺丝制备成所需要的导管；在上述褪黑素神经导管中，作为一个优选方案，还包括如下步骤：将制备的导管进行内部打印或静电纺丝一层生物粘附物质，并进行交联固化；所述生物粘附物质是指多巴胺、生物粘附肽、细胞外基质中的任意一种或他们任意混合物。在上述褪黑素神经导管中，作为一个优选方案，所述导管外表面的平均孔径为0.01至10μm，导管内生物粘附层的平均孔径为10-1000μm。为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：褪黑素在制备生物材料中的应用，所述生物材料用于神经损伤后促进外周神经再生。在上述具体应用中，作为一个优选方案，所述生物材料具体指神经导管。本发明优点在于：1、提供了一种具有生物学所需要的导管支架，并有理想的生物医学功能材料。2、具有足够的强度、弹性、硬度、可降解性，移植后在体内等所损伤的组织再生完全，神经导管完全降解，不需要再次进行手术取出；3、大鼠坐骨神经缺损修复实验显示，本发明的褪黑素神经导管可促进神经再生，提高再生神经成熟度和发挥作用的神经纤维数，提高大鼠坐骨神经功能指数，促进坐骨神经功能恢复正常，且效果优于自体神经移植修复，具有很好的应用前景。附图说明附图1为本发明实施例制备的神经导管形貌图。附图2为纯pla导管再生神经透射电镜检测结果图。附图3为自体神经移植的再生神经透射电镜检测结果图。附图4为1％的褪黑素和pcl组合物制备神经导管组再生神经透射电镜检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1神经导管生物降解材料组合物取聚乳酸重量比99％，褪黑素重量比1％，将聚乳酸用3-6倍重量的二氯甲烷溶解，然后加入褪黑素充分混匀，制备神经导管生物降解材料组合物。实施例2神经导管生物降解材料组合物取聚乳酸-聚羟基乙酸重量比99.5％，褪黑素重量比0.5％，将聚乳酸-聚羟基乙酸用3-6倍重量的乙酸乙酯溶解，然后加入褪黑素充分混匀，制备神经导管生物降解材料组合物。实施例3神经导管生物降解材料组合物取聚己内酯重量比98％，褪黑素重量比2％，将聚己内酯用3-6倍重量的二氯甲烷溶解，然后加入褪黑素充分混匀，制备神经导管生物降解材料组合物。实施例4神经导管生物降解材料组合物取聚乳酸重量比95％，褪黑素重量比5％，将褪黑素加入到熔融的聚乳酸中充分混匀，制备神经导管生物降解材料组合物。实施例5神经导管生物降解材料组合物取聚乳酸-聚羟基乙酸重量比90％，褪黑素重量比10％，将褪黑素加入到熔融的聚乳酸-聚羟基乙酸中充分混匀，制备神经导管生物降解材料组合物。实施例6神经导管的制备取实施例1-5任一所述的生物降解材料组合物制备导管，采用常规的静电纺丝技术制备各种需要的导管；或者采用3d打印技术，打印各种导管；或者采用导管模具制备各种所需要的导管。如3d打印的和1％的褪黑素pcl神经导管具有良好神经再生性能如弹性模量比纯pcl打印要好(分别是48.32和31.77mpa)等。实施例7神经导管的制备在实施例6的神经导管基础上，进行内部打印或静电纺丝一层生物粘附物质，并进行交联固化。生物粘附物质可以是多巴胺、生物粘附肽或细胞外基质中的任意一种，或他们任意比例混合。实施例8神经导管的制备利用实施例1的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取神经导管生物降解材料组合物，除泡后取100ml注入注射仪中以流量10ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为800rpm、直径为3mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转5-10h，使溶剂挥发。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例9神经导管的制备利用实施例1的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取聚乳酸重量比99％，多巴胺重量比1％，将聚乳酸用3-6倍重量的二氯甲烷溶解，然后加入多巴胺充分混匀，得混合物。将混合物除泡后取10ml注入注射仪中以流量10ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为800rpm、直径为3mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转5-10h，使溶剂挥发。取神经导管生物降解材料组合物，除泡后取100ml注入注射仪中以流量10ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为800rpm棒状模具管体表面，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例10神经导管的制备利用实施例2的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取神经导管生物降解材料组合物除泡后取100ml注入注射仪中以流量5ml/h的速度输出,使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm、直径为5mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以10cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例11神经导管的制备利用实施例2的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取聚乳酸-聚羟基乙酸重量比99.5％，生物粘附肽重量比0.5％，将聚乳酸-聚羟基乙酸用3-6倍重量的乙酸乙酯溶解，然后加入生物粘附肽充分混匀，得混合物。将混合物除泡后取10ml注入注射仪中以流量5ml/h的速度输出,使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm、直径为5mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以10cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。取神经导管生物降解材料组合物，除泡后取100ml注入注射仪中以流量5ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm棒状模具管体表面，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以10cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例12神经导管的制备利用实施例3的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取神经导管生物降解材料组合物，除泡后取100ml注入注射仪中以流量15ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm、直径为5mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例13神经导管的制备利用实施例3的生物降解材料组合物制备导管，具体步骤如下：取聚己内酯重量比98％，多巴胺重量比2％，将聚己内酯用3-6倍重量的二氯甲烷溶解，然后加入多巴胺充分混匀，得混合物。取混合物除泡后取10ml注入注射仪中以流量15ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm、直径为5mm的棒状模具上，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。取神经导管生物降解材料组合物，除泡后取100ml注入注射仪中以流量15ml/h的速度输出，使用静电纺丝工艺成管，通过直流电压喷射到转速为1000rpm棒状模具管体表面，电压20kv，接收距离20cm。静电纺丝喷头在水平方向上以15cm/min速度往返运动，成管长度15-20cm。溶液喷射完后棒状模具继续旋转，使溶剂挥发。将神经导管从模具脱下，烘干完全挥发溶剂，将神经导管切成不同长度规格。实施例14动物实验将上述实施例8制备的神经导管植入大鼠的坐骨神经(修复15mm的损伤)，如图1所示选取1％褪黑素的pcl材料的导管。如图2-4所示，髓鞘厚度是反映再生神经成熟的重要指标，图中结果显示，在术后第12周，1％的褪黑素和pcl组合物制备神经导管髓鞘厚度大于纯pla导管组和自体神经移植组，表明本发明的神经导管具有显著的促进神经再生作用，效果优于自体神经和纯pcl导管。实施例15动物实验健康成年雄性sd大鼠30只，按照随机数字表法分为a、b两组，每组15只。所有大鼠右侧为实验侧，左侧为正常对照侧。氯胺酮腹腔注射麻醉下，大鼠右股后外侧行纵形切口，自肌间隙进入显露坐骨神经。于大腿中段切取坐骨神经干10mm，a组用自体神经行原位神经移植；b组用实施例9制备的神经导管桥接修复，两神经断端各插入导管内1mm，保留神经缺损10mm间隙，以9-0丝线缝合管壁与神经外膜，每端3-4针。术后分笼饲养。第4、6、8、10周检测各组大鼠坐骨神经功能指数(sfi)值，sfi在接近0表示坐骨神经功能正常，当sfi值在-100表示坐骨神经功能完全丧失。按照sfi公式进行计算：sfi＝-38.3(epl-npl)/npl+109.5(ets–nts)/nts+13.3(eit-nit)/nit-8.8(e：experimental试验侧足；n：normal正常侧足)。结果如下表所示。术后第二周，两组sfi值比较无显著性差异(p>0.05)，从第8周开始，两组sfi值显示显著性差异，b组sfi值与a组比较显著提高，表明本发明的神经导管可显著促进坐骨神经功能恢复正常。表1术后两组坐骨神经功能指数sfi比较术后时间a组b组2周-87±2.90-85±2.904周-74±2.65-70±2.456周-65±2.40-59±2.308周-51±2.35-43±2.2510周-48±2.25-35±2.10第12周于坐骨神经远端吻合口2mm处切取再生神经，用4％戊二醛固定，1％锇酸固定，包埋，切片，染色，在透射电镜下观察截面左上、左下、正中、右上、右下五处单位视野，统计髓神经纤维数，测量轴突直径和髓鞘厚度。结果如下表所示。轴突直径和髓鞘厚度是神经成熟的主要形态学标志，再生神经内有较成熟的髓神经纤维为有效再生。从表中的结果可以看出，b组在再生神经纤维数、轴突直径和髓鞘厚度方面显著高于a组，表明本发明的神经导管可促进神经再生，提高再生神经成熟度和发挥作用的神经纤维数。表2术后12周两组再生神经纤维数、轴突直径和髓鞘厚度比较神经纤维数轴突直径(μm)髓鞘厚度(μm)a组225.1±13.53.61±0.641.21±0.08b组242.7±15.2*4.28±0.76*1.36±0.06*注：*表示与a组比较，p＜0.05。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页12