专利名称：改善内源性褪黑素分泌规律用功能食品和改善昼夜节律用功能食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及改善内源性褪黑素分泌规律用功能食品和改善昼夜节律用功能食品，其可改善睡眠障碍和入眠潜时延迟；本发明还涉及一种用于前述功能食品的活性成分物质、一种内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂和振幅增强剂，以及一种昼夜节律改善剂，其可预防和改善与内源性褪黑素分泌规律失调和昼夜节律失调有关的各种疾病。
背景技术：
在最近的科技发展、复杂化和社会形势快速变化的影响下，现代社会人们的生活方式越来越没有规律。24小时型社会的出现，使得人们的生活方式没有规律，导致了如睡眠障碍等昼夜节律失调和内源性褪黑素分泌规律失调，内源性褪黑素分泌规律失调可能是导致昼夜节律失调的一个重要因素。
现在研究已经确认，昼夜节律的夹带受下脑丘中的视交叉上核(SCN)控制，已知的一种典型的调节昼夜节律的物质是褪黑素(N-乙酰-5甲氧基色胺)，褪黑素主要由松果体分泌。褪黑素是一种在限速酶N-乙酰基转氨酶(NAT)的作用下由色胺酸经血清素合成的激素，它被认为参与了光周期哺乳动物体内光周期信息的引入，并影响繁殖、体重、代谢调节、昼夜节律控制，以及神经和内分泌功能。此外，因为松果体中褪黑素的分泌水平白天高夜晚低，所以褪黑素被认为是一种睡眠调节物质。
众所周知，睡眠障碍和昼夜节律失调患者体内的褪黑素分泌规律不同于健康人体内褪黑素的分泌规律，表现在睡眠障碍和昼夜节律失调患者的振幅降低和相位提前或滞后。
为了克服昼夜节律失调或褪黑素分泌规律失调，以治疗和预防睡眠障碍，有人建议服用外源褪黑素。例如，专利公开1揭示了通过口服外源褪黑素人为调整褪黑素的分泌规律对非24小时睡眠觉醒症、时差症、换班症、睡眠相位后移症等病症具有疗效，此类病症伴有入眠潜时延迟、失眠、清醒情绪不良、时差和昼夜颠倒等症状。
但是，褪黑素产品的安全性和外源褪黑素产品自身的副作用都没有得到充分确认。
专利公开2提供了一种改善睡眠质量的合成物，该合成物以通过水解非致病性乳酸菌的细胞壁获得的胞壁肽作为活性成分。但是，专利公开2中，睡眠质量的改善是借助免疫系统的引发延长睡眠的深睡阶段来实现的，因此改善睡眠质量的方式完全不同于通过提高内源性褪黑素的分泌水平来改善睡眠质量。
专利公开1JP-08-502259-T专利公开2JP-2003-517828-T发明内容本发明的一个目的在于提供一种内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，以及一种昼夜节律改善剂，可日常连续服用、安全可靠，并能有效预防和改善内源性褪黑素分泌规律失调或昼夜节律失调，而无需服用外源性褪黑素。
本发明的一个另一目的在于提供一种功能食品，如特殊保健用食品，该功能食品可日常连续服用、安全可靠，并能有效预防和改善因内源性褪黑素分泌规律失调或昼夜节律失调引起的、包括睡眠障碍和入眠潜时延迟在内的各种病症，而无需服用外源性褪黑素。
根据本发明，提供了一种内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，该制剂以乳清作为活性成分。
根据本发明，还提供了一种昼夜节律改善剂，该制剂以乳清作为活性成分。
根据本发明，进一步提供了一种改善内源性褪黑素分泌规律的功能食品，如预防和改善睡眠障碍或入眠潜时延迟，该功能食品含有前述内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂。
根据本发明，还提供了一种改善昼夜节律的功能食品，如预防和改善睡眠障碍或入眠潜时延迟，该功能食品含有前述昼夜节律改善剂。
根据本发明，提供了一种内源性褪黑素分泌规律的相位调整或振幅增强的方法，该方法包括让有需要的动物口服一定量以乳清作为活性成分的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂。
根据本发明，提供了一种改善昼夜节律的方法，该方法包括让有需要的动物口服一定量以乳清作为活性成分的昼夜节律改善剂。
根据本发明，进一步提供了乳清的用途，其可用于生产内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，或用于生产可调整内源性褪黑素分泌规律的相位和增加内源性褪黑素分泌规律的振幅的功能食品。
根据本发明，还提供了一种乳清的用途，其可用于生产昼夜节律改善剂，或用于生产可改善昼夜节律的功能食品。
由于本发明内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂和昼夜节律改善剂以可食用的乳清作为活性成分，所以可日常连续服用、安全可靠，并能预防和改善睡眠障碍或入眠潜时延迟，如非24小时睡眠觉醒症、时差症、换班症、睡眠呼吸暂停综合症、中年睡眠障碍等与昼夜节律失调或内源性褪黑素分泌规律失调相关的症状。
由于本发明的功能食品含有内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，或昼夜节律改善剂，所以本发明的功能食品可以预防和改善睡眠障碍和入眠潜时延迟等各种病症，无需服用外源性褪黑素。
图1是样品1和样品2各组12:00时松果体中褪黑素浓度的对比示意图。
图2是样品1和样品2各组0:00时松果体中褪黑素浓度的对比示意图。
图3是样品3和样品4各组12:00时松果体中NAT活性的对比示意图。
图4是样品3和样品4各组0:00时松果体中NAT活性的对比示意图。
具体实施例方式
下面详细说明本发明。
根据本发明，内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，可以预防和改善因内源性褪黑素分泌规律失调引起的各种疾病，具有内源性褪黑素分泌规律的相位调整或振幅增强中的至少一种功效，并以乳清作为活性成分。
根据本发明，昼夜节律改善剂具有预防和改善因昼夜节律失调引起的各种疾病的功效，并以乳清作为活性成分。
作为活性成分的乳清，含有通过一种普通工艺去除乳液中的所有或绝大部分酪蛋白等获得的乳液水可溶部分，例如可以是酸乳清和奶酪乳清。酸乳清的样品可以是用乳酸菌发酵乳液获得的发酵乳清，也可以是通过一种普通工艺在乳液中加酸去除所有或绝大部分酪蛋白等获得的含有乳液水可溶部分的酪蛋白乳清。最好可以是发酵乳清，因为其具有良好的内源性褪黑素分泌规律相位调整能力或振幅增强能力，和昼夜节律改善能力。
发酵乳清一般可以通过用乳酸菌发酵乳液获得，或通过用乳酸菌和酵母菌共同发酵乳液获得。原材料乳液可以是动物奶，如牛奶、山羊奶或绵羊奶；也可以是植物奶，如豆浆；还可以是动物奶或植物奶的加工奶，如脱脂牛奶、复原乳、奶粉或炼乳，原材料乳液可以以混合物形式出现。
乳液中的固含量没有特别限制，如对于脱脂牛奶而言，固态非脂肪的质量含量一般约为9％另一方面，考虑到单株的产量，非脂肪固含量可以适当增加。在已发酵乳液中提取的发酵乳清可以在使用前从其他乳液成分中分离，但是当发酵乳清用于生产随后讨论的功能食品时，其他乳液成分不一定要分离。
乳酸菌可以是链球菌类、乳球菌类、乳杆菌类和双歧杆菌类等，最好可以是乳杆菌类。乳杆菌样品可包括保加利亚乳酸杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜乳酸杆菌和乳酸杆菌，最好可以是瑞士乳杆菌。具体地，可以使用瑞士乳杆菌ATCC 15009、瑞士乳杆菌ATCC 521和瑞士乳杆菌CM4(保藏于经济产业省产业技术综合研究所特许生物保藏处，保藏编号FERM BP-6060，保藏日期1997年8月15日，以下简称CM4)，最好可以使用CM4。根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约，CM4已经以前述保藏编号保藏。当获准专利权时，公众不受任何限制即可获得上述生物材料的保藏菌类。
乳酸菌最好可以以具有足够高活性的预培植原料形式存在，起始细胞浓度最好可以约为105-107细胞/毫升。
当发酵乳清用于功能食品，如特定保健用食品时，可以用酵母菌来共同发酵，以改善口味。酵母菌没有特别限制，最好可以是酵母菌属，如酿酒酵母。酵母的含量也可以根据具体目的合理选择。
发酵可以通过将一种或多种乳酸菌培植于培养液中进行，也可以通过将一种或多种乳酸菌和一种或多种酵母混合培植于培养液中进行。培养液可以仅含有一种或多种前述乳液成分，也可以适当含有添加剂，如酵母提取物；维生素，如抗坏血酸维生素C；氨基酸，如巯基丙氨酸；盐，如氯化钠；糖，如葡萄糖、蔗糖、蜜三糖、水苏四糖；稳定剂，如胶质；和调味剂。
发酵一般可以通过静止或搅拌培植进行，如在20℃至50℃，最好可以在30℃至45℃，起始PH值为6.0至7.0，当PH值为5.0或低于5.0时的细胞浓度达到107细胞/毫升或高于107细胞/毫升时培植终止。发酵前，乳液可以经过高温杀菌。
发酵乳清可以通过一般的分离操作从凝结物中分离。另一方面，当作为活性成分的发酵乳清用于随后讨论的功能食品中时，如果需要的话，含有乳清的已发酵乳液可以不经分离就直接使用，或经过适当分离后使用。
当使用干酪固态奶，如全脂奶或脱脂奶时，酪蛋白乳清可以通过以下工艺制得将固态奶溶解于蒸馏水中；加入乳酸、柠檬酸、醋酸、酒石酸、富马酸、苹果酸、葡萄糖酸或己二酸，将酸性调节至适合去除蛋白质，尤其是酪蛋白；通过普通工艺，如滤膜法等分离乳清成分(水可溶部分)。在添加酸之前，乳液可以经过高温杀菌。酸的加入量一般需要满足将酸度调节为1.0％至4.0％，取决于所加酸的种类。
奶酪乳清可以从一般的奶酪产品中获得，通过凝乳凝结乳液形成凝结物，然后使用离心过滤等将乳清成分自凝结物中分离。此间，在凝乳加入前，乳液可以经过高温杀菌。
作为内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂或昼夜节律改善剂中的活性成分，酸乳清的剂量没有特别限制。考虑到服用的连续性，冻干粉形式的酸乳清的剂量一般可以为每天每公斤体重不低于0.001克，最好每天每公斤体重不低于0.01克。此外，内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂或昼夜节律改善剂中，还可以根据需要选择性地含有一些具有相位调整或振幅增强或昼夜节律改善功效的非乳清成分。
根据本发明，内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂或昼夜节律改善剂可以是处理过或未经处理的乳清，如通过真空浓缩等工艺获得的乳清浓缩物，或通过冻干或喷雾干燥获得的干乳清粉。
根据本发明，内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂或昼夜节律改善剂一般可以口服，可以在因内源性褪黑素分泌规律失调或昼夜节律失调引起的睡眠障碍症状出现之后或在预防睡眠障碍症状的季节中服用，且既可以连续服用也可以间歇服用。
根据本发明，改善内源性褪黑素分泌规律的功能食品含有内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂；根据本发明，改善昼夜节律的功能食品含有昼夜节律改善剂。
功能食品可以是特定保健用功能食品，其具有预防和改善因内源性褪黑素分泌规律失调或昼夜节律失调引起的各种症状，如预防和改善睡眠障碍或入眠潜时延迟。
功能食品中可以有选择地含有各种添加剂，如糖、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、调味剂，或各种添加剂的混合物。此外，还可以含有乳清自其中分离而出的乳液成分。
在本发明的功能食品中，作为活性成分的乳清的含量可以根据功能食品的形式和种类合理选择。选择乳清的含量时，还需要考虑功能食品摄入的连续性等因素，并没有特别限制，乳清的质量含量一般可以为1％至100％。
上述各种功能食品的形式可以是发酵乳液的产品，如酵母菌或乳酸菌饮料、经加工的含乳清的食品和饮料、干粉、药片、胶囊或颗粒等。
本发明的各功能食品服用的剂量和时间没有特别限制，功能食品的摄入量最好可以保证达到上述活性成分的剂量。例如，本发明功能食品可以在因内源性褪黑素分泌规律失调或昼夜节律失调引起的睡眠障碍等症状产生之前或之后服用，既可以连续服用也可以间歇服用。
样品下面参考各样品，详细说明本发明。这些详细说明仅起到说明作用，并非意在限制本发明。
样品1和样品2商用的固态脱脂奶溶解于蒸馏水中，其固态物的质量含量为9％；在105℃的高压灭菌器中高温杀菌10分钟，并冷却至室温；加入质量含量为3％的预培植的瑞士乳杆菌CM4，在37℃下培植24小时，获得发酵乳液；将发酵乳液在12000G离心力作用下离心分离20分钟，去除固态物后获得发酵乳清。
另一方面，商用的固态脱脂奶溶解于蒸馏水中，其固体物的质量含量为9％；在105℃的高压灭菌器中高温杀菌10分钟，并冷却至室温；加入乳酸，将酸度调节至2.2％；按照上述操作获得的产品在12000G离心力作用下离心分离20分钟，去除固态物后获得酪蛋白乳清。
制得的发酵乳清(样品1)和酪蛋白乳清(样品2)分别用蒸馏水稀释至质量含量为10％，并在下面的动物实验中用作饮用水。作为对照，实验中还用了不含乳清的蒸馏水。
将51只3个星期大的雄性Wistar鼠预饲养1个星期，在预饲养期间，Wistar鼠可以自由接近固体食物(商标名MF，ORIENTAL YEAST有限公司生产)和蒸馏水。在预饲养期间，每天的白天-黑夜循环设置为白天为8:00至20:00，其后的12小时为夜晚。预饲养后，将51只Wistar鼠分成3组，每组17只，即(1)组饮用蒸馏水(对比)；(2)组饮用含质量含量为10％的发酵乳清(样品1)；(3)组饮用含质量含量为10％的酪蛋白乳清(样品2)，可自由接近各饮料和固体食物的饲养期限为1个月。饲养1个月后，每组中的8只Wistar鼠在12:00时宰杀，剩下的9只Wistar鼠在0:00时宰杀，自鼠脑中取出松果体；加入200微升0.1M的过氯酸，将混合物均匀后离心分离；测出所得浮在表面的褪黑素含量，收集沉淀物以测量蛋白质的含量。
用Melatonin EIA Kit(商标名，IBL Hamburg生产)测量褪黑素的含量，根据Bradford法用Bio-Rad蛋白测定试剂(商标名，Bio-Rad生产)测量蛋白质的含量。测得12:00时的褪黑素含量的结果如图1所示，测得0:00时的褪黑素含量的结果如图2所示，统计显著性由student-newman-keuls法检验确定。
从图1和图2可以看出在饮用蒸馏水(对比)的(1)组中，褪黑素的浓度12:00时低而0:00时高，表明褪黑素的活性白天低夜晚高。从图1和图2可以看出相对于饮用蒸馏水的(1)组，在饮用发酵乳清的(2)组和饮用酪蛋白乳清的(3)组中，12:00时的褪黑素浓度较低，0:00时的褪黑素浓度较高。尤其在饮用发酵乳清的(2)组中，12:00时的褪黑素浓度明显低于饮用蒸馏水的(1)组的褪黑素浓度(显著性差异p＜0.05)，而0:00时的褪黑素浓度明显高于饮用蒸馏水的(1)组的褪黑素浓度(显著性差异p＜0.05)，和饮用酪蛋白乳清的(3)组的褪黑素浓度(显著性差异p＜0.05)。
上述结果表明，服用发酵乳清或酪蛋白乳清可以提高昼低夜高的褪黑素浓度。特别地，当服用发酵乳清时的振幅增强较大，表明发酵乳清的效果更显著。也就是说，通过服用发酵乳清或酪蛋白乳清，可调整内源性褪黑素分泌规律的相位和增强内源性褪黑素分泌规律的振幅。发酵乳清增强振幅的效果要优于酪蛋白乳清增强振幅的效果，表明发酵乳清具有更好的振幅增强效果。
样品3和样品4将33只3个星期大的雄性Wistar鼠预饲养1个星期，在预饲养期间，Wistar鼠可以自由接近固体食物(商标名MF，ORIENTAL YEAST有限公司生产)和蒸馏水。在预饲养期间，每天的白天-黑夜循环设置为白天为8:00至20:00，其后的12小时为夜晚。预饲养后，以和样品1和样品2同样的方式将33只Wistar鼠分成(1)组至(3)组共3组，可自由接近各饮料和固体食物饲养1个月。饲养1个月之后，每组中的5只Wistar鼠在12:00时宰杀，每组中剩下的另6只Wistar鼠在0:00时宰杀。自各Wistar鼠的脑中取出松果体，用Thomas et al.方法测量松果体中的NAT活性。
具体地，将含有1.5mM乙酰辅酶A的100毫升0.25M的磷酸钙缓冲液(PH值7.5)加入松果体，均匀后制备酶溶液；将30毫升的酶溶液、70毫升含有1.5mM乙酰辅酶A的0.25M磷酸钙缓冲液和20mM的色胺混合后在37℃下反应30分钟，加入1毫升甲苯/乙戊醇/1M盐酸溶液(99∶0.66∶0.33)；搅拌后，混合物在500G离心力作用下离心分离10分钟，750毫升浮在表面的物质在离心蒸发器中蒸发获得干燥产品；加入100毫升流动相(0.1M柠檬酸、0.1M醋酸钠、35％甲醇(Ph值4.1))并搅拌，所得溶液在荧光检测器下用高效液相色谱法测量N-acetyltryptamine，测量的激发波长为285nm，检测波长为360nm，流速为1毫升/分钟，使用Column Wakosil-II 5C18RS(4.6mm×150mm)。蛋白质的定量用Bradford法对照BSA标准。
12:00时的NAT活性的测量结果如图3所示，0:00时的NAT活性的测量结果如图4所示，统计显著性由student-newman-keuls法检验确定。
从图3和图4可以看出各组12:00时的NAT活性没有差别，但是0:00时引用发酵乳清(样品3)的组(2)的NAT活性明显高于引用蒸馏水(对照)的组(1)和饮用酪蛋白乳清(样品4)的组(3)的NAT活性(显著性差异p＜0.01)。而且，饮用酪蛋白乳清的组(3)的NAT活性明显高于引用蒸馏水的组(1)的NAT活性(显著性差异p＜0.05)。考虑到NAT是褪黑素合成中的限速酶，从上述结果可以确定，NAT支持松果体中褪黑素浓度的变化。
处方1质量含量为90％的含有样品1中制备的发酵乳清的发酵奶、质量含量为0.05％的Aspartame(商标名，AJINOMOTO K.K.生产)以改善饮用性、质量含量为0.05％的Yogurt Flavor cw-3186(T.HASEGAWA有限公司生产)、质量含量均为0.1％的Yogurt Flavor DY-4449和Sugar Flavor HASE SF-5531(T.HASEGAWA有限公司生产)作为调味剂、质量含量为0.5％的稳定剂，和质量含量为9.2％的蒸馏水混合后作为起始原料，均匀混合物在90℃下高温杀菌；所得产品热灌装在100g的棕色瓶中，在80℃下高温杀菌10分钟，获得发酵酸奶饮料。
权利要求
1.一种内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述制剂以乳清作为活性成分。
2.如权利要求1所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述乳清是酸乳清和奶酪乳清中的至少一种。
3.如权利要求2所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述酸乳清含有通过用包括乳酸菌在内的菌类发酵乳液获得的发酵乳清。
4.如权利要求3所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述乳酸菌为乳杆菌类。
5.如权利要求4所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述乳杆菌类乳酸菌为瑞士乳杆菌类。
6.如权利要求5所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌CM4(保藏于经济产业省产业技术综合研究所特许生物保藏处，保藏编号FERM BP-6060)。
7.如权利要求2所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，其特征在于所述酸乳清是一种通过在乳液中加酸获得的含有水可溶部分的酪蛋白乳清。
8.一种昼夜节律改善剂，其特征在于所述改善剂以乳清作为活性成分。
9.如权利要求8所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述乳清是酸乳清和奶酪乳清中的至少一种。
10.如权利要求9所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述酸乳清含有通过用包括乳酸菌在内的菌类发酵乳液获得的发酵乳清。
11.如权利要求10所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述乳酸菌为乳杆菌类。
12.如权利要求11所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述乳杆菌类乳酸菌为瑞士乳杆菌类。
13.如权利要求12所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述瑞士乳杆菌为瑞士乳杆菌CM4(保藏于经济产业省产业技术综合研究所特许生物保藏处，保藏编号FERM BP-6060)。
14.如权利要求9所述的昼夜节律改善剂，其特征在于所述酸乳清是一种通过在乳液中加酸获得的含有水可溶部分的酪蛋白乳清。
15.一种改善内源性褪黑素分泌规律的功能食品，其特征在于该功能食品含有如权利要求1至7项中任意一项所述的内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂。
16如权利要求15所述的功能食品，其特征在于所述对内源性褪黑素分泌规律的改善包括预防和改善睡眠障碍和入眠潜时延迟。
17.一种改善昼夜节律的功能食品，其特征在于该功能食品含有如权利要求8至14项中任意一项所述的昼夜节律改善剂。
18.如权利要求17所述的功能食品，其特征在于所述对昼夜节律的改善包括预防和改善睡眠障碍和入眠潜时延迟。
全文摘要
本发明涉及内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂和昼夜节律改善剂，其可日常连续服用、安全可靠，并能有效预防和改善内源性褪黑素分泌节律失调和昼夜节律失调，而无需服用外源性褪黑素。本发明还涉及含有前述制剂的功能食品，其可预防和改善睡眠障碍或入眠潜时延迟等症状。根据本发明，内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂以乳清作为活性成分，改善内源性褪黑素分泌规律的功能食品含有内源性褪黑素分泌规律的相位调整剂或振幅增强剂，改善昼夜节律的功能食品含有昼夜节律改善剂。
文档编号A61P25/20GK1960739SQ200580017580
公开日2007年5月9日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者森山芳则, 坪井诚二, 增山明弘, 高野俊明, 上野敬太, 甲斐俊幸 申请人:卡尔皮斯株式会社