专利名称：关节炎的治疗剂或预防剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于关节炎，特别是骨关节炎和类似类型的关节炎的治疗剂或预防剂，或者涉及关节软骨细胞生长促进剂，或者涉及利用鸟苷酸环化酶B(下文中称作“GC-B”)活化剂抑制关节炎的方法或促进关节软骨细胞生长的方法。本发明进一步涉及利用GC-B活性作为指标，筛选关节炎治疗剂或关节软骨细胞生长促进剂的方法。
背景技术：
关节炎是关节的炎症疾病，并且类风湿性关节炎和骨关节炎(或骨关节病)是普遍的关节病。
类风湿性关节炎被认为是自身免疫性疾病，其伴有关节疼痛、僵硬和肿胀，并且随着病情进展，经常可以导致类似于骨关节炎的关节软骨表面的变性，其导致关节的骨和软骨的严重破坏。
骨关节炎是经常发生于老年人中的关节软骨的变性疾病。骨关节炎(OA)涉及由关节的构成要素的退行变性所导致的软骨的破坏和骨、软骨的增殖性变化，其中所述变化导致继发性关节炎(例如，滑膜炎)。骨关节炎主要发生在负重关节，例如膝、肘和髋关节(Virchows Arch1996；260521-663)中，并较少发生在非负重关节中，例如肩/肘和手关节。另外，具有相似病态的颞下颌关节炎已经被确定发生于颞下颌关节中(J Orofac Pain 1999；13(4)295-306)。
已知在骨关节炎中作为软骨的功能本体的软骨基质蛋白减少，并且软骨细胞数减少(Arth Rheum 2002；46(8)1986-1996)。然而，由于在软骨组织中缺少血管分布、高度分化的软骨细胞数少、软骨前体细胞数少以及软骨基质的更新缓慢，所述的软骨具有太低的自我更新能力以至于不能保证在骨关节炎中从与关节软骨基质和软骨细胞数减少相关的疾病中自然治愈(Novartis Found.Sypm.2003；2492-16)。另外，在骨关节炎中，关节炎与软骨变性同时发生，这是关节疼痛的原因(JRheumatol 2001；28(6)1330-1337).
已经报导的用于关节炎如类风湿性关节炎和骨关节炎的治疗剂/预防剂的例子包括，例如蛋白酪氨酸激酶抑制剂(日本专利公开(Kohyo)11-512708A(1999))、N-酰基-2-葡糖胺衍生物(日本专利公开(Kohyo)2004-507490A)和喹啉/喹唑啉衍生物(日本专利公开(Kokai)9-169646A(1997))。另外，目前已经广泛使用的骨关节炎标准治疗剂为口服抗炎止痛剂或关节内注射的透明质酸和肾上腺皮质类固醇制剂。所有这些药物只能缓解关节疼痛，这意味着有需要对关节软骨的变性具有抑制作用的药物(Decision Base 7，2002)。
鸟苷酸环化酶(GC)是属于酶家族的膜蛋白，其催化从GTP合成第二信使cGMP，它的例子包括GC-A，GC-B，……，和GC-F。GC-B主要发现于血管内皮细胞中，并被认为与平滑肌的松弛有关。已知利钠利尿肽(NP)为活性GC。NP分为ANP(心钠肽)、BNP(脑钠肽)和CNP(C型利钠利尿肽)，它们被认为通过两种鸟苷酸环化酶结合受体(对于ANP和BNP为NPR-A，和对于CNP为NPR-B)而升高细胞内cGMP水平，从而表现出生物活性(Ann Rev Biochem 1991；60229-255)。
NPR-C不是鸟苷酸环化酶结合受体，它被认为是不涉及信号转导的NP的清除受体(Science，1987；238675-678)。然而，在一个系统中，其中通过该系统当小鼠骨髓巨噬细胞用脂多糖(LPS)刺激时，前列腺素E2(PGE2)的产生被环氧合酶2(COX-2)诱导，ANP和CNP已经被报导通过经由NPR-C降低细胞内cAMP水平而具有对PGE2的产生的抑制作用，这提示在NP的信号转导中涉及NPR-C(Endocrinology 2002；143(3)846-852)。这篇报导描述了通过用LPS刺激小鼠骨髓巨噬细胞(BMM)，ANP表现出对PEG2生成的增强作用最大约70％的抑制作用，然而CNP只表现出最大约20％的抑制作用，因此CNP具有弱的作用。因为已知通过环状核苷酸如cAMP和cGMP对COX-2生成的控制表现出根据细胞种类和刺激类型或者促进或者抑制的反应，所以通过CNP在BMM细胞中由LPS诱导的PGE2生成的抑制是否可被应用于其它细胞和刺激是不清楚的。另外在Endocrinology 2002；143(3)846-852中报导了ANP表现出在系统中的抑制作用，其中在所述的系统中给药LPS增加了小鼠中血液血栓烷B2(TXB2)的水平，相反地，相同机理的cANF则被增强。另外，尽管所述报导描述了ANP对免疫相关疾病如关节炎和脓毒病的引用，但其中没有提及CNP对这些相关疾病的应用。因此，关于CNP对关节炎的作用尚没有获得任何发现。
NP已经被报导在控制体液恒定性和调节血压方面具有重要作用(JClin Invest 1987；931911-1921，J Clin Invest 1984；871402-1412)，并且已知它们在心血管系统以外的各种组织中的表达和表现生物活性(Endocrinol 1991；1291104-1106，Ann Rev Biochem 1991；60553-575)。对于软骨，在过剩表达BNP(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998；952337-2342)或CNP的转基因小鼠中，利用CNP用于生长软骨(auxotonic gristle)的伸长和软骨成长不全的治疗已经被报导了(Nat Med2004；10(1)80-86，日本专利申请(Kokai)2003-113116A)。然而，所述生长软骨是暂时性软骨，其最终随着钙化消失并被骨替代，并且已知其具有不同于永久性软骨的生物学性质，其中所述的永久性软骨，例如关节软骨和气管软骨，在生命期间存在(Dev Biol 1989；136(2)500-507，J Cell Biol 2001；153(1)87-100)。另外，尽管已经有报导，CNP的体外活性增强了作为永久性软骨的关节软骨细胞的过度生长，但关于对在正常动物中的关节软骨、或者对骨关节炎中的关节软骨变性或关节炎的体内作用尚没有任何发现。
在骨关节炎中，在疾病最初阶段的关节软骨肿胀导致软骨组织容量暂时性增长(J Rheum 1991；18(3)1905-1915)，随着疾病的进展，软骨基质的变性/破坏增加，导致所述容量降低(Arthritis Rheum 2004；50(2)476-487)。由于凋亡作用，关节软骨细胞数降低(Arthritis Rheum2004；50(2)507-515)。另一方面，剩余的单独的关节软骨细胞已知为表达X型胶原蛋白，区别于具有临时性软骨性质的肥大软骨细胞(Arthritis Rheum 1992；35(7)806-811)。另外，在患病关节中，关节炎伴随着关节软骨的破坏并可能是临床疼痛的因素(J Rheumatol 2001；28(6)1330-1337)。在骨关节炎中这些变化的抑制，即关节软骨基质和关节软骨细胞数的降低或恢复，以及关节炎的抑制，被认为在开发治疗剂中是有用的。
本发明的目的是提供用于关节炎，包括骨关节炎的新型治疗剂或预防剂，或用于治疗所述关节炎的方法。
本发明的另一个目的是提供关节软骨细胞生长促进剂或方法。
本发明的另一个目的是提供用于抑制关节炎，包括骨关节炎的方法。
本发明的另一个目的是提供用于筛选关节炎治疗剂的方法。
本发明的另一个目的是提供用于筛选关节软骨细胞生长促进剂的方法。
发明内容
本发明的发明人制备了过剩表达C型利钠利尿肽(CNP)的CNP转基因小鼠，所述C型利钠利尿肽为一种鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂，以研究对关节软骨的作用，获得的结果如下所示在该CNP转基因小鼠中，关节软骨的厚度和关节软骨细胞数显著增加；在从该CNP转基因小鼠制备的骨关节炎模型中，对关节肿胀有耐受性，其中关节软骨的变性减少，滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞浸润有轻微变化，并且在关节软骨中的蛋白多糖含量没有降低，而在由正常小鼠制备的骨关节炎模型中，在滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞浸润方面有显著变化。从这些发现中，本发明的发明人已经发现所述GC-B活化剂具有抗关节炎作用以及对关节软骨的同化作用。
因此，本发明包含如下发明。
在第一个方面，本发明提供关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
在本发明的一个实施方案中，所述的关节炎为骨关节炎。
在本发明的另一个实施方案中，所述的骨关节炎为负重关节或非负重关节的骨关节炎。
在本发明的另一个实施方案中，所述的骨关节炎为膝关节变性病。
在本发明的另一个实施方案中，所述的骨关节炎为变性髋关节骨关节炎。
在本发明的另一个实施方案中，所述的骨关节炎为颞下颌关节炎。
在本发明的另一个实施方案中，所述的关节炎由类风湿性关节炎导致。
在本发明的另一个实施方案中，所述的关节炎由骨关节炎导致。
在本发明的另一个实施方案中，所述的GC-B活化剂为C型利钠肽(CNP)或其衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，如上所描述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP的活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述的关节炎的治疗剂或预防剂包含至少一种非甾体类抗炎药。
在第二个方面中，本发明提供关节软骨细胞生长促进剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
在本发明的一个实施方案中，所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP的活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述的关节软骨细胞生长促进剂进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
在第三个方面，本发明提供用于抑制关节炎的方法，其中所述的关节炎通过活化GC-B被抑制。
在本发明的一个实施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP的活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
在第四个方面，本发明提供用于促进关节软骨细胞生长的方法，其中所述的生长通过活化GC-B被促进。
在本发明的一个实施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，如上所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，如上所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，并且具有CNP的活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
在第五个方面，本发明提供筛选关节软骨细胞生长促进剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
在本发明的一个实施方案中，所述的方法包括制备表达GC-B的培养细胞或得自关节软骨细胞的细胞，在候选药物存在下培养所述细胞，利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述的GC-B活性由细胞内cGMP的产生量确定。
在本发明的另一个实施方案中，所述的方法包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在候选药剂存在或不存在下培养所述细胞系，测定细胞内cGMP的产生量，利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量之间的差别作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
在第六个方面，本发明提供筛选用于骨关节炎、类风湿性关节炎或关节炎的治疗剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选用于骨关节炎、类风湿性关节炎或关节炎的候选药剂。
在本发明的一个实施方案中，所述的方法包括制备表达GC-B的培养细胞或得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述的GC-B活性以细胞内cGMP的产生量确定。
在本发明的另一个实施方案中，所述的方法包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在候选药剂存在或不存在下培养所述细胞系，测定细胞内cGMP的产生量，利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量之间的差别作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
在第七个方面，本发明提供骨关节炎的治疗剂或预防剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
在本发明的一个实施方案中，如上所述的骨关节炎的治疗剂或预防剂进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
在第八个方面，本发明提供类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
在本发明的一个实施方案中，如上所述的类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
在第九个方面，本发明提供鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂的活化促进剂，其包含非甾体类活化剂。
在本发明的一个实施方案中，所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
在本发明的另一个实施方案中，所述的CNP衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP的活性。
在本发明的另一个实施方案中，所述的非甾体类活化剂为环氧合酶抑制剂。
在本发明的另一个实施方案中，所述的环氧合酶抑制剂选自吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康、水杨酸、双氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡罗昔康。
在第十个方面，本发明进一步提供用于活化GC-B活化剂的方法，其中使用如上所述的活化促进剂。
本申请的说明书包含日本专利申请2004-107924的说明书和/或附图所公开的内容，本申请要求日本专利申请2004-107924的优先权。
图1表示用于制备CNP转基因小鼠的载体的构建。图1A已经并入到pGEM-T Easy载体中的小鼠CNP的cDNA，将其用Pst I切出并使两端平滑化。图1B将pSG1用EcoR I处理并使断端平滑化。图1C将如图1A中制备的小鼠CNP的cDNA并入到如图1B中获得的pSG1中。
图2表示注射用DNA片段。将包含所述CNP基因的片段(约2.3kb)从在图1C中制备的pSG1-CNP上，通过用Hind III和Xho I进行消化而切出，并且将其用作注射用片段。
图3表示CNP转基因小鼠的基因型分析的结果。在野生型小鼠(WT)中，检测到3个信号(指定为“野生型CNP基因”)，而在转基因小鼠(Tgm)中，除了野生型CNP基因外，还检测到转基因由来的2个信号(指定为“转基因”)。
图4为表示在CNP转基因小鼠中关节软骨厚度的图。比较了正常同腹小鼠(野生型)和CNP转基因小鼠(CNP tgm)之间的股骨膝盖面的关节软骨的厚度。本图指出CNP转基因小鼠具有统计学显著性更厚的关节软骨。**p＜0.01，非成对Student t检验。
图5为表示在CNP转基因小鼠中关节软骨细胞数的增长。比较了正常同腹小鼠(野生型)和CNP转基因小鼠(CNP tgm)之间的股骨膝盖面的关节软骨中的在光学显微镜下每个视野的软骨细胞数。本图指出CNP转基因小鼠具有统计学显著性更大的每视野的软骨细胞数。**p＜0.05，非成对Student t检验。
图6为表示在CNP转基因小鼠中的胶原酶诱导的OA模型中对关节肿胀的耐受性。在给药3％胶原酶或生理盐水到CNP转基因小鼠(Tgm)和野生型小鼠(WT)的右膝关节中后，测量左右膝关节的宽度，并且将膝关节宽度的差异用作膝关节肿胀的指标，以评价病情进展(图6A)并求出曲线下的面积(AUC)(图6B)。所述的CNP转基因小鼠在右膝关节中倾向于具有微弱的肿胀，并具有比在野生型中显著更小的AUC。**p＜0.01，N.S.没有显著性。非成对Student t检验。
图7表示在胶原酶OA模型中的右膝关节滑膜的组织学变化。本图是向CNP转基因小鼠和野生型小鼠的右膝关节中给药3％胶原酶生理盐水后28天的右膝关节滑膜的组织学图像。当给药3％胶原酶时，野生型小鼠显示出滑膜上皮细胞的增生、肉芽组织形成和炎性细胞浸润(图7B)。另一方面，在CNP转基因小鼠中这些轻微发生(图7C)。图7A为正常滑膜组织的图像。
图8表示在胶原酶OA模型中的右股骨内骨节关节软骨的组织学变化。本图是向CNP转基因小鼠和野生型小鼠的右膝关节中给药3％胶原酶生理盐水后28天的右股骨内骨节(medial femoral condyle)的组织学图像。番红O对软骨基质染色能力的降低表明在野生型小鼠中蛋白多糖含量的降低(图8B)，而在CNP转基因小鼠中番红O的染色能力保持不变(图8C)。图8A为正常关节软骨的图像。
图9表示在接受输注给药的CNP胶原酶OA小鼠模型中抑制关节肿胀的效果。本图表示在将包含于生理盐水的1.5％胶原酶给药到接受持续皮下给药CNP-22的C57BL/6J Jcl小鼠的右膝关节中后6天测量的右膝关节肿胀。CNP-22，在60和600ng/天的情况下都比溶剂对照组(媒介物)显著抑制了右膝关节的肿胀。非成对Student t检验。
图10表示在外科OA小鼠模型中，CNP输注对抑制关节肿胀的效果。将C57BL/6J Jcl小鼠持续皮下给药CNP-22并将其经过手术过程，在右膝中切除前十字韧带、切除胫骨内侧副韧带和整体切除内侧半月板以诱导骨关节炎。在手术后4、8和11天测量右膝和左膝的宽度，并且显示了AUC的不同。CNP-22，在60和600ng/天的情况下都比溶剂对照组(媒介物)显著抑制右膝关节的肿胀。非成对Student t检验。
图11表示在C57BL/6J Jcl胶原酶OA小鼠模型中，CNP-22(6ng/天，持续皮下给药)、吲哚美辛(Indo.，1mg/kg，口服给药)及其组合对膝关节肿胀的抑制作用。图11A表示在给药0.15％和1.5％胶原酶生理盐水到小鼠右膝关节后7天中右膝关节的肿胀变化。图11B表示图11A中的图的曲线下面积(AUC)。当比较AUC时，与同时没有吲哚美辛的溶剂对照组(媒介物)比较，CNP-22显著抑制右膝关节的肿胀。另一方面，CNP-22和吲哚美辛的组合显示出比单独使用CNP22具有显著性更强的显著抑制作用。非成对Student t检验。*p＜0.05(对媒介物)，**p＜0.01(对媒介物)。
图12表示在辅助关节炎鼠模型中CNP-22对四肢末端关节炎和体重变化的效果。图12A表明四肢末端关节炎的得分变化，它指出对于CNP-22组具有较低的关节炎得分。图12B表示体重变化，它指出在从抗原致敏的第7天和第10天，CNP-22组显示出比溶剂对照组(媒介物)显著重的体重。非成对Student t检验。*p＜0.05(对媒介物)。
图13表示CNP-22对胶原质关节炎鼠模型中体重的效果。它指出尽管从抗原致敏的第21、24和28天时，与正常组相比溶剂对照组(媒介物)显示出显著轻的体重，但是CNP-22组(CNP 6μg/天)与溶剂对照组相比显示出显著重的体重。非成对Student t检验。##p＜0.01(对正常组)，*p＜0.05(对媒介物)。
发明的详细说明参考附图进一步描述本发明。
本发明的发明人用DNA印记法分析了如下文中所述的实施例2中制备的CNP-转基因小鼠(CNP Tgm)的基因型。结果，如图3所示，本发明的发明人在野生型小鼠中检测到3个信号(“野生型CNP基因”)，而在CNP Tgm中，除了野生型CNP基因外，还检测到转基因由来的2个信号(“转基因”)。在肝脏——预计高度表达所述转基因的器官——以及在血浆中检测CNP水平以研究在CNP Tgm中的CNP的表达。结果，发现在肝脏和血浆中，CNP Tgm分别显示出比野生型高10倍和约24倍的CNP水平，显示出统计学显著性的CNP肽的过剩表达(实施例4的表1)。
另外，从组织学上检测关节软骨的厚度和软骨细胞数以进行CNPTgm的关节软骨的组织学分析，结果显示在CNP Tgm中关节软骨统计学显著性地厚(图4)并且关节软骨细胞数统计学显著性地大(图5)。这些结果表明GC-B活化剂例如CNP可以通过增加软骨细胞数而增加关节软骨的厚度。
在下文中描述的实施例6中，通过向小鼠的膝关节中注射胶原酶以使膝关节韧带和半月板不稳定并诱导骨关节炎而建立骨关节炎动物模型(Am.J.Pathol.1989；1351001-14)。所述CNP Tgm和正常小鼠由来的骨关节炎动物模型被用于评价该CNP Tgm对关节炎和关节软骨变性的耐受性。在CNP Tgm由来的动物模型中，当与正常小鼠由来的动物模型相比较时，其膝关节肿胀显著更轻微，关节软骨变性被显著性地更大程度地抑制，在滑膜中的滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞渗透均非常轻微，并且在关节软骨中的蛋白多糖含量上几乎没有变化(图6-8)。这些结果说明GC-B活化剂在骨关节炎中对关节炎和关节软骨的变性具有抑制作用。
另外，用移植有渗透泵的正常小鼠建立骨关节炎模型以检验CNP输注对骨关节炎模型的治疗效果。在CNP组中，发现本组动物对膝关节肿胀具有耐受性，他们具有显著降低的关节软骨变性，并表现出在滑膜中的滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞渗透方面相当轻微的变化(图9)。这些结果表明GC-B活化剂对骨关节炎具有治疗作用。
另外，将移植有渗透泵的正常小鼠经过手术过程，在右膝关节中切除前十字韧带，切除胫骨内侧副韧带和完全切除内侧半月板以诱导骨关节炎，并检验CNP输注对骨关节炎模型的治疗效果。结果表明在两个剂量下的AUC(曲线下面积)在CNP组中比溶剂对照组显著性更低(图10)。这些结果说明GC-B活化剂对抑制由手术过程导致的身体过负荷而诱导的骨关节炎中的关节炎也是有效的。
另外，当将CNP给药到胶原酶OA小鼠模型中时，单独使用或与非甾体类抗炎药(NSAID)组合使用，CNP单独使用显著地抑制关节肿胀，而单独使用NSAID则不会，而且CNP和NSAID的组合显示出甚至更强的协同抗肿胀作用(实施例9，图11)。
另外，当利用通常在实验室中用作类风湿性关节炎(RA)模型的辅助关节炎和胶原蛋白关节炎模型来进一步检验CNP的作用时(Arthritis& Rheumatism，27797-806，1984；British Journal of Rheumatology，33798-807，1994)，所述CNP组(大鼠)与对照组相比，显示出显著降低的关节炎和更大的体重增长，说明对常见病症的显著性改善(实施例10和11，图12和13)。这些结果说明CNP对于在类风湿性关节炎中的关节炎的作用。
从这些验证性的例子中，本发明的发明人发现，不被任何特定的理论或实验所限制，GC-B活化剂，例如CNP，具有抗关节炎的作用以及对关节软骨的同化作用。
因此，本发明提供关节炎的治疗剂或预防剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
根据本发明可被治疗或预防的关节炎的例子包括但不限于涉及关节软骨的那些，特别是例如与骨关节炎、滑膜炎、类风湿性关节炎(类风湿性关节炎(成人)和青少年类风湿性关节炎(儿童))相关的关节炎、骨关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、痛风、硬皮病、牛皮癣(牛皮癣关节炎)、例如芽生菌病的真菌感染、强直性脊柱炎、赖特尔综合症、脓毒性关节炎、成人斯蒂尔病、三期莱姆病(晚期)、结核(结核性关节炎)、病毒性感染(病毒性关节炎)和由感染有淋病(淋球菌性关节炎)和细菌(非淋球菌性细菌性关节炎)导致的关节炎。
在本发明的一个实施方案中，优选的关节炎为骨关节炎或与骨关节炎相关的关节炎。
骨关节炎是由关节软骨的变性和破坏导致的疾病，并且可应用的骨关节炎的例子包括例如，(1)负重关节的骨关节炎，例如在膝关节的膝关节变性病、在髋关节的髋关节病、在足部的足骨关节炎和在脊柱的脊椎骨关节炎，和(2)非负重关节的骨关节炎，例如在肩部的肩骨关节炎、在肘部的肘骨关节炎、在手部的手骨关节炎(例如，赫伯登(heberden’s)结节、布夏尔(Bouchard’s)结节、拇指CM骨关节炎)和颌骨中的颞下颌关节炎。
在本发明的一个实施方案中，所述的骨关节炎为影响负重关节的骨关节炎，优选为膝关节变性病或髋关节变性病。
在本发明的另一个实施方案中，所述的骨关节炎为影响非负重关节的骨关节炎，优选颞下颌关节炎。
本发明的治疗剂或预防剂还可用于治疗或预防类风湿性关节炎。类风湿性关节炎被认为是自身免疫性疾病，尽管它具有与骨关节炎不同的病因学，它涉及，如伴随着骨关节炎的，随着病情进展，关节软骨面的变性和软骨的破坏。因此，给药本发明的治疗剂可以抑制或缓解关节炎。
本文中所用的术语“治疗”、“治疗方法”和“治疗剂”，意思是消除、抑制或缓解根据本发明患有关节炎的病人的症状。或者为此目的的方法或药物。另外，术语“预防”和“预防剂”意思是预防关节炎或为此目的的药物。
如本发明中所用的，术语“鸟苷酸环化酶B(GC-B)”具有与利钠肽受体B(NPR-B)相同的含义。
如本发明中所用的，术语“GC-B活性”具有与鸟苷酸环化酶活性相同的含义。在本发明中，鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂或GC-B活化剂为肽或非肽的低分子量化合物，优选为CNP肽或其衍生物，其可以结合并活化GC-B，所述GC-B已知为CNP受体。本文中所用的肽指由多个(L-、D-和/或修饰的)氨基酸的酰胺键连接组成的物质，包括多肽和蛋白。GC-B活化剂可以通过如下方式鉴定例如在培养细胞系如COS-7中表达GC-B受体，向该培养物中加入候选药剂，在一定时段和在一定温度下(例如37℃，5分钟)培养该细胞系，以及测量分子内cGMP的产生量(Science 1991；252120-123)。利用这样的试验体系和利用细胞内cGMP的产生量作为指标，GC-B活化剂可以被鉴定并被用于本发明中。
根据本发明的一个实施方案，所述的GC-B活化剂为肽，并优选为CNP或其衍生物。优选的CNP选自包括人的哺乳动物或鸟由来的CNP-22和CNP-53，并且更优选SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
根据本发明的另一个实施方案，如上所述的CNP衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时保持CNP的活性。或者，所述CNP衍生物包含具有与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列约70％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约97％或更高、约98％或更高或约99％或更高的同一性，并保留CNP的活性。
本文中所用的术语“一个或几个”通常表示1到10，优选1到5，更优选1到3的任意整数。两种氨基酸序列间的“同一性的百分比”可以利用本领域技术人员公知的技术确定，例如BLAST蛋白质检测(Altschul，S.F.，Gish，W.Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)“Basic Local Alignment Search Tool”J.Mol.Biol.215403-410)。
可用于本发明的CNP的例子包括得自包括人的哺乳动物的CNP(CNP-22Biochem.Biophys.Res.Commun.1990；168863-870，国际公开WO 91/16342，CNP-53Biochem.Biophys.Res.Commun.1990；170973-979，日本专利公开4-74198A(1992)，日本专利公开4-139199A(1992)，日本专利公开4-121190A(1992))，得自鸟的CNP(日本专利公开4-120094A(1992))，得自两栖动物的CNP(日本专利公开4-120095A(1992))和公开于日本专利公开6-9688A(1994)和国际公开WO02/074234中的CNP衍生物，例如CNP类似肽。
分别由22个和53个氨基酸残基组成的CNP-22和CNP-53已知为天然存在的CNP。因为CNP在它们的序列方面，在鸟和包括人的哺乳动物之间具有高度同源性，即无论动物种类如何，本发明中可以使用鸟和包括人的哺乳动物由来的CNP，优选得自包括人的哺乳动物的CNP，更优选得自人的CNP。人的CNP-22或CNP-53的氨基酸序列分别具有示于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的序列，其表示为Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerMet Ser Gly Leu Gly Cys(人的CNP-22；SEQ ID NO1)；或Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu LeuGln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly LeuSerLys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser GlyLeu Gly Cys(人的CNP-53；SEQ ID NO2)，其中每一个都具有分子间二硫键，即在人的CNP-22的6-Cys和22-Cys间，或在人的CNP-53的37-Cys和53-Cys间形成环状肽结构。
猪的CNP-22和大鼠的CNP-22具有与人的CNP-22相同的氨基酸序列，然而在猪的CNP-53和大鼠的CNP-53中，在位置17和28处的氨基酸残基分别为His和Gly，而在人CNP-53中，它们分别是Gln和Ala，即在人和猪或大鼠之间的CNP-53上，有两个氨基酸是不同的(日本专利公开4-139199A(1992)、日本专利公开4-121190A(1992)和日本专利公开4-74198A(1992))。另外，鸡的CNP-22具有与人的CNP-22相同的一级结构，除了在位置9上的氨基酸残基为Val外(日本专利公开4-120094A(1992))。
可用于本发明的CNP包括自天然来源纯化的CNP，通过已知基因工程技术制备的重组CNP，以及通过已知的化学合成制备的CNP(例如，用肽合成机进行的固相合成)，优选通过基因工程技术制备的人CNP-22和人CNP-53。通过基因工程技术制备人的CNP包括如下步骤，例如将人CNP-22或CNP-53的DNA序列(日本专利公开4-139199A(1992))并入到载体，例如质粒或噬菌体中，将该载体转移到原核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌母中，以及在适合的培养基中表达该DNA，优选允许所述细胞在细胞外分泌所述CNP肽，并收集和纯化制备的CNP肽的步骤。聚合酶链反应(PCR)技术也可用于扩增目标DNA。
本领域技术人员公知各种基本技术，例如基因重组、定点突变与PCR技术，其描述于例如J.Sambrook等人，Molecular Cloning，Alaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor laboratory Press(1990)；Ausubel等人，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons(1998)中，并且公开于其中的所述技术可被用于本发明中。作为所述载体，市售的载体或公开于出版物中的载体也可以被使用。
如在人CNP-22或CNP-53中所见的，可用于本发明的CNP衍生物具有CNP活性并具有环状肽结构，所述环状肽结构具有在两个半胱氨酸残基之间的二硫键。CNP衍生物的例子包括如上所描述的CNP片段；在上述CNP或其片段中具有由一个氨基酸被至少另一个氨基酸置换的肽；在上述CNP或其部分肽中具有至少一个氨基酸缺失的肽；以及在上述CNP或其部分肽中具有至少一个氨基酸附加的肽。如本文中所用的，氨基酸的置换、缺失或附加的意思是一定数量的氨基酸通过公知方法，例如定点突变而被置换、缺失或附加，但条件是不丧失该CNP的活性。例如，所述CNP-22或CNP-53衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的置换、缺失或附加，其具有CNP的活性。
通常，氨基酸的置换优选为保守氨基酸间的置换。保守氨基酸可根据，例如极性(或疏水性)或电荷类型来分类。非极性的、不带电荷的氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸等；芳族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；极性的不带电荷的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺等；带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；以及带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
在本发明中所述的CNP活性指作用于GC-B以增加鸟苷酸环化酶活性的活性，指消除、抑制或缓解关节炎(包括骨关节炎)的活性，以及指促进关节软骨生长的活性。所述CNP活性可通过测量细胞的鸟苷酸环化酶的活性，例如细胞内cGMP的产生量，和/或通过在一定时期向关节炎、骨关节炎或类类风湿性关节炎的小鼠或大鼠模型给药CNP或其衍生物，并如下文中实施例7-10中所述的测量关节炎或关节软骨变性抑制效果来测量。
CNP-22类似肽的例子包括描述于下的在日本专利公开6-9688A(1994)和国际公开WO 02/074234中的环状肽(其中下划线表示与人CNP-22的不同)。
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile GlyAlaMet Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO3)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGlnSer Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO4)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerAlaSer Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO5)Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu GlyCys(SEQ ID NO6)Ser Leu Arg Arg Ser SerCys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile GlySer Met Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO7)Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerMet Ser Gly Leu Gly CysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO8)Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly SerGlnSer Gly Leu GlyCysAsn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO9)Cys Phe GlyXaaXbbXccAsp Arg Ile GlyXddXeeSerXffXggGly Cys
(其中Xaa＝Leu，Ile，Val；Xbb＝Lys，Leu，Met；Xcc＝Leu，Ile，Ala，Val；Xdd＝Ser，Ala，Gly，Thr，Asn；Xee＝Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，Gly；Xff＝Gly，Lys，Als，Leu；Xgg＝Leu，Met)(SEQ ID NO10)。
CNP-53类似肽的例子包括环状肽，该环状肽包含类似于CNP-22类似肽的氨基酸变化。
本发明还提供关节软骨细胞生长促进剂，其包含GC-B活化剂作为活性组分。本发明基于GC-B活化剂的作用以增加关节软骨细胞。GC-B活化剂的例子为如上所定义的CNP或其衍生物。所述的CNP优选为包括人的哺乳动物的、或者鸟的CNP-22或CNP-53，并且更优选为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。所述的CNP衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时保持CNP的活性。其它的GC-B活化剂可以通过如下方式鉴定例如通过在培养细胞系如COS-7中表达GC-B受体，向该培养基中加入候选药剂，在一定时段和在一定温度下(例如37℃，5分钟)培养该细胞系，以及测量分子内cGMP的产生量(Science 1991，252120-123)。因此利用这样的试验体系和利用细胞内cGMP的产生量作为指标，GC-B活化剂可以被鉴定并用于本发明中。
本发明还提供抑制关节炎的方法，其中所述的关节炎通过活化GC-B被抑制。本发明还提供用于促进关节软骨细胞生长的方法，其包含通过活化GC-B而促进所述生长。本发明基于这样的发现通过利用GC-B活化剂或通过活化GC-B，可以抑制如上所定义的关节炎，优选骨关节炎，以及可以增强关节软骨细胞的生长。在本发明的一个实施方案中，所述的GC-B被如上所定义的CNP或其衍生物活化。
本发明进一步提供用于筛选关节软骨细胞生长促进剂的方法，其包含利用GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。因为已知通过鸟苷酸环化酶的活性，GC-B可催化从GTP合成第二信使cGMP，所述GC-B活性可以以细胞内cGMP的产生量来确定。
根据本发明的实施方案，如上所述的筛选方法可以包括如下步骤制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，并利用细胞的鸟苷酸环化酶活性，例如细胞内cGMP的产生量作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
根据本发明优选的实施方案，所述的筛选方法包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在测试物质存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，和利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量之间的差别作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
本发明的筛选方法可用于筛选关节软骨细胞生长促进剂，例如通过在培养细胞如COS-7中表达GC-B，向该培养物中加入候选药剂，在一定时间期限和在一定温度下(例如37℃，5分钟)培养该细胞，以及测量分子内cGMP的产生量(Science 1991，252120-123)。
本发明进一步提供筛选骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的治疗剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。如上所述，GC-B活性可以以鸟苷酸环化酶的活性确定，例如细胞内cGMP的产生量。
在本发明的一个实施方案中，如上所述的筛选方法可以包括如下步骤制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，并利用细胞的鸟苷酸环化酶活性，例如细胞内cGMP的产生量作为指标，筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
根据本发明优选的实施方案，所述的筛选方法包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在测试物质存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，和利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量的差别作为指标，筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药物的候选药剂。
本发明的筛选方法可用于筛选骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的治疗剂，例如通过在培养细胞如COS-7中表达GC-B，向培养物中加入候选药剂，在一定时间期限和在一定温度下(例如37℃，5分钟)培养所述细胞，以及测量分子内cGMP的产生量(Science 1991，252120-123)。
将本发明的用于关节炎如骨关节炎的治疗剂或预防剂，通过将如上所定义的作为活性成分的GC-B活化剂与药学可接受的载体、赋形剂、添加剂等组合而配制成用于口服或非肠道给药的制剂。
用于制剂的载体和赋形剂的例子包括乳糖、硬脂酸镁、淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、橄榄油、芝麻油、可可油脂、乙二醇，以及其它常用的试剂。
用于口服给药的固体组合物的例子包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂等。在这些固体组合物中，将至少一种活性成分与至少一种惰性稀释剂，例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、铝硅酸镁等混合。根据传统方法，所述组合物还可以包含不是惰性稀释剂的添加剂，例如润滑剂如硬脂酸镁，崩解剂如纤维状乙醇酸钙，和助溶剂如谷氨酸或天冬氨酸。片剂或丸剂，如果需要，可以用糖萼，如蔗糖、明胶或邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素，或者用胃溶薄膜或肠溶薄膜，或者用两层或更多层包被。还包含可吸收材料的胶囊，例如明胶。
用于口服给药的液体组合物可以包括药学可接受的乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂，并且还可以包括传统的惰性稀释剂，例如纯水和乙醇。该组合物可以包含不是惰性稀释剂的助剂，例如保湿剂和助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂和防腐剂。
非肠道注射的例子包括无菌水性溶液剂或非水性溶液剂、悬浮剂和乳剂。水性溶液剂和悬浮剂的例子包括注射用水和注射用生理盐水。非水溶液剂和悬浮剂的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、醇类例如乙醇以及聚山梨醇酯80。这些组合物可进一步包含助剂，例如防腐剂、保湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如乳糖)，以及助溶剂(例如谷氨酸或天冬氨酸)。上述物质可通过常规消毒方法消毒，例如用微过滤膜过滤消毒、加热消毒例如高压蒸汽灭菌，或者加入消毒剂。注射剂可以是液体制剂，或者是在使用前可以重新组构的冻干制剂。冻干用赋形剂的例子包括糖醇类和糖类，例如甘露醇和葡萄糖。
将本发明的治疗剂或预防剂通过药学常用的口服或非肠道给药方法给药。优选非肠道给药方法，例如注射(例如皮下、静脉、肌内和腹膜内注射)、经皮给药、经粘膜给药(例如经鼻和经直肠)，以及经肺给药。也可以采用口服给药。
作为包含于本发明组合物中的活性组分的GC-B活化剂，优选如上所定义的CNP或其衍生物的剂量，可以根据待治疗疾病的类型、疾病的严重性、患者的年龄等确定，其量通常可以是0.005μg/kg至100mg/kg，优选0.02μg/kg至5mg/kg，更优选0.02μg/kg至0.25mg/kg。然而对包含本发明的CNP活化剂的药物对于它们的剂量没有限制。
本发明的治疗剂或预防剂可以与常规的或新的治疗剂，例如抗炎药、透明质酸和肾上腺皮质甾体组合，以及与手术操作，例如关节镜(arthrosopic)手术、人工关节置换和骨切开术组合。
抗炎药物，特别是例如至少一种非甾体类抗炎药物与GC-B活化剂(例如如上所定义的CNP或其衍生物)的组合可以提供对关节炎的协同抑制作用(实施例10)。
本文中所用的“非甾体类抗炎药物”指不具有甾体骨架的抗炎药，并且优选具有抑制参与前列腺素生成的环氧合酶的作用。可用于本发明的非甾体类抗炎药物的例子包括但不限于，吲哚美辛(例如IndacinTM)、布洛芬(例如BrufenTM)、吡罗昔康、水杨酸、双氯芬酸(例如VoltarenTM)、酮洛芬、萘普生和吡罗昔康。
另外，如上所述的GC-B活化剂与非甾体类抗炎药物的组合的协同作用的意思是与单独使用GC-B活化剂相比，GC-B活性被增强了，或者换句话说，如上所述的非甾体类抗炎药物的活性成分在用GC-B活化剂活化GC-B中用作活化促进剂。
因此，本发明进一步提供GC-B活化剂的活化促进剂，其包含非甾体类活化剂。
GC-B活化剂包括如上所定义的CNP或其衍生物。CNP的例子为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53，更特定为SEQ IDNO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。CNP衍生物的例子包括具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，并保持CNP活性的那些。
在本发明中，如上所述的非甾体类活化剂优选环氧合酶抑制剂。该环氧合酶抑制剂的例子包括但不限于，吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康、水杨酸、双氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡罗昔康。
如上对本发明的治疗剂和预防剂所述的剂型、剂量和给药方法可以被用于本发明的活化促进剂。
本发明进一步提供活化GC-B活化剂的方法，其中使用如上所述的活化促进剂。
如上所述的本发明的活化促进剂和方法可被用于，例如通过活化GC-B而有效地在患者中治疗疾病，例如关节炎。
本发明包括但不限于如下方面。
(1)关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
(2)上述(1)的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎为骨关节炎。
(3)上述(2)的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为负重或非负重关节的骨关节炎。
(4)上述(3)的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为膝关节变性病。
(5)上述(3)的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为髋关节变性病。
(6)上述(3)的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为颞下颌关节炎。
(7)上述(1)的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎由类风湿性关节炎导致。
(8)上述(1)的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎由骨关节炎导致。
(9)上述(1)-(8)中任一项的治疗剂或预防剂，其中所述的GC-B活化剂为C型利钠利尿肽(CNP)或其衍生物。
(10)上述(9)的治疗剂或预防剂，其中所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
(11)上述(9)的治疗剂或预防剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(12)上述(9)的治疗剂或预防剂，其中所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，并具有CNP活性。
(13)上述(1)-(12)中任一项的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
(14)关节软骨细胞生长促进剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
(15)上述(14)的促进剂，其中所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
(16)上述(15)的促进剂，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
(17)上述(15)的促进剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(18)上述(15)的促进剂，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
(19)上述(14)-(18)的促进剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
(20)用于抑制关节炎的方法，其中所述的关节炎通过活化GC-B被抑制。
(21)上述(20)的抑制方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
(22)上述(21)的抑制方法，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
(23)上述(21)的抑制方法，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(24)上述(21)的抑制方法，其中所述衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
(25)上述(20)-(24)的抑制方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
(26)用于促进关节软骨细胞生长的方法，其中所述的关节软骨细胞生长通过活化GC-B被促进。
(27)上述(26)的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
(28)上述(27)的方法，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
(29)上述(27)的方法，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(30)上述(27)的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP的活性。
(31)上述(26)-(30)的任一项中的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
(32)用于筛选关节软骨细胞生长促进剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞的候选药剂。
(33)上述(32)的方法，其包括制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，以及利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
(34)上述(32)-(33)的方法，其中所述的GC-B活性以细胞内cGMP的产生量确定。
(35)上述(32)-(34)的方法，其包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在测试物质存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，以及利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量的差别作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
(36)筛选用于骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的治疗剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
(37)上述(36)的方法，其包括制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，并利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
(38)上述(36)-(37)的方法，其中所述的GC-B活性以细胞内cGMP的产生量确定。
(39)上述(36)-(38)中任一项的方法，其包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在测试物质存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，以及利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量的差别作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
(40)骨关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
(41)上述(40)的骨关节炎的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
(42)类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
(43)上述(42)的类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
(44)治疗关节炎的方法，其包括对需要关节炎治疗的病人给药GC-B活化剂。
(45)上述(44)的方法，其中所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
(46)上述(44)或(45)的方法，其中所述的关节炎为骨关节炎。
(47)上述(46)的方法，其中所述的骨关节炎为负重或非负重关节的骨关节炎。
(48)上述(47)的方法，其中所述的骨关节炎为膝关节变性病、髋关节变性病或颞下颌关节炎。
(49)上述(44)的方法，其中所述的关节炎由类风湿性关节炎导致。
(50)上述(44)的方法，其中所述的关节炎由骨关节炎导致。
(51)上述(45)-(50)中任一项的方法，其中所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
(52)上述(45)-(50)中任一项的方法，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(53)上述(45)-(50)中任一项的方法，其中所述衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
(54)上述(44)-(53)中任一项的方法，其中所述的GC-B活化剂包含于与至少一种非甾体类抗炎药的组合中。
(55)GC-B活化剂的活化促进剂，其包含非甾体类活化剂。
(56)上述(55)的活化促进剂，其中所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
(57)上述(56)的活化促进剂，其中所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
(58)上述(56)的活化促进剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
(59)上述(56)的活化促进剂，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
(60)上述(55)的活化促进剂，其中所述的非甾体类活化剂为环氧合酶抑制剂。
(61)上述(60)的活化促进剂，其中所述的环氧合酶抑制剂选自吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康、水杨酸、双氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡罗昔康。
(62)活化GC-B活化剂的方法，其中使用根据上述(55)-(61)中任一项所述的活化促进剂。
通过如下实施例将更详细地描述本发明，这些实施例进用于举例说明的目的，并且不意于限制本发明的范围。因此本发明不受这些实施例限制。
实施例实施例1用于制备CNP转基因小鼠的载体的构建如图1A所示，将鼠CNP cDNA(526bp；FEBS Lett.276209-213，1990)亚克隆到pGEM-T easy载体(Promega)中，然后将其用Pst I切断并对断端进行平滑化处理以制备小鼠CNP cDNA。如图1C所示，将所述载体PSG 1(Promega；图1B)用EcoRI切断，对断端进行平滑化并用所述鼠CNP cDNA结扎(ligation)，以制备SAP-mCNP载体(pSG1-CNP)。
实施例2CNP转基因小鼠的制备注射用DNA片段制备如下。具有插入CNP基因的SAP-mCNP载体(pSG1-CNP；图1C)首先用Hind III和Xho I处理以切出包含所述CNP基因的片段(约2.3kb)。然后将该片段用Gel Extraction Kit(QIAGEN)收集并用PBS-稀释到浓度为3ng/μl，因此获得注射用DNA片段(图2)。
将其中注射入所述DNA片段注的前核期小鼠卵子，以如下方法收集。首先向C57BL/6雌性小鼠(Clea Japan，Inc.)腹膜内注射5i.u.的孕马血清促性腺激素(PMSG)，并于48小时后注射5i.u.的人绒膜促性腺激素(hCG)，以诱导过排卵。将这种小鼠与同系统的雄性小鼠杂交。在杂交的第二天早晨，在雌性小鼠中确定存在栓塞，并且随后灌流输卵管以收集前核期小鼠卵子。
用显微操作器将所述注射用DNA片段注射到所述前核期小鼠卵子中(Latest Technology in Gene Targeting(Yodosha，Japan)，190-207，2000)。特别地，将所述DNA片段注射到660 C57BL/6J胚胎中，在随后的几天中，在假妊娠的第1天将在2-细胞期的561个胚胎移殖到受体母鼠的输卵管中，输卵管的每一边约10个(每只动物约20个)。
将没有在预产期产仔的受体母鼠进行剖腹产，所出生的产自由养母喂养。总共获得136个产仔，其中5个为具有导入的CNP基因的转基因小鼠(下文中指定为“Tgm”)。下文中，将最初获得的小鼠指定为建立者(Founder)。
所有的建立者小鼠都为雄性，随后的产仔(即F1小鼠)从五个系中的四个获得。
实施例3CNP转基因小鼠的基因型分析根据如下所述的方法通过DNA印记法进行基因型分析。
尾巴(约15mm)取自3周大的小鼠并用蛋白酶K处理(在55℃下，在100rmp下振荡一天一夜)以获得溶胞液。然后将所获得的溶胞液经过自动化核酸分离器(KURABO NA-1000；Kurabo，日本)以制备基因组DNA。该基因组DNA(15μg)用Pvu II(200U)处理，然后用苯酚-氯仿处理以除去限制酶，并且用乙醇沉淀以收集DNA。将获得的DNA溶解于25μl的TE中并经过在0.7％的琼脂糖凝胶上的电泳(在50V恒定电压下)，然后将该凝胶用0.25M HCl溶液处理15分钟以切断所述DNA，用水洗涤，并将其过夜印记于在0.4M的NaOH溶液中的尼龙膜上。然后将在所述膜上的DNA用紫外交联法固定。将所述膜用杂交溶液(50％甲酰胺，0.5x Denhard’s，0.5％SDS，5x SSPE)处理，并利用所述CNP cDNA作为模板，将已经用BcaBEST Labeling Kit(TaKaRa，日本)制备的32P标记探针加入到该膜上以便在42℃过夜的情况下实现杂交。在用洗净溶液(2x SSC，0.1％SDS)在55℃处理20分钟后，将所述膜暴露于Imaging Plate(Fuji Film)过夜以用BAS2000(Fuji Film，日本)检测转基因的信号(图3)。在野生型小鼠(WT)中，检测到3个信号(野生型CNP基因)，而在转基因小鼠(Tgm)中，除了野生型CNP基因外，还检测到转基因由来的2个信号(转基因)。
实施例4在CNP转基因小鼠中的CNP表达将CNP-22EIA测量试剂盒(PHOENIX PHARMACEUTICALSINC.)用于CNP水平的测定。
7周大的雄性和雌性CNP转基因小鼠各三只，以及雄性和雌性的同腹小鼠各三只，将它们在乙醚麻醉下通过从后腔静脉放血实施安乐死。
将肝脏——预计表现出高度表达所述转基因的器官——切除，并将上述的得自测量试剂盒的EIA试验缓冲液以每0.1g肝脏重1mL的量加入其中，随后在冰上冷却。将肝脏在Waring混合器(Physcotron)中均质化，并在离心(2,000rpm，5分钟)后将上层清液用作用于测定CNP-22水平的样品。
将一毫克的乙二胺四乙酸四钠盐(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)和2个胰蛋白酶抑制单位的抑肽酶(Sigma)加入到抽取的血液中并搅动以分离血浆，将其用作用于测定CNP-22水平的样品。
结果示于表1中。
表1在CNP转基因小鼠中的CNP表达
**p＜0.01(非成对Student t检验)#p＜0.05(Wilcoxon秩和检验)CNP转基因小鼠在肝脏和血浆中的CNP-22水平，当与野生型小鼠的平均值±SD值相比时，分别比野生型小鼠高约10倍和约24倍。每种情况下的差别均具有统计学显著性。从这些结果可以确定的是，在CNP转基因小鼠中CNP肽被过剩表达。
实施例5CNP转基因小鼠的关节软骨的组织学分析。
为了从组织学上分析生长软骨的厚度，将5只每只9周大的雌性CNP转基因小鼠和雌性正常同腹小鼠，在乙醚麻醉下通过从后腔静脉放血实施安乐死。并将大腿骨用20％福尔马林固定一周。在浸泡于20％的EDTA-4Na(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)水溶液(pH 4.4)中脱钙后，将股骨膝盖骨面经历中线矢状断面，并通过常规方法包埋于石蜡中以制备石蜡块。将4μm厚的切片用切片机进一步切片以制备石蜡切片，将其用苏木精和曙红染色。对于生长软骨的厚度，将用目镜(×10)观察的一个显微视野结合于图像分析软件(IPAP，Sumika technoservice，日本)，并且休止层、增殖层和肥大层的每层厚度用相同的软件在显微视野中在5个点处测量，并将计算的平均值作为个体每层的厚度。三层的总厚度被认为是个体的生长软骨的厚度。在CNP转基因小鼠和正常同腹小鼠之间计算这些项目的平均值和标准偏差(用Microsoft Excel2000，Microsoft)，并且用非成对Student t检验(SAS版本6.12；SASInstitute Japan，日本)进行统计分析。
CNP转基因小鼠，雄性和雌性，都说明它们具有统计学显著性更厚的关节软骨细胞(图4)。另外，在雄性和雌性CNP转基因小鼠中都显示出统计学显著性更大的每显微视野下的关节软骨细胞数(图5)。
这些结果说明GC-B(NPR-B)活化物质如CNP可通过增加软骨细胞数，以及通过通常已知的由于个体软骨细胞过度增长导致的细胞数量的增加而增加关节软骨的厚度(J Biol Chem 2003；278(21)18824-32)。
实施例6CNP转基因小鼠对骨关节炎模型的耐受性通过向小鼠的膝关节中注射胶原酶以使膝关节韧带和半月板不稳定而建立骨关节炎动物模型(Am.J.Pathol.1989；1351001-14)。利用CNP转基因小鼠在这个动物模型中评价对关节炎和关节软骨变性耐受性以确定对骨关节炎的预防和治疗作用。将6μl的3％的II型胶原酶(Sigma)的生理盐水溶液两次注射(初始给药日和7天后)到CNP转基因小鼠和同腹野生型C57BL/6系小鼠的右膝关节中。在给药后28天中用游标卡尺(Mitutoyo Corp.，日本)及时测量左膝和右膝二关节的宽度，计算右膝和左膝关节间的差别以表示膝关节的肿胀程度。通过梯形法计算连续变化的时间-阶段曲线下面积(AUC)，并通过Student t检验比较CNP转基因小鼠和野生型小鼠。结果，在转基因小鼠中的AUC比在野生型中显著性地更小，这说明CNP转基因小鼠对由胶原酶导致的膝关节肿胀有耐受性(图6)。为了进行关节炎和关节软骨变性的组织学评价，在给药胶原酶后第28天，在乙醚麻醉下通过从后腔静脉放血而实行安乐死，而后将膝关节切除，如实施例5中所述的制备苏木精-曙红染色的和番红精O染色的样品，并进行组织学分析。结果，野生型小鼠显示在滑膜中，胶原酶诱导显著的滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞渗透，而这些变化在CNP转基因小鼠中显著降低(图7)。对于关节软骨的变性，野生型小鼠显示出在关节软骨中降低的番红精O的染色能力和降低的蛋白多糖含量，而这些变化在CNP转基因小鼠中是轻微的，这提供了CNP转基因小鼠抵抗由给药胶原酶导致的在关节软骨中变性变化的组织学证据(图8)。利用EIA药剂盒(Phoenix Pharmaceutical)测定的血浆CNP平均水平在野生型小鼠中为0.21ng/mL，和在CNP转基因小鼠中为0.50ng/mL。
这些结果揭示了CNP具有对在骨关节炎中的关节软骨中的关节炎和变性变化的抑制作用。
实施例7CNP输注对骨关节炎模型的治疗作用(1)将包含如下溶液的渗透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠背部进行皮下移植。
·溶剂包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明质酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸馏水。
·10μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
·100μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(600ng/天)。
移植后6天，将6μL的1.5％的II型胶原酶(Sigma)溶液注射到右膝关节中，在注射后28天用游标卡尺(Mitutoyo Corp.，日本)及时测量右膝关节和左膝关节的宽度，计算右膝和左膝二关节间的差别。这个差别表示膝关节的肿胀程度，并且通过Student t检验(SAS版本6.12)比较溶剂对照组和CNP组之间的AUC。结果表明与溶剂对照组相比，在CNP-22组中在每个剂量下，AUC的值显著更低。根据实施例5中的方法制备苏木精-曙红染色的和番红精O染色的样品，并进行组织学分析。
结果，溶剂对照组显示出在滑膜中由胶原酶诱导的显著的滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞渗透，而这些变化在CNP组中显著降低(图9)。从滑膜组织得出的这些结果显示CNP具有对骨关节炎的治疗作用。
实施例8CNP输注对骨关节炎模型的治疗作用(2)将包含如下溶液的渗透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠(CLEA Japan，日本)背部进行皮下移植。
·溶剂包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明质酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸馏水。
·10mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
·100mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(600ng/天)。
在植入后第二天，将小鼠用乙醚麻醉并经过外科手术过程，切除右膝关节中前十字韧带、切除胫骨内侧副韧带和整体切除中间半月板以诱导骨关节炎。在给药后11天用游标卡尺(Mitutoyo Corp.)及时测量右膝关节和左膝关节的宽度，计算右膝和左膝关节间的差别。这个差别表示膝关节的肿胀程度，并且通过Student t检验(SAS PreclinicalPackage，Institute Japan，日本)比较溶剂对照组和CNP组间的AUC。结果表明与溶剂对照组相比，在CNP-22组中，在每个剂量下，AUC的值显著更低(图10)。
这些结果表明CNP还对抑制骨关节炎中的关节炎有效，所述骨关节炎由外科手术过程导致的膝关节物理负载过重导致。
实施例9非甾体类抗炎药(NSAID)和CNP在胶原酶OA模型中的组合作用将包含如下溶液的渗透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性C57BL/6J系小鼠背部进行皮下移植。
·溶剂包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明质酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸馏水。
·1μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(6ng/天)。
另外，为了检测当单独使用和与CNP结合使用NSAID吲哚美辛(Sigma)的作用，从如上所述的泵移植的日期开始，将吲哚美辛在0.2％羧甲基纤维素(Nacalai Tesque Inc.，日本)中的悬浮液以强迫口服方式给药1mg/kg，一天1次，连续4天。
如下设置实验组。
溶剂对照组(输注溶剂，口服给药溶剂)CNP 6ng/天吲哚美辛 1mg/kg
CNP 6ng/天+吲哚美辛1mg/kg在植入泵的当天和第二天，分别向右膝中输注6μL的0.15％的II型胶原酶(Sigma)和6μL的1.5％的II型胶原酶溶液，在输注后7天，用游标卡尺(Mitutoyo Corp.)每天测量右膝关节和左膝关节的宽度，计算右膝和左膝关节间的差别。这个差别表示膝关节的肿胀程度，并且通过Student t检验(SAS版本6.12)比较溶剂对照组和CNP组间的AUC。
结果，当单独使用吲哚美辛时，不会抑制膝关节肿胀。给予6ng/天的CNP组显著地抑制膝关节肿胀。给予CNP和吲哚美辛组合组显示比单独给予CNP组显著更强的抑制膝关节肿胀作用(图11)。这些结果显示当CNP单独使用时其具有比NSAID更有效的抑制膝关节肿胀的作用，它是标准的抗关节炎药物，并且当与NSAID结合使用时还具有协同作用。
实施例10CNP对辅助关节炎大鼠模型的作用将包含如下溶液的渗透泵(2004型，Durect)在9周大的雄性LEW/Crj系大鼠(Charles River Laboratories Japan，Inc.，日本)背部进行皮下移植。
·溶剂包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明质酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸馏水。
·10μg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(60ng/天)。
在移植的第二天，将不再有传染力的肺结核病菌的粉末(M.TUBERCULOSIS DES.H37 RA DIFCO LABORATORIES)悬浮于液体石蜡(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)中，浓度为3mg/mL，将50μL接种于大鼠尾的根部皮肤中。接种后，利用计分体系根据如下标准每天评价四肢末端的状况，计算四肢末端得分的总和以表示个体关节炎的得分。
0分没有损害1分在一个或多个指关节中观察到突发/肿胀。或者在没有肿胀的爪子的背部发红。
2分在前肢或后肢的背部发生轻度肿胀。
3分在前肢或后肢的背部发生严重肿胀，但没有在所有的指头中发生。
4分在前肢或后肢的背部和指部发生严重肿胀。
结果表明，在CNP组中比在溶剂对照组中一定程度上关节炎得分更低(图12A)。
还测量了基于每天的体重变化。结果显示与溶剂对照组相比，在CNP组中体重增加明显(图12B)。
这些结果说明CNP在辅助大鼠模型中也可抑制关节炎并改善总体症状。
实施例11CNP对胶原质关节炎大鼠模型的作用将包含如下溶液的渗透泵(2004型，Durect)在10周大的雌性DA/Slc系大鼠(Japan SLC，Inc.，日本)背部进行皮下移植。
·溶剂包含5％右旋糖(Junsei Chemical Co.，Ltd.，日本)、10％甘露糖(Nacalai Tesque Inc.，日本)和5mmol/L透明质酸(Wako PureChemical industries，日本)的蒸馏水。
·1mg/mL的CNP-22(Calbiochem Novabiochem)的溶液(6μg/天)。
在移植后，立即将牛II型胶原质溶解于0.1mol/L乙酸水溶液中制成1.5mg/mL，并将其悬浮于等体积的不完全弗氏佐剂(DIFCOLABORATORIES)中，并将400μL的悬浮液接种到大鼠背部的皮肤中。也测量了基于每天的体重变化。另外，在既没有泵抑制也没有接种的正常组中也测量基于每天的体重变化。
结果，与正常组相比，在溶剂对照组中体重显著降低，而在CNP组中体重降低比溶剂对照组显著更小(图13)。这些结果说明CNP改善了在胶原质关节炎大鼠模型中的总体症状。
工业适用性因为本发明的包含GC-B活化剂作为活性成分的治疗剂或预防剂可以增加关节软骨的厚度和关节软骨细胞数，提供对关节肿胀的耐受性，抑制关节软骨中的变性变化，使滑膜细胞生长、肉芽组织形成和炎性细胞渗透的变化显著降低，并避免了在关节软骨中蛋白多糖含量的降低，因此它们可用于治疗或预防包括骨关节炎的关节炎，例如膝关节变性病、髋关节变性病、肘骨关节炎、脊骨关节炎和颞下颌关节病。给药本发明的药物组合物可导致对在受感染关节部分的关节软骨基质和软骨细胞的降低的抑制或使其再生，并抑制在关节软骨中的变性变化和在关节部分中的肿胀，这导致对关节炎疾病的抑制或降低。具体而言，由于本发明的骨关节炎的治疗剂与常规的整形外科手术，例如关节镜手术、人工关节替代和骨切开术相比，对病人造成更少的负荷和痛苦，因此它们提供了具有使病人满意的QQL的优异治疗剂。
GC-B活化剂具有如上所述的效力，这个新的发现意义是，通过活化GC-B抑制关节炎并促进关节软骨细胞生长是可能的。另外，利用GC-B活性(例如细胞内cGMP的产生量)作为指标，筛选关节软骨细胞生长促进剂和关节炎治疗剂也是可能的。
本文中引用的所有的出版物、专利和专利申请通过引用其全部内容而并入本发明。
序列表的自由原文SEQ ID NO1的说明二硫键形成于6-Cys和22-Cys之间。
SEQ ID NO2的说明二硫键形成于37-Cys和53-Cys之间。
SEQ ID NO3的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于6-Cys和22-Cys之间。
SEQ ID NO4的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于6-Cys和22-Cys之间。
SEQ ID NO5的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于6-Cys和22-Cys之间。
SEQ ID NO6的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于1-Cys和17-Cys之间。
SEQ ID NO7的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于7-Cys和23-Cys之间。
SEQ ID NO8的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于6-Cys和22-Cys之间。
SEQ ID NO9的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中二硫键形成于1-Cys和17-Cys之间。
SEQ ID NO10的人工序列的说明CNP-22衍生物，其中4-Xaa＝Leu，Ile，Val；5-Xaa＝Lys，Leu，Met；6-Xaa＝Leu，Ile，Ala，Val；11-Xaa＝Ser，Ala，Gly，Thr，Asn；12-Xaa＝Met，Ala，Trp，His，Lys，Ser，Gly；14-Xaa＝Gly，Lys，Ala，Leu；15-Xaa＝Leu，Met，并且二硫键形成于1-Cys和17-Cys之间。
序列表<110>中尾一和(Nakao，Kazuwa)；中外制药株式会社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKIKAISHA)<120>关节炎的治疗剂或预防剂<130>SCT064756-65<150>JP 2004-107924<151>2004-03-31<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>22<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
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Met Ser Gly Leu Gly Cys20<210>2<211>53<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>DISULFID<222>(37)..(53)<223>A disulfide bond is formed<400>2Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu1 5 10 15Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly20 25 30Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met35 40 45Ser Gly Leu Gly Cys50<210>3<211>22
<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>3Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala1 5 10 15Met Ser Gly Leu Gly Cys20<210>4<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>4Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser1 5 10 15
Gln Ser Gly Leu Gly Cys20<210>5<211>22<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(6)..(22)<223>A disulfide bond is formed<400>5Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp ArgIle Gly Ser1 5 10 15Ala Ser Gly Leu Gly Cys20<210>6<211>17<212>PRT<213>Artificial Sequence<220>
<221>DISULFID<222>(1)..(17)
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<221>DISULFID<222>(7)..(23)<223>A disulfide bond is formed<400>7Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys20<210>8<211>27
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<221>DISULFID<222>(1)..(17)<223>A disulfide bond is formed<400>9Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly1 5 10 15
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权利要求
1.关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
2.权利要求1的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎为骨关节炎。
3.权利要求2的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为负重或非负重关节的骨关节炎。
4.权利要求3的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为膝关节变性病。
5.权利要求3的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为髋关节变性病。
6.权利要求3的治疗剂或预防剂，其中所述的骨关节炎为颞下颌关节炎。
7.权利要求1的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎由类风湿性关节炎导致。
8.权利要求1的治疗剂或预防剂，其中所述的关节炎由骨关节炎导致。
9.权利要求1-8中任一项的治疗剂或预防剂，其中所述的GC-B活化剂为C型利钠利尿肽(CNP)或其衍生物。
10.权利要求9的治疗剂或预防剂，其中所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
11.权利要求9的治疗剂或预防剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
12.权利要求9的治疗剂或预防剂，其中所述的衍生物具有在SEQID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
13.权利要求1的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
14.关节软骨细胞生长促进剂，其包含GC-B活化剂作为活性成分。
15.权利要求14的促进剂，其中所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
16.权利要求15的促进剂，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
17.权利要求15的促进剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
18.权利要求15的促进剂，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
19.权利要求14的促进剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
20.抑制关节炎的方法，其中所述的关节炎通过活化GC-B被抑制。
21.权利要求20的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
22.权利要求21的方法，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
23.权利要求21的方法，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
24.权利要求21的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
25.权利要求20的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
26.促进关节软骨细胞生长的方法，其中所述的生长通过活化GC-B被促进。
27.权利要求26的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物活化。
28.权利要求27的方法，其中所述的CNP为包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22或CNP-53。
29.权利要求27的方法，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
30.权利要求27的方法，其中所述的衍生物具有在SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
31.权利要求26的方法，其中所述的GC-B被CNP或其衍生物与至少一种非甾体类抗炎药的组合活化。
32.筛选关节软骨细胞生长促进剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
33.权利要求32的方法，其包括制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，以及利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
34.权利要求32或33的方法，其中所述的GC-B活性以细胞内cGMP的产生量确定。
35.权利要求32的方法，其包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在候选药剂存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，以及利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量之间的差别作为指标筛选能够促进关节软骨细胞生长的候选药剂。
36.筛选用于骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的治疗剂的方法，其包括利用GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
37.权利要求36的方法，其包括制备表达GC-B的培养细胞或者得自关节软骨细胞的细胞，在候选药剂的存在下培养所述细胞，并利用细胞的GC-B活性作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
38.权利要求36或37的方法，其中所述的GC-B活性以细胞内cGMP的产生量确定。
39.权利要求36的方法，其包括制备已强制表达GC-B的培养细胞系，在候选药剂存在或不存在下培养所述细胞系，确定细胞内cGMP的产生量，以及利用在候选药剂存在和不存下的细胞内cGMP的产生量之间的差别作为指标筛选能够治疗骨关节炎、类风湿性关节炎或其它关节炎的药剂的候选药剂。
40.骨关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
41.权利要求40的骨关节炎的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
42.类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂，其包含鸟苷酸环化酶B(GC-B)活化剂作为活性成分。
43.权利要求42的类风湿性关节炎的治疗剂或预防剂，其进一步包含至少一种非甾体类抗炎药。
44.GC-B活化剂的活化促进剂，其包含非甾体类活化剂。
45.权利要求44的活化促进剂，其中所述的GC-B活化剂为CNP或其衍生物。
46.权利要求45的活化促进剂，其中所述的CNP选自包括人的哺乳动物或者鸟由来的CNP-22和CNP-53。
47.权利要求45的活化促进剂，其中所述的CNP为SEQ ID NO1的CNP-22或SEQ ID NO2的CNP-53。
48.权利要求45的活化促进剂，其中所述的衍生物具有在SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、置换或附加，同时具有CNP活性。
49.权利要求44的活化促进剂，其中所述的非甾体类活化剂为环氧合酶抑制剂。
50.权利要求49的活化促进剂，其中所述的环氧合酶抑制剂选自吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康、水杨酸、双氯芬酸、酮洛芬、萘普生和吡罗昔康。
51.GC-B活化剂的活化方法，其中使用根据权利要求44-50中任一项所述的活化促进剂。
全文摘要
本发明提供用于关节炎如骨关节炎的新型治疗剂或预防剂。具体地，本发明提供用于关节炎如骨关节炎的治疗剂或预防剂，或者关节软骨细胞生长促进剂，所述药剂包含鸟苷酸环化酶B(GC－B)活化剂作为活性成分；或者用于通过活化GC－B而抑制关节炎或促进关节软骨生长的方法；或者利用所述GC－B活性作为指标筛选关节软骨细胞生长促进剂或能够治疗关节炎的药剂的方法。
文档编号A61P17/00GK1960758SQ200580017490
公开日2007年5月9日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者中尾一和, 北村秀智 申请人:中外制药株式会社, 中尾一和