专利名称：伊立替康制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在封闭囊泡载体中高度载带伊立替康(Irinotecan)及/或其盐的伊立替康制剂及含有该制剂的药物组合物。
背景技术：
拓扑异构酶抑制剂是一类用于癌症治疗的医药品，例如有喜树碱(camptothecin)。喜树碱是1966年由美国Wall等从中国原产植物喜树(Camptotheca acuminata)中提取、分离得到的五环生物碱，具有较高的抗肿瘤活性和较广的抗肿瘤谱(参见非专利文献1)。现有的癌症化疗制剂通过抑制II型拓扑异构酶显示抗肿瘤活性，而喜树碱通过抑制I型拓扑异构酶，抑制在DNA复制、修复、基因重组及转录中发挥作用的拓扑异构酶的作用。
但喜树碱在作为药物使用中存在一些问题，其中关于水不溶性，已提出几个对其进行改良的水溶性喜树碱类似物(例如参见专利文献1)。其中，1994年曾在日本国内上市的喜树碱的水溶性衍生物盐酸伊立替康(CPT-11)，虽然为药物前体，但由于具有高度的抗肿瘤活性，因此在医疗领域受到极大的期待。作为药物前体的盐酸伊立替康，给药后代谢成活性体SN-38，显示抗肿瘤活性。
另一方面，由于伊立替康及其盐的给药产生骨髓功能抑制、胃肠障碍等严重的副作用，因此对其使用加以严格的限制。另外，还存在由于喜树碱及其类似物特有的对水性环境的敏感性，其α-羟基内酯环水解，抗肿瘤活性减弱的问题。
为解决上述问题，使用细胞周期特异性代谢拮抗物质喜树碱类似物进行最适的抗癌治疗时，必须能够长时间维持药物的局部浓度。但实际上，静脉内或皮下给与上述药物后，其半衰期较短，仅为数小时。上述药物制成可用来转运治疗浓度的医药的控释制剂是有效的。为能稳定且高效地转运至目标病灶部位，在目标病灶部位显示抗肿瘤活性，作为方法之一，可以考虑使用封闭囊泡形态的载体进行载带。已经提出几个喜树碱类的脂质体制剂化方案，例如，公开了通过使喜树碱包含于脂质体膜中，从而抑制α-羟基内酯环水解(例如参见专利文献2、非专利文献2等)。另外，公开了一种使盐酸伊立替康活性体SN-38本身包含于脂质体膜中的方法(例如参见非专利文献3、非专利文献4等)。但是，由于SN-38在脂质体膜中难于稳定化，在血液中迅速消失，因此难于较长时间维持SN-38在血浆中的浓度。
还公开了采用通过被动包埋方法将水溶性衍生物盐酸伊立替康封入脂质体中，静电固定此脂质双层膜使其稳定化的常用方法(Passive loading法)进行制备的例子(参见非专利文献5)。
专利文献1特公平3-4077号公报专利文献2特表平9-504517号公报非专利文献1Am.Chem.Soc.，94(1966)，388非专利文献2Tomas G.Burke等，生物化学，32(1993)，5352-5364非专利文献3W.Gao等，J.of Chromatography B，791(2003)，85-92非专利文献4JoshuaWilliams等，J.of Controlled Release，91(2003)，167-172非专利文献5Yasuyuki Sazuka等，癌症快报127(1998)，99-106发明内容通过如上所述的现有公开的盐酸伊立替康的包埋方法(Passiveloading法)加入脂质体中的盐酸伊立替康的量约为0.05(药物(mol)/总脂质(mol))，在上述载带量的情况下，难以长时间维持盐酸伊立替康在血浆中的浓度，进而也难以长时间维持其活性代谢物7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)在血浆中的浓度，对于临床效果而言，浓度并不够。另外，虽然通过脂质体化能够改善盐酸伊立替康的血中滞留性，但从自血中的消失速度依然较快的方面来看，难于长时间维持活性代谢物SN-38在血浆中的浓度。
出于长时间维持盐酸伊立替康活性代谢物SN-38在血浆中的浓度的目的，希望开发这样一种制剂，即，在封闭囊泡中以临床上适当·充分的包埋量包封前体药物伊立替康及/或其盐，并且以抑制α-羟基内酯环水解的状态长时间存在于血液中，能够长时间维持活性代谢物SN-38在血浆中的浓度，但这样的制剂目前还没有。
鉴于上述状况，本发明的目的在于提供一种伊立替康制剂，所述伊立替康制剂是一种实现了对临床效果来讲充分的药物包埋量的制剂，以至少0.07(药物(mol)/总脂质(mol))的高载带量在封闭囊泡中包埋伊立替康及/或其盐，能够长时间维持盐酸伊立替康活性代谢物SN-38在血浆中的浓度。
本发明人为实现上述目的进行研究，结果发现，作为向封闭囊泡中加入伊立替康及/或其盐的药物包埋方法，特别是选择使封闭囊泡内侧/外侧间形成离子梯度，透过封闭囊泡的膜导入药物的采用离子梯度的Remote loading(远程装填)法时，不仅能够实现目前被动装填(Passive loading)法中难以达到的的高浓度包埋，而且与现有方法中配制的脂质体相比显著提高血中滞留性，从而能够长时间维持盐酸伊立替康活性代谢物SN-38在血浆中的浓度。还发现，通过选择远程装填法能够显著性提高37℃下的制剂稳定性、4℃下的长期制剂稳定性。通过上述结果确认，可以获得在封闭囊泡内以对于临床效果而言充分的药物包埋量即0.07(药物(mol)/总脂质(mol))的高载带量包封的伊立替康制剂。但是对以上述浓度包封于封闭囊泡内的伊立替康及/或其盐、且长时间维持盐酸伊立替康的活性代谢物SN-38在血浆中的浓度的制剂尚无报道。因此，作为解决上述课题的方法，提供下述的本发明。
(1)一种伊立替康制剂，是在由脂质膜形成的封闭囊泡中以至少0.07mol/mol(药物mol/膜总脂质mol)的浓度包封伊立替康及/或其盐而形成的。
在优选例中，伊立替康制剂以至少高于0.1mol药物/mol脂质的浓度载带药物。
本发明伊立替康制剂的平均粒径优选为0.02～250μm。
在本发明中，在封闭囊泡中伊立替康及/或其盐以高浓度包埋，例如能够通过利用下述离子梯度的远程装填(Remote loading)实现。
(2)如(1)中所述的伊立替康制剂，所述伊立替康制剂在所述封闭囊泡的内水相和外水相之间具有离子梯度。通过上述离子梯度，伊立替康及/或其盐能够在离子化状态下以上述浓度保持在封闭囊泡中。
(3)如(2)所述的伊立替康制剂，其中所述离子梯度为质子浓度梯度，具有所述内水相侧pH比外水相侧pH低的pH梯度。
(4)如(3)所述的伊立替康制剂，其中所述pH梯度通过铵离子浓度梯度及/或具有可质子化的氨基的有机化合物的浓度梯度形成。例如，通过使内水相侧的上述铵离子浓度比外水相侧高，能够形成内水相侧pH比外水相侧pH低的pH梯度。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的伊立替康制剂，其中所述封闭囊泡是由含有磷脂作为主要膜材的脂质双层膜形成的脂质体。
在上述(5)中，优选主要膜材为相转移点为50℃以上的磷脂。
作为磷脂，优选举例说明，具体而言为氢化磷脂及/或鞘氨醇磷脂。
(6)上述脂质体还可以含有除上述磷脂以外的脂质及/或表面修饰剂。
作为其他脂质，优选胆固醇。
作为表面修饰剂，优选举出亲水性高分子衍生物。亲水性高分子衍生物，具体而言可以举出分子量为500～10000道尔顿的聚乙二醇，作为其磷脂或胆固醇衍生物导入。
(7)如(6)所述的伊立替康制剂，在含有亲水性高分子衍生物作为表面修饰剂的方案中，优选只有上述脂质体的外表面用亲水性高分子衍生物进行修饰。
(8)在上述(6)或(7)的伊立替康制剂中，优选含有具有碱性官能团的化合物作为所述表面修饰剂。
作为具有碱性官能团的化合物，可特别优选举出3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐。
(9)一种药物组合物，含有上述(1)～(8)中任一项所述伊立替康制剂。
(10)一种疾病的预防及/或治疗方法，所述方法是给与宿主预防及/或治疗有效量的上述(1)～(8)中任一项所述的伊立替康制剂。
(11)一种方法，该方法是给与宿主(1)～(8)中任一项所述的伊立替康制剂，在宿主内释放有效量的伊立替康及/或其盐。
(12)一种方法，该方法是给与宿主(1)～(8)中任一项所述的伊立替康制剂，在目标部位暴露有效量的伊立替康及/或其盐。
本发明中提供的伊立替康制剂，以至少0.07(药物(mol)/总脂质(mol))的载带量包封伊立替康及/或其盐，以足以产生临床效果的高浓度含有伊立替康及/或其盐。另外，如后述实施例所示，本发明的伊立替康制剂与现有公知的伊立替康脂质体制剂相比，能够显著地提高血中滞留性，长时间存在于血液中。还能够显著提高37℃下的制剂稳定性、4℃下的长期制剂稳定性。
为表示实施例1中配制的CPT-11制剂在37℃下的制剂加速稳定性试验结果(释放率)的图。
为表示实施例3中配制的CPT-11制剂在37℃下的制剂加速稳定性试验结果(释放率)的图。
为表示实施例3中配制的CPT-11制剂在37℃下的制剂加速稳定性试验结果(粒径)的图。
为表示在血中滞留性试验中，在注射后采血时间的血浆(Plasma)中的盐酸伊立替康浓度的图。
为表示CPT-11的包埋率(％)与开环体存在率(％)时外水相pH值的关系的图。
为以推定肿瘤体积的经时变化表示本发明实施例8中配制的CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为以体重变化表示本发明实施例8中配制的CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为表示实施例8中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中总CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例8中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中游离CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例8中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38浓度变化的图。
为表示实施例8中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38G浓度变化的图。
为表示实施例8中配制的CPT-11制剂的血液毒性(淋巴细胞)的图。
为表示实施例8中配制的CPT-11制剂的血液毒性(嗜中性粒细胞)的图。
为以推定肿瘤体积的经时变化表示实施例9中配制的CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为以体重变化表示实施例9中配制的CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为表示实施例9中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中总CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例9中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中游离CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例9中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38浓度变化的图。
为表示实施例9中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38G浓度变化的图。
为以推定肿瘤体积的经时变化表示实施例10中CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为以体重变化表示实施例10中CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为表示在实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38浓度变化的图。
为表示实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中血浆中SN-38G浓度变化的图。
为表示实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中肿瘤中CPT-11浓度变化的图。
为表示实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中肿瘤中SN-38浓度变化的图。
为表示实施例10中CPT-11制剂在药物动态试验中肿瘤中SN-38G浓度变化的图。
为以推定肿瘤体积的经时变化表示实施例12中CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
为以体重变化表示实施例12中CPT-11制剂的抗肿瘤效果的图。
具体实施例方式
下面，更加详细地说明本发明。
伊立替康(irinotecan)是具有喜树碱骨架的化合物，其中喜树碱化学名为(+)-(4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶基-哌啶基)羰氧基]-1H-吡喃并[3’，4’6，7]中氮茚并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮。伊立替康及/或其盐是一种抗恶性肿瘤剂，是作为如下所述盐酸盐(irinotecan·HCl(hydrochloride))使用的水溶性物质。本说明书中“伊立替康及/或其盐”有时简称为“伊立替康”或“药物”。另外，伊立替康盐酸盐有时称为“盐酸伊立替康”或“CPT-11”。
本发明提供一种在脂质膜形成的封闭囊泡中以0.07mol/mol(药物mol/膜总脂质mol)以上的高载带量包封上述伊立替康及/或其盐形成的伊立替康制剂。
封闭囊泡只要具有能够包封药物的结构即可，无特殊的限定，可以为多种形态，能够使用具有能够以高浓度将药物包埋于其内部的潜在机能的脂质体、脂质微球及纳米颗粒等。其中特别优选例为脂质体。
下面，主要是以本发明伊立替康制剂的载体为特别优选的脂质体的情况为例，进行说明。
脂质体由磷脂双层膜构成，是一种封闭囊泡，该囊泡具有通过基于脂质的疏水性基团和亲水性基团的极性生成的膜形成与外界隔开的空间的结构，此囊泡的空间内含有水相(内水相)。脂质体制剂是以此脂质体为载体使其载带药物的制剂。
所谓“磷脂”是生物体膜的主要构成成分，分子内具有由长链烷基构成的疏水性基团和由磷酸基团构成的亲水性基团的两亲性物质。作为磷脂，可以举出磷脂酰胆碱(＝卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂等鞘氨醇磷脂、或心磷脂等天然或合成的磷脂或其衍生物、及上述物质通过常用方法氢化的物质等。下面在表示含有上述物质的意思中，有时也称“磷脂”为磷脂类。
其中，优选氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)等氢化磷脂、神经鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)等。
作为主要膜材，可以只含有一种磷脂，也可以含有多种磷脂。
脂质体，为使被包埋的药物在保存时或在血液等生物体中不易漏出，作为主要膜材优选使用相转移点比生物体内温度(35～37℃)高的磷脂。另外，制备上述脂质体时有时会被暴露于比生物体温度高的温度下。即，有时在50℃～70℃左右，例如在60℃左右的温度条件下制备，由于热对脂质体形成的影响较大，因此，特别优选使用具有比上述温度高的相转移点的主要膜材。具体而言，优选主要膜材的相转移点在50℃以上的磷脂。
脂质体含有上述主要膜材的同时还可以含有其他的膜成分。例如，含有磷脂以外的脂质或其衍生物(下面有时也称为其他脂质类)，优选与上述磷脂一起形成混合脂质膜。
所谓“磷脂以外的脂质”是指分子内具有由长链烷基等构成的疏水性基团、且分子内不含磷酸基团的脂质，没有特殊的限定，可以举出甘油糖脂质、神经鞘糖脂质及作为稳定剂的下述的胆固醇等固醇类等及上述物质的氢化物等衍生物。所谓胆固醇衍生物是指具有甾环的固醇类，作为具体例没有特殊的限定，可以举出胆固醇。
混合脂质可以含有其他脂质类中的一种，也可以含有多种。
伊立替康制剂在血浆中的释放率可由胆固醇的量调节，欲压低释放率时优选含有0～20mol％的量，相反欲提高释放率时可含有30～50mol％、优选40～50mol％的量。
本发明中的脂质体，在含有上述膜构成脂质的同时，还可以在不影响本发明目的的范围内含有能够保持上述膜结构、可以包含在脂质体中的其他膜成分。作为其他的膜成分，可以举出用于使脂质物性变化赋予载体膜成分所期望的特性的表面修饰剂。作为表面修饰剂无特殊的限定，能够举出带电物质、亲水性高分子衍生物、水溶性多糖类衍生物等。
带电物质，没有特殊的限定，可以举出具有氨基、脒基、胍基等碱性官能团的化合物，具有酸性官能团的化合物等。
作为碱性化合物，可以举出特开昭61-161246号公开的DOTMA、特表平5-508626号公开的DOTAP、特开平2-292246号公开的阳离子脂质体(Transfectam)、特开平4-108391号公开的TMAG、国际公开第97/42166号公开的3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐、DOSPA、TfxTM-50、DDAB、DC-CHOL、DMRIE等。
作为具有酸性官能团的化合物，可以举出油酸、硬脂酸等脂肪酸、神经节苷脂GM1、神经节苷脂GM3等具有唾液酸的神经节苷脂类、N-酰基-L-谷氨酸等酸性氨基酸类表面活性剂等。
上述带电物质为具有碱性官能团的化合物与脂质结合的物质时，称为阳离子化脂质。阳离子化脂质的脂质部份被稳定于脂质体的脂质双层膜中，碱性官能团部分能够存在于载体的脂质双层膜的膜表面上(外膜表面上及/或内膜表面上)。通过用阳离子化脂质修饰膜，能够提高脂质体膜与细胞的粘着性等。
作为水溶性多糖类，无特殊的限定，可以举出例如葡糖醛酸、唾液酸、葡聚糖、茁霉多糖(pullulan)、直链淀粉、支链淀粉、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖、环糊精、果胶、角叉菜聚糖等水溶性多糖类等。水溶性多糖类的衍生物可以举出糖脂质等。
作为亲水性高分子，无特殊的限制，可以举出聚乙二醇、聚蔗糖(Ficoll)、聚乙烯醇、苯乙烯-顺丁烯二酸酐交替共聚物、二乙烯醚-顺丁烯二酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚乙烯基甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸羟乙酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚天冬酰胺、合成聚氨基酸等。
亲水性高分子优选具有用于修饰脂质体的结构。特别优选亲水性高分子链的一端具有该结构。即，用于修饰的亲水性高分子优选由亲水性高分子的本体部分与用于修饰脂质体的结构部分构成。该结构为脂质等疏水性部分时，该疏水性部分为插入脂质体膜的形态，亲水性高分子的本体部分被固定使其从脂质体外表面突出；该结构为可与脂质体膜构成成分共价结合的反应性官能团时，通过与暴露在脂质体外表面的磷脂等脂质体膜构成成分共价结合，亲水性高分子的本体部分会被固定，使其从脂质体外表面上突出。
其次，对为了与亲水性高分子本体结合形成亲水性高分子-疏水性高分子化合物而使用的疏水性化合物进行如下说明。
该疏水性化合物无特殊的限定。例如，可以举出具有疏水性区域的化合物(疏水性化合物)。作为疏水性化合物，例如可以举出后述的构成混合脂质的磷脂、或固醇等其他脂质类、或长链脂肪族醇、甘油脂肪酸酯等。其中，磷脂为优选方案之一。另外，上述疏水性化合物可以具有反应性官能团。通过反应性官能团形成的键优选为共价键，具体而言可以举出酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键等，没有特殊的限定。
上述磷脂中所含的酰基链优选为饱和脂肪酸。酰基链的链长优选C14-C20，进一步优选C16-C18。作为酰基链，例如可以举出二软酯酰基、二硬酯酰基、软酯酰基硬酯酰基。
磷脂没有特殊的限定。作为磷脂，例如可以使用具有能够与上述亲水性高分子反应的官能团的磷脂。作为具有能够与上述亲水性高分子反应的官能团的磷脂的具体例，可以举出具有氨基的磷脂酰乙醇胺、具有羟基的磷脂酰甘油、具有羧基的磷脂酰丝氨酸。优选方案之一为使用上述的磷脂酰乙醇胺。
亲水性高分子的脂质衍生物，由上述亲水性高分子和上述脂质构成。上述亲水性高分子与上述脂质的组合无特殊的限定。可以根据目的适当组合加以使用。例如可以举出选自磷脂、固醇等其他脂质类、长链脂肪族醇、甘油脂肪酸酯中的至少一种与选自PEG、PG、PPG中的至少一种结合而成的亲水性高分子的衍生物。具体而言，可以举出聚氧化丙烯烷基等，特别是在亲水性高分子为聚乙二醇(PEG)时，优选方案之一为选择磷脂、胆固醇作为脂质。上述组合形成的PEG脂质衍生物，例如可以举出PEG的磷脂衍生物或PEG的胆固醇衍生物。
亲水性高分子的脂质衍生物，通过选择脂质，可以选择带正电、带负电、中性。例如，选择DSPE作为脂质时，因磷酸基团的影响成为带负电的脂质衍生物，另外选择胆固醇作为脂质时，成为中性的脂质衍生物。可以根据目的适当地选择脂质。
PEG的分子量无特殊的限制。PEG的分子量通常为500～10000道尔顿，优选1000～7000道尔顿，更优选2000～5000道尔顿。
PG的分子量无特殊的限定。PG的分子量通常为100～10000道尔顿，优选200～7000道尔顿，更优选400～5000道尔顿。
PPG的分子量无特殊的限定。PPG的分子量通常为100～10000道尔顿，优选为200～7000道尔顿，更优选1000～5000道尔顿。
其中，作为优选方案之一可以举出PEG的磷脂衍生物。作为PEG的磷脂衍生物，例如可以举出聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)。PEG-DSPE为通用的化合物且容易购买，故优选。
上述亲水性高分子可以分别单独使用，或两种以上组合使用。
上述的亲水性高分子的脂质衍生物，能够通过现有公知的方法制备。作为合成亲水性高分子的脂质衍生物之一例的PEG的磷脂衍生物的方法，例如可以举出，使用催化剂使具有能够与PEG反应的官能团的磷脂与PEG反应的方法。作为该催化剂，例如可以举出，氰尿酰氯、碳化二亚氨、酸酐、戊二醛。通过上述反应，上述官能团与PEG共价结合，能够得到PEG的磷脂衍生物。
使用上述亲水性高分子的脂质衍生物进行表面修饰的脂质体，可以防止血浆中调理素蛋白等吸附在该脂质体的表面上，提高该脂质体在血中的稳定性，避免被RES捕捉，能够提高药物向目标组织或细胞转运的转运率。
上述亲水性高分子脂质衍生物所产生的膜脂质(总脂质)修饰率，相对于膜脂质的比率通常为0.1～20mol％，优选0.1～5mol％，更优选0.5～5mol％。
需要说明的是，在本发明中，“总脂质”是指从构成膜的脂质中除去亲水性高分子脂质衍生物的总脂质，具体而言，包括磷脂类及其它脂质类(包括胆固醇)，此外在含有亲水性高分子脂质衍生物以外的表面修饰剂时，还包括此表面修饰剂，但不包括亲水性高分子脂质衍生物中含有的磷脂酰乙醇胺(PE)等磷脂、胆固醇等。
在本发明中通过上述利用亲水性高分子脂质衍生物(PEG-PE)进行的脂质体膜修饰，可以使亲水性高分子(PEG)分布在脂质双层膜的内/外两侧，也可以选择性地分布在外膜侧。具体而言，在配制下述的脂质体制剂时，可以预先均匀地混合脂质体形成脂质和PEG-PE，使其形成脂质体(先导入)，也可以使用通过混合不含PEG-PE的脂质体形成脂质得到的混合脂质，按照通常的方法形成脂质体后再导入PEG-PE(后导入)，但特别优选在形成脂质双层膜未修饰的脂质体后，用亲水性高分子从外部修饰膜表面(后导入)，选择性地只表面修饰脂质双层膜的外膜的脂质体。此时，使用亲水性高分子脂质衍生物作为用于导入亲水性高分子的修饰剂时，亲水性高分子部分处于向外突出的状态，疏水性部分的脂质部分进入脂质体的脂质双层膜中被稳定地保持，因此能够使与脂质结合的亲水性高分子存在并分布于脂质体的脂质双层膜的外膜表面上。
脂质体形成步骤后的脂质体，受到温度、时间的影响引起凝聚等不稳定化。此不稳定化根据脂质体的脂质组成的不同而有所差异，因此可知针对每一种脂质组成的温度和时间不同。为了避免因脂质组成不同而不同的不稳定化，优选在脂质体形成步骤后设置亲水性高分子修饰步骤。
亲水性高分子添加步骤中亲水性高分子的添加时间于脂质体形成步骤后越快越好。具体而言，在180分钟以内时热对膜成分或包封物的影响较小，因此作为优选，较优选在120分钟内，更优选在45分钟内，最优选在脂质体形成步骤刚刚结束后。更具体而言，可以将脂质体形成步骤后的脂质体分散液直接加入到亲水性高分子溶液中，另外，也可以采用相反地将亲水性高分子溶液加入到脂质体形成步骤后的脂质体分散液中的方法。另外，还可以采用将脂质体分散液和亲水性高分子溶液同时转移至其它容器中混合的方法。此时，从浓度均一性及温度均一化的观点考虑，优选进行使用搅拌器等进行搅拌的步骤。
亲水性高分子修饰步骤中添加亲水性高分子后，优选在相转移温度以上的温度下加热搅拌规定时间。加热搅拌的时间为0～120分钟，优选0～60分钟，更优选0～45分钟。
另外，与上述不同，也可以按照通常方法制备含有具有反应活性官能团的磷脂等膜构成脂质的脂质体，之后在脂质体外液中添加单侧末端活化的PEG，通过使其与带有官能团的磷脂等膜构成脂质结合，能够制备脂质体。
另外，除上述方法以外，脂质体还可以通过混合上述各构成成分，由高压排出型乳化机使其高压排出，进行制备。此方法被具体记载于“LifeScience中的脂质体”(寺田、吉村等；Springer.Verlag Tokyo(1992))中，本说明书引用此记载并作为本说明书的一部分。
在上述中，为使脂质体为所希望的大小，可以采用几种技术(G.Gregoriadis编“Liposome Technology Liposome Preparation andRelated Techniques”2nd edition，Vol.I-III、CRC Press)。本说明书引用此记载并作为本说明书的一部分。
脂质体的脂质双层膜结构已知有单层囊泡(Small UnilamellarVesicle，SUV，Large Unilamellar Vesicle，LUV)及复数层构成的多层囊泡(Multilamellar Vesicle，MLV)等膜结构。
本发明的脂质体可以为任一膜结构，但优选单层囊泡的脂质体，具体而言优选LUV脂质体。
脂质体分散液，可以通过使用挤压机使其数次强制通过过滤器，进行单层化。通常使用具有比所要粒径大的孔径的过滤器，需使用二种以上与最后获得希望粒径的过滤器的孔径不同的过滤器。使用上述挤压机，通过不同孔径的过滤器次数越多，单层化率越高，实质上可以将其作为单层囊泡的脂质体。所谓实质上单层囊泡的脂质体，具体而言是指在构成脂质体制剂的全部载体(囊泡)中，单层囊泡所占比率，以分布比率计可为整体的50％以上，优选为80％以上。
在上述的脂质体中，其外膜表面的亲水性高分子链朝向脂质体外侧分布，另一方面，由于脂质双层膜的内水相侧内膜未被表面修饰，所以内水相内实质上没有分布亲水性高分子链。为上述分布结构时，与在双层膜的内外膜两侧上分布亲水性高分子的结构相比，即使内水相的pH值低，也能确保膜的稳定性。另外，与在双层膜的内外膜两侧上分布亲水性高分子的结构相比，可以利用整体量较少的亲水性高分子获得血中稳定性的效果。
此外，本发明中，所谓“血中滞留性”是指在给予载体的宿主中，处于包封于载体的状态下的药物在血液中残留的性质。药物从载体释放后，从血中快速地消失，对药物暴露部位发生作用。血中滞留性较好时，可以只给予少量的药物。
本发明的载体可采用球状或与其相近的形态，其粒径(粒子外径的直径)无特殊的限定，可为0.02～250μm，优选0.03～0.4μm，更优选0.05～0.2μm。粒子外径的直径是指通过动态光散射法测定的脂质体制剂全部粒子直径的平均值，具体而言，可以使用粒径分析仪(Zetasizer)(Malvern Instruments 3000HS或S ZEM 5002)进行测定。
本发明的伊立替康制剂，根据给药途径还可以含有医药上允许的稳定剂及/或抗氧化剂。作为稳定剂无特殊的限制，可以举出甘油或蔗糖等糖类。抗氧化剂无特殊的限制，可以举出抗坏血酸、尿酸或生育酚同系物如维生素E等。生育酚有α、β、γ、δ4种异构物，本发明中均可使用。
根据给药途径，也可以含有医药上允许的添加物。作为上述添加物的例子，可以举出水、生理盐水、医药上允许的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物(carboxyvinylpolymer)、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、PBS、活体内分解性聚合物、无血清培养基、作为医药添加物允许的表面活性剂或生物体内允许的生理pH缓冲液等。所用的添加物可根据剂型从上述中适当地选择或组合，但并不限定于此。
本发明中，提供含有上述添加物的伊立替康作为药物组合物。本发明的药物组合物，可按照通常方法例如可在0～8℃下冷藏或1～30℃的室温下保存。
本发明中的脂质体处于包封CPT-11的状态。已知CPT-11在比中性条件高的pH值区域中会发生α-羟基内酯环水解。因此，本发明的脂质体无论是CPT-11进入脂质双层膜中，还是CPT-11进入内水相中，为了抑制α-羟基内酯环水解，必须保持脂质体的内水相为酸性。
已知脂质通常会因温度、pH引起水解。特别是Sn-1与Sn-2位的脂肪酸的羧酸酯极易受到水解，分解为溶血脂质及脂肪酸(Grit等，Chem.PhyS.Lipids，64，3-18，1993)，上述分解物通过扰乱原来脂质膜的组成提高脂质膜的通透性，可损害脂质体的稳定性。因此，保持内水相为酸性时，从脂质的稳定性观点考虑，优选外水相的pH为中性左右。
在药物导入步骤中，上述相反的两个条件被最严格地限制。药物导入步骤必须加热至脂质膜的相转移温度以上，显著地促进脂质的水解。为抑制脂质水解，虽优选将外水相pH设定为约中性，但外水相pH设定为约中性时，会促进CPT-11的α-羟基内酯环水解。鉴于上述相反的两个条件，在药物导入步骤中外水相的pH值可为4.0～8.0，较优选为4.0～7.0，更优选为5.0～7.0。
本发明的高载带量伊立替康制剂，可以通过形成载体脂质体后利用其膜内外离子梯度导入药物的被称为远程装填(Remote loading)的方法获得。远程装填法，可用于在溶解于适当的水性介质时在带电状态下存在的常用药物。由于在脂质体的内侧/外侧形成离子梯度，药物在形成的梯度的作用下透过脂质体膜，能够包埋药物。
作为跨脂质体膜形成的离子梯度有Na+/K+浓度梯度。美国专利5077056号中记载了向根据Na+/K+浓度梯度的远程装填法预先形成的脂质体中添加药物的技术，可参照其施行。此外，引用其记载作为本说明书的内容。
本发明中，作为离子梯度优选举出质子浓度梯度，可以举出具有脂质体膜内侧(内水相)pH值比外侧(外水相)pH值低的pH值梯度的方案。具体而言，pH值梯度可通过铵离子浓度梯度及/或具有可质子化的氨基的有机化合物的浓度梯度等形成。
作为通过铵离子浓度梯度，在脂质体内包埋药物(伊立替康及/或其盐)的方法的具体例，可为首先在含有0.1～0.3M铵盐的水性缓冲液中预先形成脂质体，通过用不含铵离子的介质，例如蔗糖溶液交换外部介质，在脂质体膜的内/外形成铵离子梯度。通过氨及质子平衡内部铵离子，氨透过脂质膜扩散，从脂质体内部消失。随着氨的消失，脂质体内的平衡连续地向质子生成的方向移动。结果，脂质体内蓄积质子，在脂质体的内侧/外侧形成pH梯度。通过向具有此pH梯度的脂质体分散液中添加药物，可将药物包封于脂质体中。
对于能够形成上述铵离子浓度梯度的铵盐，无特殊的限制，可以举出硫酸铵、氢氧化铵、乙酸铵、氯化铵、磷酸铵、柠檬酸铵、琥珀酸铵、乳糖酸铵、碳酸铵、酒石酸铵及草酸铵等。
此外，将药物导入通过铵离子浓度梯度的远程装填法预先形成的脂质体中的技术被记载于美国专利5192549号中，可参照其进行，并且引用此记载作为本说明书的一部分。
具有可质子化的氨基的有机化合物，优选低分子量的化合物，具体言可以举出甲基胺、乙基胺、丙基胺、二乙基胺、乙二胺等，但并不限定于此。
本发明中，优选通过使用铵离于浓度梯度的远程装填法，包封伊立替康或其盐。
本发明的伊立替康制剂是以0.07mol/mol(药物mol/膜总脂质mol)，优选以0.1mol/mol的高浓度将伊立替康或其盐包封于上述的载体中。
本发明中，所谓的“包封”是指药物被包埋于载体内部的状态。还可以是在作为载体构成成分的脂质层内含有一部份或全部药物的状态。本发明的载体可以通过凝胶过滤、透析、膜分离及离心等常用方法进行精制，除去未包封到载体内的药物。
经过用于除去未被包封的药物的阶段后供给载体。所以载体内部与载体外部通过脂质双层膜产生药物的浓度梯度。本发明的载体优选配制后在脂质双层膜外部没有未包封的药物。然后从内部向外部环境释放被载体包封的药物。本发明的载体在包封药物的状态下到达目标部位，结果可将被包封的药物转运至目标部位。药物向目标部位的转运，可以是使目标部位摄取载体载带的药物，也可以不被目标部位摄取，而使药物影响目标部位或其附近区域。
另外，本发明中所谓的“释放”是指载体中包封的药物通过穿过构成载体的脂质膜，或通过改变脂质膜的部分结构而运出到封闭囊泡外部。在血浆中盐酸伊立替康被代谢为活性代谢物SN-38，长时间高浓度地暴露于目标部位，显示极强的抗肿瘤活性，因此控制释放极其重要。伊立替康制剂在血浆中的释放率可用胆固醇的量进行调节，调节胆固醇的量可期待得到较好效果。所谓“释放率”是指从载带载体构成成分与盐酸伊立替康的载体向封闭囊泡外部运出的药物，与被载体载带的药物的比率(重量比或摩尔比)。“释放率低”是指每单位时间向封闭囊泡外部运出的药量少。
本发明中所谓“目标部位”是包封于载体的药物被释放发挥作用的特定部位，是指每一部位的特定的细胞、组织、器官或脏器及其内部。细胞、组织、器官或脏器及其内部等目标部位是可以是成为药物治疗对象的部位，通过暴露释放的药物，发挥其效果。作为目标部位无特殊的限定，可以举出肿瘤。
作为治疗对象的肿瘤，无特殊的限定，可为固体肿瘤，具体而言可以举出食道癌、胃癌、结肠癌、大肠癌、直肠癌、胰脏癌、肝脏癌、喉癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳癌、子宫癌或卵巢癌。目标部位为肿癌的细胞、组织、器官或脏器及其内部等。所以，在本发明中，所谓疾病是指上述肿瘤，期待药物对其具有抗肿瘤效果。
本发明中所谓“暴露”是指释放至载体外部的药物对外部环境发挥作用。具体而言，释放的药物接近目标部位，通过接触，发挥其作用，即抗肿瘤效果。通过药物作用于目标部位，局部作用于目标部位的处于进行DNA合成细胞周期的细胞，显示被期待的效果。为显示上述效果，药物从载体的释放率与载体在血中的滞留性必须保持均衡。
本发明的载体以所希望的释放速度释放伊立替康及/或其盐，被释放的伊立替康及/或其盐被代谢成为活性代谢物SN-38。为了使SN-38长时间暴露于所希望的目标部位而使用本发明。因此，本发明中，为预防及/或治疗宿主的疾病，通过给与宿主包封有效量的伊立替康及/或其盐的载体，为了在宿主内释放有效量的伊立替康及/或其盐，或使有效量的SN-38长时间高浓度暴露于目标部位，可以对宿主(患者)非口服性地全身或局部给药。作为给于对象的宿主，可以举出哺乳动物，优选为人、猴、鼠、家畜等。
非口服投药途径可选择例如点滴等静脉内注射(静脉注射)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射，可根据患者的年龄、症状适当地选择给药方法。为了治愈或至少部份地抑制已被疾病困扰的病人的疾病症状，能够给于充分量的本发明的载体。例如，包埋于载体中的药物的有效给药量，可以在每天每1kg体重为0.01mg至100mg的范围内选择。但本发明的载体并不限定于上述给药量。给药时间可在病症发生后给药，或预测疾病发作时为缓和发病时的症状而预防性地给药。需要说明的是，给药时间可根据患者的年龄、症状适当地选择。
作为具体的给药方法，能够通过注射器或点滴给与药物组合物。另外，将导管插入患者或宿主的体内，例如管腔内、血管内，将其前端导入至目标部位附近，通过该导管，从所希望的目标部位或其邻近部位或可期待向目标部位供给血流的部位进行给药。
如实施例所示，测定本发明的载体包封的药物的释放率时，已确认为低释放率。释放率可通过使本发明的载体离心沉淀，测定上清液中存在的药物量与载体进行计算。
实施例下面举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不仅限于此实施例、试验例。
如下求得各例中配制的药物包埋脂质体的各浓度及粒径。
磷脂浓度(mg/mL)使用磷脂定量试剂盒(磷脂C试和光，和光纯药工业公司)定量的脂质体分散液中的磷脂(HSPC)浓度。
总脂质浓度(mol/L)根据上述磷脂浓度计算的膜构成成分的混合脂质的总摩尔浓度(mM)。此总脂质中含有作为混合脂质被配制的表面修饰剂中的脂质成分，但不含有用于导入PEG的PEG衍生物中的脂质(实施例中PEG-PE中的PE(磷脂酰乙醇胺)或Chol-PEG中的Chol(胆固醇)。
药物浓度(mg/mL)将上述所得制剂用生理盐水稀释40倍后，取50μl，加入2ml甲醇，所得溶液用分光荧光光度计进行测定，求出在激发波长360nm、荧光波长435nm下的荧光强度。用药物量(mg)/制剂全量(ml)表示被包封的盐酸伊立替康浓度。
药物载带量(药物/总脂质的摩尔比)根据上述药物浓度相对于上述总脂质浓度的比，以药物/总脂质的摩尔比表示载体中包封的盐酸伊立替康的浓度。
粒径(nm)将20μl脂质体分散液用生理盐水稀释至3ml，采用Zetasizer 3000HS(Malvern Instruments)测定的平均粒径‘所用各成分的简称及分子量如下所示。
HSPC氢化大豆磷脂酰胆碱(分子量790、Lipoid社制SPC3)Chol胆固醇(分子量386.65、Solvay社)PEG5000-PE聚乙二醇(分子量5000)-磷脂酰乙醇胺(分子量5938、Genzyme社)PEG2000-PE聚乙二醇(分子量2000)-磷脂酰乙醇胺(分子量2725、日本油脂社)PEG1600-Chol聚乙二醇(分子量1600)-胆固醇(分子量1982、日本油脂社)CPT-11盐酸伊立替康(分子量677.19)R-DHPE若丹明双十六烷酰基磷脂酰乙醇胺(分子量1333.81、Molecular Probes社)TRX-203，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐(分子量609.41、常兴药品)[实施例1]为确认能够实现盐酸伊立替康高载带脂质体制剂的方法，通过远程装填法(配制例1)或被动装填法(比较配制例1)，尝试导入高浓度药物。除导入方法不同以外，各盐酸伊立替康载带脂质体制剂(以下称CPT-11制剂)均以PEG-PE(后导入)脂质作为载体。
(配制例1)<远程装填法>
(1)混合脂质的配制在25ml于60℃下加热的叔丁醇(关东化学公司)中溶解0.422g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)及0.176g胆固醇(Chol)后，冰浴冷却，冻结干燥，配制HSPC∶Chol＝54∶46(摩尔比)的混合脂质。
(2)脂质体的制作在0.598g上述配制的混合脂质中，加入10ml的250mM硫酸铵溶液，使其充分膨润，用旋涡混合器搅拌，68℃下依序通过装备在挤压机(The Extruder T.10，Lipex biomembranes Inc.)中的过滤器(孔径0.2μm×5次，0.1μm×10次，Whatman社)，配制脂质体分散液。
(3)PEG-PE的导入在上述脂质体分散液中加入1.21mL聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(PEG5000-PE)的蒸馏水溶液(36.74mg/mL)(相当于混合脂质的总脂质量的0.75mol％)，通过60℃下加热30分钟，导入PEG5000-PE。
利用以10mM组氨酸(histidine)/10％蔗糖(Sucrose)溶液(pH6.0)进行溶剂置换的凝胶柱进行外水相取代。
使用磷脂定量试剂盒，定量HSPC浓度。根据HSPC浓度求出总脂质量mM。
(4)药物的包埋配制浓度为10mg/ml的盐酸伊立替康(CPT-11)/RO水(逆渗透膜净水)溶液。
以相对于上述HSPC浓度(mg/ml)使CPT-11/HSPC＝0.2(w/w)的量，将此盐酸伊立替康溶液加入到脂质体分散液中，于60℃下搅拌60分钟，导入盐酸伊立替康。导入后的样品冰浴冷却。利用以10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH 6.5)置换的凝胶柱，从包埋盐酸伊立替康后的脂质体分散液除去未包埋的药物。
上述所得CPT-11制剂的组成及粒径如表1所示。
得到本发明的高载带CPT-11制剂。
(比较配制例1)<被动装填法>
在0.2992g按照与配制例1相同的方法配制的混合脂质(HSPC∶Chol＝54∶46(摩尔比))中，加入5ml盐酸伊立替康溶液(10mg/ml浓度的CPT-11/10％蔗糖溶液)，使其充分地膨润。在旋涡混合器中搅拌，与配制例1相同地在68℃下依序通过装在挤压机上的过滤器(0.2μm×5次，0.1μm×10次)，配制包埋盐酸伊立替康的脂质体。
与调剂例1的(3)相同，在此脂质体中加入0.61ml相当于混合脂质的总脂质量0.75mol％的PEG5000-PE，通过在60℃下加热30分钟，导入PEG5000-PE，然后，利用以10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH6.5)置换的凝胶柱除去未包埋的药物。
将上述所得CPT-11制剂的组成及粒径如表1所示。
使用与调剂例1相同的药物量导入药物，但采用被动装填法时无法获得高载带的CPT-11制剂。
测定在远程装填法中为得到本发明的高载带CPT-11制剂所需的填充量。
(配制例2)在配制例1的(4)药物的包埋中，在与(1)～(3)相同地配制的PEG-PE后导入脂质体分散液中加入的10mg/ml CPT-11/RO水溶液的量变为按CPT-11/HSPC(w/w)比为0.1、0.2、0.4、0.8的量，除此以外，与配制例1相同地获得CPT-11制剂。所得CPT-11制剂的组成及粒径如表1所示。
如表1所示，在远程装填法中，通过提高药物填装量(药物/HSPC的比)，可实现获得临床效果上充分的浓度的高载带CPT-11制剂。
表1
(试验例1)37℃下的制剂加速稳定性实施例1中配制的各CPT-11制剂在37℃下加热规定时间。加热结束后在CPT-11制剂中加入生理盐水稀释20倍，之后超离心(1×105g，2小时，10℃)，使CPT-11制剂(包埋盐酸伊立替康的脂质体)沉淀。通过测定上清液中存在的盐酸伊立替康量的荧光强度，计算CPT-11制剂的盐酸伊立替康的释放率(％)。结果如图1所示。
比较配制例1配制的CPT-11制剂，在37℃下加热7天时显示约60％的盐酸伊立替康释放率，与之相比，配制例1通过远程装填法配制的CPT-11制剂即使在37℃下加热7天后也几乎不释放盐酸伊立替康。由此可知，通过远程装填法在脂质体包埋盐酸伊立替康时，可配制高载带且制剂稳定性优异的CPT-11制剂。
(试验例2)37℃下的制剂稳定性实施例2配制的各CPT-11制剂在37℃加热规定时间。与试验例1相同地，针对加热后的CPT-11制剂测定盐酸伊立替康的释放率。各CPT-11制剂即使在37℃加热14天后，释放率仍为1％以下。
由此可知，通过远程装填法配制的CPT-11制剂的释放率不会受到药物载带量(药物/总脂质比)较大的影响，既使为载带量极其高的CPT-11制剂也具有优异的制剂稳定性。
将与配制例1的膜构成不同的脂质体作为载体，配制CPT-11制剂。即，使用膜成分为由以下所示混合脂质构成的PEG-PE后导入脂质体(配制例3)或PEG-PE先导入脂质体(参考配制例1)，通过与配制例1相同的远程装填法进行盐酸伊立替康的包埋操作。
(配制例3)(1)混合脂质的配制在50mL加热为60℃的叔丁醇中溶解1.5317g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、0.6419g胆固醇(Chol)及0.005g若丹明双十六烷酰基磷脂酰乙醇胺(R-DHPE)后，冰浴冷却、冻结干燥，配制使HSPC∶Chol∶R-DHPE＝54∶46∶0.1(摩尔比)的混合脂质。
(2)脂质体的制作除使用0.37g上述配制的混合脂质以外，与配制例1相同，加入10ml的250mM硫酸铵溶液，用旋涡混合器搅拌，使其通过安装在挤压机上的过滤器(0.2μm×5次，0.1μm×10次)，得到脂质体分散液。
然后，用10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH 6.0)进行外水相置换。
(3)PEG-PE的导入在上述脂质体分散液中，加入相当于总脂质量的2.8mol％的聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(PEG2000-PE)的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，通过在60℃下加热30分钟，导入PEG2000-PE。
(4)与配制例1的药物包埋相同，在脂质体分散液中加入使CPT-11/HSPC＝0.2(w/w)所需量的10mg/ml CPT-11/RO水溶液，导入盐酸伊立替康后，冰浴冷却，然后，用10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH 6.5)除去未封入的药物。所得的CPT-11制剂如表2所示。
(参考配制例1)除预先在(2)中膜材料的混合脂质中添加在配制例3的(3)中添加的PEG2000-PE，制作PEG-PE分布于内外膜两侧的脂质体之外，与配制例3相同地配制CPT-11制剂。如下所示。
在0.37g与配制例3的(1)相同地配制的混合脂质(HSPC∶Chol∶R-DHPE＝54∶46∶0.1(摩尔比))及0.094g相当于配制例3的倍量(5.6mol％)的PEG2000-PE中，加入1ml乙醇，于65℃搅拌30分钟，使其完全溶解。
在通过搅拌确认完全溶解后的乙醇溶液中，加入10ml配制成250mM的硫酸铵溶液，然后进行与配制例3的(2)相同的旋涡混合器及挤压机操作，使用10％蔗糖溶液进行所得的脂质体分散液的外水相置换。
与配制例3的(4)相同地，在脂质体分散液中加入使CPT-11/HSPC量＝0.2(w/w)所需量的10mg/ml的CPT-11/RO水溶液，导入盐酸伊立替康。导入后与配制例3的(4)相同，进行冰浴冷却，除去未封入的药物。所得CPT-11制剂如表2所示。
(试验例3)37℃下制剂加速稳定性将实施例3中配制的各CPT-11制剂在37℃下加热1个月，进行加速试验。每1周采取一部份加热的CPT-11制剂，加入生理盐水稀释至20倍后，进行超离心(1×105g、2小时、10℃)，使CPT-11制剂沉淀。通过定量上清液中存在的盐酸伊立替康量的荧光强度，计算从脂质体的释出率(％)。结果如图2所示。另外每隔1周测定加热后的脂质体分散液的粒径，结果如图3所示。
从上述图2及图3可知，配制例3配制的脂质体在37℃经1个月后仍未释放药物(图2)，粒径大致固定(图3)，是制剂稳定性优异的脂质体。此外，参考配制例1中配制的PEG-PE先导入脂质体，在37℃下于第3周开始释放，于第4周达到极高的释放率(图2)。需要说明的是，由于粒径在第3周以后增大(图3)，因此暗示第3周以后膜发生破坏。
由上述结果可知，本发明的高载带CPT-11制剂中，形成脂质体后添加PEG-PE的PEG-PE后导入脂质体为优选的方案。
为进行本发明的高载带CPT-11制剂的长期保存稳定性及血中稳定性试验，通过以下配制例4～5配制CPT-11制剂。
(配制例4)在配制例1的(3)中，除采用以10mM MES/10％蔗糖溶液(pH 6.0)置换的凝胶柱进行PEG-PE后导入脂质体分散液的外水相置换以外，与配制例1相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂。组成如表3所示。
(配制例5)除将下述(1)配制的混合脂质作为膜成分以外，与配制例4相同地配制含有带电物质的3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐的高载带CPT-11制剂。如下所示。
(1)混合脂质的配制在25ml加热至60℃的叔丁醇中溶解0.4561g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、0.1876g胆固醇(Chol)及0.0563g 3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐(TRX-20)，然后通过冰浴冷却、冻结干燥，配制使HSPC∶Chol∶TRX-20＝50∶42∶8(摩尔比)的混合脂质。
使用0.700g上述配制的混合脂质，与配制例1的(2)相同地配制脂质体分散液。
在上述脂质体分散液中加入1.42ml相当于混合脂质总脂质量的0.75mol％的PEG5000-PE的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，导入PEG5000-PE后，用10mM MES/10％蔗糖溶液(pH 6.0)进行脂质体分散液的外水相置换，除此之外，与配制例1的(3)相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂。组成如表3所示。
(试验例4)4℃下的长期保存稳定性试验上述所得的各CPT-11制剂于4℃保存规定时间。测定经规定时间后的CPT-11制剂的粒径，及与试验例1相同地测定CPT-11制剂的盐酸伊立替康的释出率(％)。结果如表3所示。
表3
上述实施例4配制的各CPT-11制剂在4℃下保存6个月后，粒径及释放率均未见变化。由此可知，通过远程装填法配制的CPT-11制剂长期间保存稳定性优异。
(试验例5)血中滞留性给小鼠(BALB/c，雌性，5周龄，日本Clea)尾静脉注射实施例4(配制例4及5)配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液(盐酸伊立替康为1mg/ml)，注射剂量以盐酸伊立替康的量计为10mg/kg(以伊立替康量计为8.77g/kg)。
注射后于1、6、24小时后采血，经离心(3000rpm，10分钟，4℃)收集血浆。通过测定荧光强度，测定各血浆中盐酸伊立替康浓度。血浆测定前保存于冷库中。结果如表4及图4所示。
当为实施例4的各CPT-11制剂时，在尾静脉注射后24小时为止均可检测到血浆中盐酸伊立替康的浓度，但为盐酸伊立替康生理盐水溶液时，仅在尾静脉注射后1小时可检测出。
由此可知，通过远程装填法配制的CPT-11制剂，可以长期高浓度地维持盐酸伊立替康在血浆中的浓度。
为对本发明的高载带CPT-11制剂的药效进行试验，按照下述配制例6～9，配制CPT-11制剂。
(配制例6)除将下述(1)配制的混合脂质作为膜成分以外，与配制例4相同地配制含有带电物质3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐的高载带CPT-11制剂。如下所示。
(1)混合脂质的配制在50mL加热至60℃的叔丁醇中溶解4.562g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1.876g胆固醇(Chol)及0.564g的3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐(TRX-20)后，通过冰浴冷却、冻结干燥，配制使HSPC∶Chol∶TRX-20＝50∶42∶8(摩尔比)的混合脂质。
除使用7.002g上述配制的混合脂质之外，与配制例1相同地配制脂质体分散液。
在上述脂质体分散液中，加入相当于总脂质量的0.75mol％的聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(PEG5000-PE)的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，于60℃加热30分钟导入PEG5000-PE后，与配制例1的(4)相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂。组成如表5所示。
(配制例7)除将下述(1)配制的混合脂质作为膜成分之外，与配制例4相同地配制含有带电物质3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐的高载带CPT-11制剂。如下所示。
(1)混合脂质的配制在50ml加热至60℃的叔丁醇中溶解4.562g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1.518g胆固醇(Chol)、1.126g的3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐(TRX-20)后，通过冰浴冷却、冻结干燥，配制HSPC∶Chol∶TRX-20＝50∶34∶16(摩尔比)的混合脂质。
除使用7.207g上述配制的混合脂质之外，与配制例1相同地配制脂质体分散液。
在上述脂质体分散液中加入相当于总脂质量的2.0mol％的聚乙二醇1600-胆固醇(PEG1600-Chol)的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，于60℃加热30分钟导入PEG1600-Chol后，用10mM MES/10％蔗糖(Sucrose)溶液(pH6.0)进行脂质体分散液的外水相置换，除此之外，与配制例1的(4)相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂。组成如表6所示。
(配制例8)除将下述(1)配制的混合脂质作为膜成分之外，与配制例4相同地配制含有带电物质3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐的高载带CPT-11制剂。如下所示。
(1)混合脂质的配制在50ml加热至60℃的叔丁醇中溶解4.562g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1.876g胆固醇(Chol)、0.564g3，5-双十五烷氧基苯甲脒盐酸盐(TRX-20)后，通过冰浴冷却、冻结干燥，配制HSPC∶Chol∶TRX-20＝50∶42∶8(摩尔比)的混合脂质。
除使用7.002g上述配制的混合脂质之外，与配制例1相同地配制脂质体分散液。
在上述脂质体分散液中，加入相当于总脂质量的0.75mol％的聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(PEG5000-PE)的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，于60℃加热30分钟导入PEG5000-PE后，与配制例1的(4)相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂。组成如表6所示。
(配制例9)除将下述(1)配制的混合脂质作为膜成分以外，与配制例4相同地配制高载带CPT-11制剂。如下所示。
(1)混合脂质的配制在50ml加热至60℃的叔丁醇中溶解4.940g氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、2.060g胆固醇(Chol)后，通过冰浴冷却、冻结干燥，配制HSPC∶Chol＝54∶46(摩尔比)的混合脂质。
除使用7.002g上述配制的混合脂质之外，与配制例1相同地配制脂质体分散液。
在上述脂质体分散液中，加入相当于总脂质量的0.75mol％的聚乙二醇5000-磷脂酰乙醇胺(PEG5000-PE)的蒸馏水溶液(36.74mg/ml)，于60℃加热30分钟导入PEG5000-PE后，与配制例1的(4)相同地通过远程装填法导入药物，配制高载带CPT-11制剂，组成如表7所示。
表7
研究了外水相pH对药物包封率的影响(配制例10)(1)混合脂质的配制称量7.01g HSPC及2.93g Chol，在其中加入10ml无水乙醇，于68℃加热溶解。确认已完全溶解后，加90mL硫酸铵溶液(250mM)，在68℃加热搅拌。
(2)脂质体的制作加热搅拌后，使用加热至68℃的挤压机，通过孔径为0.2μm的过滤器5次，改换为孔径为0.1μm的过滤器，通过5次。然后，再通过孔径为0.1μm的过滤器5次。导入PEG5000-DSPE为使挤压后的样品具有规定的PEG5000-DSPE含有率(mol％)，加入20.4ml的PEG5000-DSPE溶液(36.74mg/ml)，在60℃加热搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE。冰浴冷却导入后的样品。
(3)外水相置换分别取8ml冰浴冷却的样品，使用pH不同(pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的外水相溶液，具体而言为pH 4.0、5.0(10mM醋酸/10％蔗糖溶液)、pH6.0(10mM组氨酸/10％蔗糖溶液)、pH7.0、8.0、9.0(10mM Tris/10％蔗糖溶液)充分置换的凝胶柱，进行外水相置换。使用外水相置换后的脂质体分散液磷脂定量试剂盒，定量HSPC浓度。根据HSPC浓度求出总脂质量mM。
(4)药物的包埋配制浓度为10mg/ml的盐酸伊立替康(CPT-11)/RO水(逆渗透膜净水)溶液。以相对于上述总脂质量(mM)使CPT-11/总脂质量＝0.16(mol/mol)的量，将此盐酸伊立替康溶液加入脂质体分散液中，于60℃搅拌60分钟，导入盐酸伊立替康。冰浴冷却导入后的样品。通过10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH6.5)置换的凝胶柱除去盐酸伊立替康包埋后的脂质体分散液中的末封入药物。
上述所得的各CPT-11制剂的脂质(HSPC)浓度、药物(CPT-11制剂)浓度及粒径如表8所示。
(药物包封率)按照下式，根据最终药物CPT-11浓度相对于药物填装浓度0.16(mol/mol)的比，计算上述各CPT-11制剂的药物包封率(％)。
结果如表8及图5所示。如表及图所示的结果可知，外水相pH为8.0以下时，CPT-11的包封率(％)非常高，可达90％以上，但高于8.0时CPT-11的包封率(％)降低。
表8
验证了外水相pH对药物稳定性的影响。
在配制例10的(3)中使用的各pH的外水相溶液中(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，具体而言，分别在1mL的pH 4.0、5.0(10mM乙酸/10％蔗糖溶液)、pH 6.0(10m M组氨酸/10％蔗糖溶液)、pH 7.0、8.0、9.0(10mM Tris/10％蔗糖溶液)的溶液中，加入0.7ml浓度为10mg/mL的盐酸伊立替康(CPT-11)/RO水(逆渗透膜净水)溶液，于60℃搅拌60分钟。
将上述所得CPT-11溶液用各外相溶液稀释20倍后，用5μl试样溶液，用于高效液相色谱测定，根据下式计算CPT-11的α-羟基内酯环的水解率(开环体存在率)(％)。
CPT-11开环体存在率(％)＝{Aopen/(Aopen+1.102×Aclose)}×100Aopen＝CPT-11开环体的峰面积Aclose＝CPT-11闭环体的峰面积结果如图5所示。
已知外水相pH为8.0以上时，CPT-11开环体存在率(％)增加，变得极高，可达到95％以上。为维持CPT-11的活性，抑制α-羟基内酯环水解，必须将pH保持在4.0以下，但从脂质稳定性(脂质的水解)的观点考虑，优选pH在6.0～7.0左右。鉴于实施例6的结果可知，导入药物时外水相的pH优选在4.0～7.0。
(配制例11)(1)脂质体的形成称量70.87g HSPC及29.13g Chol，向其中加入100ml无水乙醇，加热至68℃使其溶解。确认已完全溶解后，加入900ml硫酸铵溶液(250mM)，于68℃加热搅拌。
(2)脂质体的制作脂质体的粒径控制加热搅拌后，使用加热至68℃的挤压机，通过5次孔径为100nm的过滤器。
PEG5000-DSPE的导入加入200ml PEG5000-DSPE溶液(36.74mg/ml)，使挤压后的样品具有规定的PEG5000-DSPE含有率(mol％)，加热至60℃搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE，冰浴冷却。
(3)外液置换使用错流过滤系统使冰浴冷却的样品在外水相溶液(10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH6.5))进行外液置换。针对外液置换后的脂质体分散液，使用高效液相色谱法定量HSPC浓度及胆固醇浓度。以HPSC浓度及胆固醇浓度的总和作为总脂质浓度，求出包埋的盐酸伊立替康量。
(4)药物的包埋配制浓度为10mg/ml的盐酸伊立替康(CPT-11)/RO水(逆透膜净水)溶液。以相对于上述总脂质量(mM)使CPT-11/总脂质量＝0.16(mol/mol)的量，将此盐酸伊立替康溶液加入到脂质体分散液中，于50℃搅拌20分钟，导入盐酸伊立替康。导入后的样品立即进行冰浴冷却。
(5)除去未包埋的药物在包埋盐酸伊立替康后的脂质体分散液中，加入外相液，使用错流过滤系统，除去未包埋的药物。
(6)调整浓度使用高效液相色谱法定量除去未包埋药物后的脂质体分散液中的盐酸伊立替康的量，调整盐酸伊立替康的浓度为5.0mg/mL。
(7)过滤灭菌使用0.2μm的灭菌过滤器，对调整浓度后的脂质体分散液进行过滤灭菌，填充到小瓶中。
上述所得CPT-11制剂的组成及粒径如表9所示。
表9
(试验例6)抗肿瘤效果将人前列腺癌细胞(PC-3)以2.5×106细胞/小鼠移植至小鼠(BALB/c裸鼠、雄、6周龄，日本Charluse liver)的左侧蹊部皮下。肿瘤移植后，至根据1/2·ab2(a为肿瘤长径，b为短径)求得的推定肿瘤体积达到40mm3左右(0天)的第二天开始，每隔4天共计3次(第1、5、9天)尾静脉注射配制例11配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液。以未注射药物的小鼠作为对照组。
求出于第1、5、9、12、16、22天的推定肿瘤体积及小鼠体重。
另外，在第22天切出肿瘤，测定重量后，根据下式算出肿瘤增殖抑制率I.R(％)。
I.R％＝(1-给药组的平均肿瘤重量/对照组的平均肿瘤重量)×100结果如表10及图6与图7所示。
对于人前列腺癌，CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液与对照组相比均显示显著的肿瘤增殖抑制效果(表10，图6)。另外，与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比，CPT-11制剂具有较高抗肿瘤效果。需要说明的是，两种药物对小鼠的体重均无影响(图7)。
表10
(试验例7)药物动态从马来猴(Macaca fasicularis)(雄性，4～5岁，Guangxi ResearchCenter of Primate Laboratory Animal)的桡侧皮静脉持续4分钟给与配制例11配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液，以盐酸伊立替康的量计为10mg/kg。
在给药刚结束后及给药开始后10、30分钟，及1、6、24、48、72、168、336、504小时后采血，经离心分离得血浆。在50ml血浆中加入550μl内标溶液B(内标物质的甲醇溶液)，经离心，用甲醇稀释上清液100倍作为总CPT-11浓度测定用试样。另一方面，在50ml各血浆中加入200ml内标溶液A(内标物质的0.147mol/L H3PO4溶液)，将其中200ml进行超离心(100000×g，30分钟，10℃)，从上层部取100ml进行固相萃取，将萃取液作为游离CPT-11浓度、SN-38浓度及SN-38G(SN-3810-O-葡糖苷酸)浓度测定用试样。利用LC/MS/MS分别测定所得试样的浓度。结果如图8～11所示。
关于总CPT-11浓度，在给与盐酸伊立替康生理盐水溶液后迅速地减少，至给药1小时为止，减少至低于规定量下限值(＜1mg/ml)。而给与CPT-11制剂时，从给药后1小时至48小时为止大致呈指数函数地减少，与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比，可显著地延长滞留时间(图8)。
关于游离CPT-11浓度，在刚给与盐酸伊立替康生理盐水溶液后达到最高浓度，其后6小时内较快速地减少，6小时后缓慢地减少。另一方面，CPT-11制剂在开始给药后的1小时达到最高浓度，之后缓慢地减少(图9)。
关于SN-38浓度，在刚给与盐酸伊立替康生理盐水溶液后立即达到最高浓度，其后迅速地减少，直至24小时为止减少到低于规定量下限(＜0.0005mg/ml)。另一方面，CPT-11制剂给与后立即达到最高浓度，维持1小时后减少，在从6小时至48小时为止大致维持在一定值(图10)。
关于SN-38G的浓度，在给与CPT-11制剂、盐酸伊立替康生理盐水溶液1小时后为止均急速地增加，然后维持浓度仅微量减少(图11)。
(试验例8)血液毒性对大鼠(CD(SD)IGS大鼠，雄性，7周龄，日本Charlus liver)尾静脉给与配制例11配制的CPT-11制剂，以盐酸伊立替康量计为3、10及30mg/kg，以及以30mg/kg的剂量给与盐酸伊立替康生理盐水溶液，。
在给药前及给药后第2、4、6、13、20、27天(4周)，从颈静脉采血0.4ml，在血液自动分析装置(Sysmex XT-2000i，Sismex)中测定嗜中性粒细胞数及淋巴细胞数。结果如图12及图13所示。
在给与药物时，嗜中性粒细胞均在刚刚给药后呈现一过性减少，但之后迅速恢复。与3mg/kg相比，10及30mg/kg减少程度较大，但在恢复期，30mg/kg呈现急剧增加。两种药物在30mg/kg时，对嗜中性粒细胞变化没有显著差异(图12)。淋巴细胞数在给药后立即呈现减少倾向，但其程度微弱，各给药剂量之间未见差异(图13)。
根据以上结果可知，CPT-11制剂虽然对嗜中性粒细胞有一过性微弱的血液毒性，但与同剂量的盐酸伊立替康生理盐水溶液的血液毒性同等程度。
(配制例12)(1)脂质体的形成称量65.250g HSPC及26.800g Chol及8.000g TRX-20，向其中加入100ml无水乙醇，在68℃加热溶解。确认完全溶解后，加入900ml硫酸铵溶液(250mM)，在68℃加热搅拌。
(2)脂质体的制作加热搅拌后，使用加热至68℃的挤压机，5次通过孔径100nm的过滤器。
PEG5000-DSPE的导入加入200ml PEG5000-DSPE溶液(36.74mg/ml)，使挤压后的样品具有规定的PEG5000-DSPE含率(mol％)，在60℃加热搅拌30分钟，导入PEG5000-DSPE进行冰浴冷却。
(3)外液置换使用错流过滤系统，使冰浴冷却的样品在外水相溶液(10mM组氨酸/10％蔗糖溶液(pH 6.5))中进行外液置换。采用高效液相色谱定量外液置换后的脂质体分散液中HSPC浓度及胆固醇浓度。以HPSC浓度、胆固醇浓度及TRX-20浓度的总和作为总脂质浓度，求出包埋的盐酸伊立替康的量。
(4)药物的包埋配制浓度为10mg/ml的盐酸伊立替康(CPT-11)/RO水(逆渗透膜净水)溶液。以相对于上述总脂质量(mM)使CPT-11/总脂质量＝0.16(mol/mol)的量，将此盐酸伊立替康溶液加入到脂质体分散液中，于50℃搅拌20分钟，导入盐酸伊立替康。立即冰浴冷却导入后的样品。
(5)未包埋药物的除去在包埋盐酸伊立替康后的脂质体分散液中加入外水相，使用错流过滤系统除去未包埋的药物。
(6)浓度调整使用高效液相色谱，对除去未包埋药物后的脂质体分散液中的盐酸伊立替康进行定量，调整盐酸伊立替康浓度为5.0mg/ml。
(7)过滤灭菌使用0.2μm的灭菌过滤器，对调整浓度后的脂质体分散液进行过滤灭菌，填充于小瓶中。
上述所得的CPT-11制剂的组成及粒径如表11[表11]表11
(试验例9)抗肿瘤效果将人大肠癌细胞(HCT116)以2×106个细胞/小鼠移植至小鼠(BALB/c裸鼠，雄性，6周龄，日本Charluse liver)的左侧蹊部皮下。肿瘤移植后，从根据1/2·ab2(a为肿瘤长径，b为短径)求得的推定肿瘤体积达到90mm3左右(0天)的第二天开始，每4天共计3次(第1、5、9天)尾静脉注射配制例12配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液。未注射药物的小鼠作为对照组。
注射后，于第5、8、12、16、21天后求出推定肿瘤体积及小鼠的体重。需要说明的是，注射第21天后切割肿瘤测量重量后，根据试验例6中所示的计算式，算出肿瘤增殖抑制率I.R.(％)。
结果如表12及图14与图15所示。
对于人的大肠癌，CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液与对照群相比，均具有显著的肿瘤抑制效果。另外，CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水相比，具有较高的抗肿瘤效果(表12，图14)。需要说明的是，两种药物对于小鼠体重均无影响(图15)。
表12
(试验例10)单次给药时的药物动态在麻醉状态下，在大鼠(CD(SD)IGS大鼠，雄性，7周龄，日本Charluse liver)大腿静脉及大腿静脉中插入套管，然后装入Bollman笼子中，由大鼠的大腿静脉套管静脉给与配制例12配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水稀释溶液，以盐酸伊立替康的量计为3、10及30mg/kg。
给药后在2、10、30分钟，1、3、6、9、24及30小时，从大腿动脉套管采血，离心后取50ml血浆，用200ml内标液进行稀释。在50ml此内标液稀释血浆中加入500ml甲醇搅拌后，用0.146M H3PO4稀释10倍的所得物作为总CPT-11浓度测定用试样。另一方面，超离心(100000×g，30分钟，10℃)200ml内标液稀释血浆，从上层部取出50ml并用0.146M H3PO4稀释10倍所得的液体作为测定游离CPT-11浓度、SN-38浓度及SN-38G浓度测定用试样。根据Kurita等的方法(J.Chromatogr B 724，p335-344，1999)，利用PROSPEKT-HPLC分别测定所得试样的浓度。结果如图16-19所示。
盐酸伊立替康生理盐水溶液的各给药量(3、10及30mg/kg)给药后，总CPT-11浓度均急剧地减少，从0.5至9小时为止的时间内呈指数函数地减少。另一方面，CPT-11制剂给与10分钟后至30小时为止大致以指数函数减少，与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比，确认可显著地延长滞留时间(图16)。
给与CPT-11制剂后的游离CPT-11的浓度，均在从给与后10分钟至30小时为止，大约以指数函数减少，确认与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比显著地延长滞留时间(图17)。
SN-38浓度，在盐酸伊立替康生理盐水溶液的各给药量给药后，均立即急剧地减少，但1小时以后消失变缓慢，30mg/kg时3小时后为止大约维持一定的浓度。另一方面，CPT-11制剂在3及10mg/kg剂量下给与3～6小时后可达最高浓度，然后缓慢地减少。以30mg/kg给药后立即达最高浓度，之后1小时内急速减少，但在其后9小时内，大致可维持一定浓度(图18)。
SN-38G浓度，在盐酸伊立替康生理盐水溶液的各给药剂量给药10分钟后，均达最高浓度，其后1小时内较快速地减少，之后则缓慢地减少。另一方面，CPT-11制剂在给药后1小时内，浓度增加，其后维持在该浓度，仅微量减少(图19)。
以配制例9中配制的CPT-11制剂作为本发明高载带CPT-11制剂，进行试验。
(试验例11)抗肿瘤效果用移植针将2～3mm四方形的人大肠癌细胞(HT-29)移植至小鼠(BALB/c裸鼠，雄性，6周龄，日本Clea)的蹊部皮下。移植肿瘤后，尾静脉注射配制例9中配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液，分被在根据1/2·ab2(a为肿瘤长径，b为短径)求出的推定肿瘤体积达到100mm3左右时(第1天)与4天后(第5天)及8天后(第99天)，共计3次。未注射药物的小鼠作为对照组。
首次注射后，于4、8、12、17、21天后求出推定肿瘤体积及小鼠的体重。另外，首次注射后第21天取出肿瘤，测定重量后，通过试验例6中所示的计算式，算出肿瘤增殖抑制率I.R.(％)。
结果如表13、图20及图21所示。
对人的大肠癌，CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液与对照组相比均显示强肿瘤增殖抑制效果。另外，CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比具有较高的抗肿瘤效果(表13，图20)。需要说明的是，两种药物对小鼠体重均无影响(图21)。
表13
(试验例12)单次给药的药物动态将小鼠纤维肉瘤(Meth A)以2.5×105细胞/小鼠移植至小鼠(BALB/c，雌性，7周龄，日本S.LC)的蹊部皮下。肿瘤移植后放置20天，使肿瘤增殖，之后尾静脉给与配制例9中配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液，以盐酸伊立替康浓度计为10mg/kg。
给药后在10、30分钟及1、3、6、12、24、48、96小时后心脏采血，经离心(15000rpm，1分钟，0℃)得到血浆。在测定给与CPT-11制剂的动物血浆中CPT-11的浓度时，以用0.146M H3PO4将所得血浆稀释50倍后加入等量的内标液所得的溶液作为测定用试样。在测定给与CPT-11制剂的动物血浆中的SN-38及SN-38G浓度及给与盐酸伊立替康生理盐水溶液的动物血浆中药物浓度时，以用0.146M H3PO4将所得血浆稀释4倍后加入等量的内标液所得溶液作为测定用试样。
心脏采血后，从鼠蹊部取出肿瘤，用生理食盐水洗净后，测定肿瘤重量。加入5倍量的冰冷的0.146MH3PO4后，用特氟龙(Teflon)均浆器进行均浆。在200ml均质物中加入50ml内标液及0.75ml甲醇，使其悬浊后，在-20℃下放置一夜。经离心(15000rpm，3分钟，0℃)后，在0.1ml上清液中加入0.4ml的0.146M H3PO4作为HPLC测定用试样。按照Kurita等的方法(J.Chromatogr B 724，p335-344，1999)，采用PROSPEKT-HPLC分别测定所得测定用试样的浓度。结果如图22～27所示。
CPT-11在血浆中的浓度，通过脂质体制剂化，使CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比较，血浆中浓度-时间曲线下面积增加302倍，平均滞留时间增加4.4倍(图22)。另一方面，SN-38在血浆中的浓度通过脂质体制剂化，血浆中浓度-时间曲线下面积增加2.5倍，平均滞留时间也得到延长(图23)。另外，SN-38G的浓度通过脂质体制剂化，血浆中浓度-时间曲线下面积增加1.8倍，平均滞留时间也得到延长(图24)。
关于盐酸伊立替康在肿瘤组织内的药物浓度，在盐酸伊立替康生理盐水溶液给药后0.5小时在肿瘤组织中达到最高浓度后，以2.3小时的半衰期减少。另一方面，在给与CPT-11制剂后浓度会缓慢增加，12小时后在肿瘤组织中达最高浓度，之后减少，与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比较缓慢，肿瘤组织中浓度-时间曲线下面积增加9.0倍(图25)。
SN-38在肿瘤组织内的药物浓度，在盐酸伊立替康生理盐水溶液给药后10分钟在肿瘤组织中达到最高浓度，之后慢慢减少。在CPT-11制剂给与后约6小时内慢慢上升，其后至48小时内大致维持稳定。然后以与盐酸伊立替康生理盐水溶液大约相同的半衰期减少，肿瘤组织中浓度-时间曲线下面积增加3.9倍(图26)。
SN-38G在肿瘤组织内的药物浓度，在盐酸伊立替康生理盐水溶液给药后10分钟在肿瘤组织中达到最高浓度，之后慢慢减少。在CPT-11制剂给与后慢慢上升，至给药后12小时在肿瘤组织中达到最高浓度，然后慢慢减少(图27)。
由此可知，CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比，具有更高的血中滞留性及肿瘤移行性。
以配制例7中配制的CPT-11制剂作为本发明的高载带CPT-11制剂，进行试验。
(试验例13)3次给药的抗肿瘤效果将小鼠纤维肉瘤(Meth A)以2.5×105细胞/小鼠移植至小鼠(BALB/c，雌性，7周龄，日本Clea)的蹊部皮下。于移植肿瘤后第7、9、11天，或第7、11、15天共计3次，尾静脉注射配制例7中配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液。末注射药物的小鼠为对照组。
注射后第21天切出肿瘤，测定重量后，根据试验例6中所示的计算式，算出肿瘤增殖抑制率I.R.(％)。结果如表14所示。
对于小鼠纤维肉瘤，CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液系与对照群相比均具有显著的肿瘤增殖抑制效果。另外，CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比具有更高的抗肿瘤效果。需要说明的是，两种药物对小鼠体重均无影响。
表14
(试验例14)1次或2次给药所得的抗肿瘤效果将小鼠纤维肉瘤(Meth A)以2.5×105细胞/小鼠移植至小鼠(BALB/c，雌性，7周龄，日本Clea)的蹊部皮下。移植肿瘤后第7、11天，共计1次或2次，尾静脉注射配制例7中配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液。未注射药物的小鼠为对照组。
注射后第21天切割肿瘤测定重量后，根据试验例6中所示的计算式，算出肿瘤增殖阻断率I.R.(％)。结果如表15所示。
除去一部份盐酸伊立替康生理盐水溶液以外，CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液与对照组相比对于小鼠纤维肉瘤均具有显著的肿瘤增殖抑制效果。另外，CPT-11制剂与盐酸伊立替康生理盐水溶液相比具有更高的抗肿瘤效果。需要说明的是，两种药物对小鼠体重均无影响。
表15
以配制例8中配制的CPT-11制剂作为本发明的高载带CPT-11制剂，进行试验。
(试验例15)抗肿瘤效果用移植针将2～3mm方形的人肺癌细胞(QG56)移植至小鼠(BALB/c裸鼠，雄性，6周龄，日本Clea)的蹊部皮下。移植肿瘤后，根据1/2·ab2(a为肿瘤长径，b为短径)求出的推定肿瘤体积达到1mm3左右的时间(第1天)与其4天后(第5天)及8天后(第9天)共计3次，尾静脉注射配制例8中配制的CPT-11制剂或盐酸伊立替康生理盐水溶液。未注射药物的小鼠作为对照组。
第一次注射后，于4、8、12、16、21天后求出推定肿瘤体积及小鼠体重。另外，第一次注射后，在第21天取出肿瘤，测定重量后，根据试验例6中所示的计算式算出肿瘤增殖抑制率I.R.(％)。结果如表16，图28及图29所示。
CPT-11制剂及盐酸伊立替康生理盐水溶液与对照组相比，对人肺癌均具有显著的肿瘤增殖抑制效果。另外，CPT-11制剂比盐酸伊立替康生理盐水溶液具有更高的抗肿瘤效果(表16，图28)。需要说明的是，两种药物对小鼠体重均无影响(图29)。
表16
权利要求
1.一种伊立替康制剂，是在由脂质膜形成的封闭囊泡中以至少0.07mol/mol(药物mol/膜总脂质mol)的浓度包埋伊立替康及/或其盐而形成的。
2.如权利要求1所述的伊立替康制剂，其中所述伊立替康制剂在所述封闭囊泡的内水相与外水相之间具有离子梯度。
3.如权利要求2所述的伊立替康制剂，其中所述离子梯度为质子浓度梯度，具有所述内水相侧pH值比外水相侧pH值低的pH梯度。
4.如权利要求3所述的伊立替康制剂，其中所述pH梯度由铵离子浓度梯度及/或具有可被质子化的氨基的有机化合物的浓度梯度形成。
5.如权利要求1～4中任一项所述的伊立替康制剂，其中所述封闭囊泡是由含有磷脂为主要膜材的脂质双层膜形成的脂质体。
6.如权利要求5所述的伊立替康制剂，其中所述脂质体还含有所述磷脂以外的脂质及/或表面修饰剂。
7.如权利要求6所述的伊立替康制剂，其中只有所述脂质体的外表面被含有亲水性高分子的表面修饰剂所修饰。
8.如权利要求6或7所述的伊立替康制剂，其中作为所述表面修饰剂含有具有碱性官能团的化合物。
9.一种药物组合物，含有如权利要求1～8中任一项所述的伊立替康制剂。
全文摘要
本发明提供一种伊立替康制剂，所述伊立替康制剂通过封闭囊泡载体高度载带伊立替康及/或其盐、与现有公知的伊立替康脂质体制剂相比能够更加显著地提高血中滞留性，长期存在于血液中。所述伊立替康制剂以至少0.07mol/mol(药物mol/膜总脂质mol)的浓度将伊立替康及/或其盐包封在由脂质膜形成的封闭囊泡中。伊立替康制剂优选在封闭囊泡的内水相与外水相之间具有离子梯度。封闭囊泡优选为脂质体，所述脂质体优选只有外表面用含有亲水性高分子的表面修饰剂进行修饰。
文档编号A61K47/18GK1960729SQ200580017600
公开日2007年5月9日 申请日期2005年5月31日 优先权日2004年6月1日
发明者吉野敬亮, 野泽滋典, 矶崎正史, 泽田诚吾, 加藤几雄, 松崎健 申请人:泰尔茂株式会社, 株式会社益力多本社