生物转化熊胆粉在制备镇咳药物中的应用的制作方法

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及生物转化熊胆粉在制备镇咳药物中的应用。

背景技术：

熊胆，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，具有清热、平肝、明目的功效，其主要成分是牛磺熊去氧胆酸(tudca)。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历史，有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨，仍然满足不了人类健康的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加，使得熊胆粉的价格节节攀升，市场价格已经超过了5000元/kg。更为严峻的是，国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制，特别是最近的“归真堂”事件再次引起了国际国内社会的广泛关注，给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。因此，加快人工熊胆的研发是促进熊胆产业可持续发展的关键。

本发明的申请人已于2015年3月4日向专利局提交了发明名称为“一种人工熊胆粉及其制备方法(申请号201410588581.5、申请公布号cn104382941)”的发明专利申请，该发明专利申请的内容以全文引用的方式并入本申请中。

上述发明专利申请201410588581.5中，提供了一种人工熊胆粉及其制备方法，在不添加其他化学成分的前提下，将禽畜胆汁体外模拟生物催化转化，并通过一定工艺制成人工熊胆。本申请所提供的就是该种生物转化熊胆粉在制药中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供生物转化熊胆粉在制备镇咳药物中的应用。本发明所述的生物转化熊胆粉即为发明专利申请201410588581.5中公开的人工熊胆粉。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供生物转化熊胆粉在制备镇咳药物中的应用。

在本发明所提供的应用中，所述的镇咳药物是降低咳嗽频率的药物。

在本发明所提供的应用中，所述的镇咳药物是延长咳嗽潜伏期的药物。

所述生物转化熊胆粉是通过如下方法制备的：

a)将禽畜胆粉用ph＝7～9的缓冲液溶解后，在11000g条件下离心10min，多次过滤，得到滤渣和滤液，所述滤渣冷冻干燥保存；

b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶i或辅酶ii的反应器中进行反应；所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在；

c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合，得到人工熊胆粉；

本发明中所述的禽畜胆粉是鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。

所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下：总胆酸：40～65％,氨基酸：4～9％,微量元素：0.5～1％。其中，所述总胆酸中含有tcdca，所述tcdca占禽畜胆粉的质量百分比为40～50％。

本发明对生物转化熊胆粉进行了镇咳药效活性的对比研究。采用氨水作为诱咳剂，小鼠吸入刺激性化学物质氨水的气雾后，刺激呼吸道感受器，反射性引起咳嗽。此外，喷托维林(咳必清)为非成瘾性中枢镇咳药，对咳嗽中枢与直接抑制作用，兼有局部麻醉作用，适用于上呼吸道炎症引起的咳嗽，申请人以喷托维林(咳必清)作为阳性药。

通过对生物转化熊胆粉对小鼠咳嗽模型的影响的动物实验，申请人意外地发现，生物转化熊胆粉可延长氨水引咳小鼠的咳嗽潜伏期、降低氨水引咳小鼠咳嗽次数，其镇咳作用明显优于天然熊胆粉，由此揭示了生物转化熊胆粉在制备镇咳药物中的用途前景。

附图说明

图1是根据实施例2的生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽模型潜伏期的影响结果图；

图2是根据实施例2的生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽模型咳嗽次数的影响结果图。

具体实施方式

实施例1生物转化熊胆粉的制备

按照发明专利申请201410588581.5中的制备方法进行生物转化熊胆粉的制备。本发明所采用的制备原料禽胆可以为(且不局限于)鸡胆、鸭胆、鹅胆、牛胆、兔胆、狗胆、羊胆等。本发明中所述的禽畜胆粉可以为(且不局限于)鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉等禽畜胆粉中的一种或多种混合物。较佳地，禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下：胆酸：40～65％，氨基酸：4～9％，微量元素：0.5～1％；其中，所述总胆酸中含有tcdca，所述tcdca占禽畜胆粉的质量百分比为40～50％。除上述主要成分外，禽畜胆粉还含有其他成分，包括：水分、胆色素、维生素、胆固醇、脂肪酸等。

本实施例以鸡胆粉制备生物转化熊胆粉为例，步骤具体如下：

1、鸡胆粉的制备

鸡胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75％酒精对鸡胆局部进行消毒，然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁冷冻干燥48h，得到鸡胆粉，放置干燥器中保存备用。

2、生物转化熊胆粉的制备

(1)鸡胆粉的处理

使用ph7.0～9.0的缓冲液溶解鸡胆粉，配制1l溶液，超声充分溶解，所述缓冲液优选磷酸盐缓冲液(pbs)、tris-hcl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(gly-naoh)；将鸡胆粉溶液在11000g条件下离心10min后，多次过滤，上清液(滤液)作为禽畜胆粉处理液在4℃保存，备用；滤渣冷冻干燥，保存备用

(2)固定化酶的制备

在1％的壳聚糖(水溶性)溶液中加入适量醋酸，磁力搅拌30min制得壳聚糖醋酸溶液。将上述溶液用高压注射泵注入到100ml3％(w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化1～2h，得到粒度均匀、形状规则的白色的壳聚糖球，然后过滤，用去离子水洗涤多次。将制备好的壳聚糖球放入盛有0.125％戊二醛水溶液的烧杯中，并置于37℃，170g下的摇床中，活化2～4h，即得活化壳聚糖微球。称取10g活化好的壳聚糖微球，装入小型层析柱，加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液，所述7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hsdh)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hsdh)来自于微生物，如撒丁岛梭菌(clostridiumsardiniense，dsm599/atcc27555)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilisatcc25825)或产气柯林斯菌(collinsellaaerofaciensatcc25986)。采用垂直混合方式结合4～6h，固定完毕，放出酶液，并用pbs缓冲液冲洗固定后酶柱3～5次。结果检测表明7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90％。

(3)生物催化转化

在固定化酶柱中加入第(1)步制备好的鸡胆粉溶液处理后的滤液作为反应底物溶液，加入辅酶i或辅酶ii，使辅酶i(或辅酶ii):tcdca＝1:2～1:4(摩尔比)，在20～30℃下，反应2～6h。

(4)反应液的处理

将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h，得固体反应产物。最后将在第(1)步得到的滤渣与反应产物混合均匀，即得生物转化熊胆粉。

实施例2镇咳实验：对氨水致小鼠咳嗽模型的影响

1.材料

1.1生物转化熊胆粉(abbp)，由上海凯宝药业提供，批号：20160801，临用前将受试药物以纯水分别配制2.5、5.0、10.0、20.0mg/ml的溶液，临床拟人用剂量为0.3-1g/日，取中剂量，即0.01g/kg(人以70kg计)。

1.2氨水，中国国药集团上海化学试剂公司，批号：20160921。

1.3动物：健康icr种小鼠，雄性体重20-22g，雌性体重18-20g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：scxk(沪)2012-0002，由上海中医药大学动物实验中心饲养管理，许可证号：syxk(沪)2014-0008，温度20-26℃，湿度40-70％，12h/12h阴暗光照周期。

1.4xs105型电子分析天平(mettlertoledo公司生产)；yls-8a多功能型诱咳引喘仪(山东省医学科学院设备站生产)。

2.方法

取健康小鼠，分为模型组和生物转化熊胆粉2个剂量组(0.05、0.10、0.20、0.40g/kg)，每组12只。

灌胃给药3天，容积均为20ml/kg体重，每天1次，模型组给予纯净水；末次给药1h后将小鼠放入固定器内，将小鼠置于多功能诱咳引喘仪内，以恒压将氨水喷雾2s，记录小鼠咳嗽的潜伏期，并记录2min内咳嗽次数。以典型咳嗽动作(腹肌收缩或缩胸，同时张大嘴，有时可闻咳声)者算作“有咳嗽”，否则算作“无咳嗽”。

统计方法：采用spss21.0统计软件进行实验数据分析。计量资料以“均数±标准差”(mean±sd)表示，采用单因素方差分析，进一步采用lsd法进行给药组与模型组的两两比较、snk法进行组间多重两两比较，而偏态或方差不齐时采用秩和检验。以p<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽模型的影响结果见表1、图1和图2。

表1生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽的影响(n＝12)

注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

此外，图1是生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽模型潜伏期的影响；图2是生物转化熊胆粉对氨水致小鼠咳嗽模型咳嗽次数的影响。图1和图2中，与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

实验结果显示，与模型组比较，生物转化熊胆粉各剂量组小鼠咳嗽潜伏期差异有显著意义(p<0.05，p<0.01)。与模型组比较，生物转化熊胆粉各剂量组小鼠咳嗽次数差异有显著意义(p<0.05，p<0.01)。

以上药效实验数据表明，生物转化熊胆粉在镇咳方面的药效活性相对于天然熊胆粉具有预料不到的提高，提示生物转化熊胆粉可用于制备镇咳药物、并具有较佳药效活性。