臭氧化油预防／治疗牙周病的新用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及臭氧化油在制备用于预防和/或治疗牙周病药物中的应用。

背景技术：

牙周炎是由菌斑微生物侵犯牙周支持组织引起的慢性感染性疾病，以牙周结缔组织降解、牙槽骨吸收为主要特征，是导致我国成人失牙的主要原因。

牙周炎主要与革兰阴性厌氧微生物的定植有关，特别是牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌等被认为是牙周病的主要致病菌。所以牙周炎治疗的主要目的是消除病原体的生物膜。龈上、龈下机械清创术是治疗牙周炎的传统初始步骤，对医生技术要求高且操作较困难。此外，仅通过机械清创术很难完全清除牙周病原菌。故一些局部抗菌剂和局部或全身抗生素被用来增加机械清除作用。然而，局部和全身抗生素治疗有几个明显的缺点，如抑菌具有选择性，导致细菌耐药性和宿主不良反应。牙周治疗中使用最广泛的抗菌剂氯己定(chx)可导致粘膜脱落，牙齿染色，和味觉改变。此外，即使低浓度的chx对牙龈成纤维细胞也有毒性，从而减少胶原和非胶原蛋白的产生，阻碍牙周愈合。常用的牙周局部抗菌剂还有3％的过氧化氢(h2o2)，但过氧化氢作用时会产生大量气泡，进行较深牙周袋龈下冲洗时可能会导致皮下气肿。因此，选择抗菌活性高、安全性好、副作用小的辅助性抗菌药物对牙周病的治疗有重要价值。

臭氧(o3)是一种淡蓝色带有腥味的气体，是氧气(o2)的同素异形体，具有极强的氧化性。臭氧不稳定，可自行分解为氧气，常温下半衰期为20-30min。常温常压下，臭氧在水中的溶解度比空气25倍，比氧高13倍。早期主要被应用于清除饮用水与生活污水中的有害化合物。现发现臭氧对细菌、真菌、病毒均具有较强的杀灭作用。近年来也有很多报道指出臭氧还具有抗炎、抗氧化、促进组织愈合、止血等作用。目前臭氧应用主要有三种形式，气态臭氧，液态臭氧及臭氧化油。臭氧化油是以油作为载体，将臭氧气体通入其中制得，经济环保，稳定性好，不易分解，可长期保存，实验和临床应用的可行性更高。有研究报道臭氧化油的应用在心血管、妇科、皮肤、肝脏、关节及肠胃等疾病中均取得较好的疗效，臭氧化油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白念珠菌等多种细菌，病毒均有显著的杀灭效果。然而关于臭氧化油在牙周疾病中应用的研究很少，其对三种牙周病的主要致病菌(牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌)的抗菌效果及最小抑菌、杀菌浓度的研究未见报道。本发明通过相关实验研究，从多方面确证臭氧化油对上述三种牙周病主要致病菌的抗菌作用，为其作为防治牙周病药物的应用提供可能。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供臭氧化油预防/治疗牙周病的新用途，本发明的有益效果是臭氧化油用于预防/治疗牙周病具有良好的效果。臭氧化油抗菌活性高、天然环保，副作用小，可为牙周病的防治提供一种新的选择。

臭氧化油预防/治疗牙周病。

进一步，臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抑菌效果。

进一步，低浓度的臭氧化油具有对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抗菌活性。

进一步，臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌生物膜形成有抑制作用。

进一步，臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的成熟生物膜的清除均有效果，且对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌成熟生物膜的清除作用明显强于伴放线聚集杆菌。

附图说明

图1是臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抑菌效果图。

图2是臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌生物膜形成的影响的统计图；

图3是臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌成熟生物膜的影响的统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

实验菌株：牙龈卟琳单胞菌(porphyromonasgingivalis，p.gingivalis，pg)atcc33277、具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum，f.nucleatum，fn)atcc23726、伴放线聚集杆菌(actinobacillusactinomycetemcomitans，a.actinomycetemcomitans，aa)atcc29523，由南京医科大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。

细菌的复苏、培养及菌悬液的配制：将冻存的牙龈卟琳单胞菌atcc33277、具核梭杆菌atcc23726、伴放线聚集杆菌atcc29523国际标准株分别复苏于bhi培养基中，放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)培养，其中专性厌氧菌(牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌)培养72h，兼性厌氧菌(伴放线聚集杆菌)培养48h后，取其纯培养物分别接种于液体培养基中在相同培养条件下培养增菌48h，采用比浊法测定菌悬液浓度，磷酸缓冲液(pbs)配制浓度为1×10⁸cfu/ml和2×10⁶cfu/ml的细菌菌悬液备用。

实施例1琼脂扩散实验(打孔法)评估臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抑菌效果。

在无菌条件下，取100ul稀释好的1×10⁸cfu/ml的菌悬液用无菌接种环均匀涂布于含bhi琼脂培养基(25ml)的培养皿(90mm)上，静置数分钟。用6mm的打孔器在培养皿上均匀打4个孔，且两孔之间的距离应大于24mm，孔与培养皿边缘的距离应大于15mm。每孔内加入100ul相应的试剂，实验组为臭氧化油(90mg/ml)，阴性对照组为pbs，阳性对照组为0.12％的氯己定和1％的碘甘油。放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)培养48h(牙龈卟琳单胞菌培养72h)，肉眼观察，同时用菌落自动计数仪拍照、测量并记录抑菌圈直径，用mm表示。以肉眼未见菌落生长的区域为抑菌圈边缘，抑菌圈内有少量难辨认的细小菌落不计在内。所有实验重复至少三次。

实施例2微量肉汤稀释法探究臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抗菌活性。

实验分为空白组(不含菌悬液的培养基)、阴性对照组两组(含菌悬液的培养基、含pbs的菌悬液培养基)、阳性对照组两组(含不同浓度氯己定的菌悬液培养基、含不同浓度碘甘油的菌悬液培养基)、实验组(含不同浓度臭氧化油的菌悬液培养基)。用bhi培养基按二倍稀释法分别将0.12％的氯己定、1％的碘甘油及90mg/ml的臭氧化油稀释成1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048的共11个浓度梯度。向96孔板每孔依次加入100ul上述稀释好的不同浓度的试剂(阴性对照组两组分别加入100ul的bhi和100ul的pbs)，再将100ul配置好的2×10⁶cfu/ml的菌悬液接种于各孔中，使每孔细菌终浓度为1×10⁶cfu/ml。但空白组不加菌悬液，每孔仅为200ul的无菌bhi培养基。每组设置3个复孔。放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)中培养48-72h，凡肉眼观察微孔内液体清亮无浑浊或底部无沉淀生长则为最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)。将孔内液体混匀后取10ul用无菌接种环均匀涂布于bhi琼脂培养基上，放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)中培养48-72h，观察无细菌生长则为最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)。所有实验重复至少三次。

实施例3结晶紫染色法评估臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌生物膜形成的影响。

唾液的采集：取三名健康成年人无刺激性静止唾液，10000×g离心20min后取上清，用0.22um孔径的无菌一次性过滤器过滤除菌，分装后于-80℃储存备用。

构建唾液包被的体外粘附模型：在96孔板中每孔加入10ul的唾液，于37℃环境下静置1h，弃去多余唾液，无菌条件下自然晾干。

向96孔板加入100ul稀释好的浓度为2×10⁷cfu/ml的菌悬液，再分别加入100ul1/4×mic、1/2×mic、mic、2×mic、4×mic五种浓度的相应的试剂，使每孔细菌终浓度为1×10⁷cfu/ml。以只加菌悬液和bhi培养基的孔作为阴性对照孔，以只加无菌bhi培养基的孔作为空白孔。每组设置3个复孔。放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)中培养24h后，弃去原有液体，pbs洗三次以去除悬浮细菌，过程中动作要轻，以免破坏已形成的生物膜。然后加入200ul的甲醇固定15min，晾干后加入200ul的0.1％的结晶紫室温下避光孵育20min，用去离子水将过量的染料洗干净，室温下晾干。每孔再加入200ul95％的乙醇溶解与细胞结合的染料，室温下避光孵育20min。用微孔板分光光度计在595nm处读出od值。所有实验至少重复三次。生物膜形成率(％)＝[(实验组od-空白组od)/(对照组od-空白组od)]×100％。

实施例4结晶紫染色法评估臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌成熟生物膜的影响。

唾液的采集：取三名健康成年人无刺激性静止唾液，10000×g离心20min后取上清，用0.22um孔径的无菌一次性过滤器过滤除菌，分装后于-80℃储存备用。

构建唾液包被的体外粘附模型：在96孔板中每孔加入10ul的唾液，于37℃环境下静置1h，弃去多余唾液，无菌条件下自然晾干。

向96孔板加入200ul稀释好的浓度为1×10⁷cfu/ml的菌悬液，放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)中培养24h后，弃去原有液体，加入100ul无菌的bhi培养基，再分别加入100ul1/4×mic、1/2×mic、mic、2×mic、4×mic五种浓度的相应的试剂，以只含有菌悬液和bhi培养基的孔作为阴性对照孔，以只有无菌bhi培养基的孔作为空白孔。每组设置3个复孔。放入37℃恒温厌氧箱(80％n2,10％co2,10％h2)中培养24h后，弃去原有液体，pbs洗三次以去除悬浮细菌，过程中动作要轻，以免破坏已形成的生物膜。然后加入200ul的甲醇固定15min，晾干后加入200ul的0.1％的结晶紫室温下避光孵育20min，用去离子水将过量的染料洗干净，室温下晾干。每孔再加入200ul95％的乙醇溶解与细胞结合的染料，室温下避光孵育20min。用微孔板分光光度计在595nm处读出od值。所有实验至少重复三次。生物膜总量(％)＝[(实验组od-空白组od)/(对照组od-空白组od)]×100％。

实验结果：

1.臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抑菌效果。

结果如图1所示，臭氧化油对上述三种牙周病主要致病菌均有明显的抑菌作用，尤其是对牙龈卟琳单胞菌和具核梭杆菌的抑菌效果明显优于0.12％氯己定、1％碘甘油。其中图中a、b是臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌的抑菌效果直观图；c是臭氧化油对具核梭杆菌的抑菌效果直观图；d是臭氧化油对伴放线聚集杆菌的抑菌效果直观图；e是臭氧化油对上述三种细菌抑菌圈大小的统计图，抑菌圈直径以均数±标准误表示，实验组与阳性对照组间相互比较：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与阴性对照组比较：#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001。

2.臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌的抗菌活性。

结果如表1所示，臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌的mic及mbc均为0.0439mg/ml、对具核梭杆菌的mic及mbc均为0.1758mg/ml，对伴放线聚集杆菌的mic为5.6250mg/ml，mbc为11.2500mg/ml。此结果表明较低浓度的臭氧化油即可起到抗牙周致病菌的作用。

表1.微量肉汤稀释法评估臭氧化油对三种牙周致病菌的最小抑菌浓度(mic)及最小杀菌浓度(mbc)。

3.臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌生物膜形成的影响。

结果如图2所示，与未处理组做比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。mic：最低抑菌浓度；mbc：最低杀菌浓度。

臭氧化油浓度为1/4×mic时便可大量抑制牙龈卟琳单胞菌，但0.12％氯己定仅在mic，1％碘甘油仅在1/2×mic浓度时才对牙龈卟琳单胞菌生物膜形成起到抑制作用，且抑制率较臭氧化油低；臭氧化油在1/4×mic、1/2×mic浓度时对具核梭杆菌生物膜形成的抑制率较0.12％氯己定、1％碘甘油高；臭氧化油在1/4×mic浓度时对伴放线聚集杆菌生物膜形成的抑制率高于0.12％氯己定、1％碘甘油。结果表明臭氧化油在较低浓度时对上述三种牙周致病菌生物膜的形成均有较好的抑制作用。

4.臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌成熟生物膜的影响。

结果如图3所示，与未处理组做比较：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。mic：最低抑菌浓度；mbc：最低杀菌浓度。

臭氧化油对三种牙周致病菌的成熟生物膜的清除均有效果，且对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌成熟生物膜的清除作用明显强于伴放线聚集杆菌。

通过比较臭氧化油与两种临床常用的辅助抗菌剂(0.12％氯己定、1％碘甘油)对三种牙周病主要致病菌的抗菌效果，探索其在牙周病防治中的潜在应用前景。发明人经过大量实验证明臭氧化油对牙龈卟琳单胞菌、具核梭杆菌、伴放线聚集杆菌及其生物膜的形成与发展起到抑制作用，并探究其对此三种细菌的最小抑菌浓度(mic)、最小杀菌浓度(mbc)、最小抑制生物膜浓度(mbic)及最小根除生物膜浓度(mbec),从而起到防治牙周病的作用，具有潜在的新药开发价值。较低浓度的臭氧化油即可对牙周病主要致病菌起到较强的抑制作用，且其具有天然、经济、环保、副作用小的特点，为其作为治疗牙周病的辅助抗菌剂提供了潜在的应用前景。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。