一种含有布比卡因的药物组合物及其制备方法和用途与流程
本发明涉及一种含有布比卡因或其药学上可接受的盐的药物组合物及其制备方法和用途。
背景技术：
慢性神经病理性疼痛是临床常见疾病，其疼痛的产生病因有物理性的机械损伤、代谢或营养性神经改变、病毒感染、药物或放疗的神经毒性、缺血性神经损害、神经递质功能障碍等。电生理基础是受损伤神经部位的神经细胞膜na离子通道和电压门控ca离子通道的表达增高，并释放一些介质，使神经元的正常生理活动发生改变，导致对非伤害性或微小伤害的外周刺激反应加剧。大量自发放电，不停地向脊髓神经元发放异位冲动，增加脊髓神经元的敏感性和突触与突触之间神经递质的传递，从而引起脊髓水平的兴奋性增高和感觉功能异常。
布比卡因，英文名为bupivacaine，是一种临床常用浸润麻醉药物，用于神经传导阻滞麻醉。常用其盐酸盐，为白色结晶性粉末；无臭、味苦。在乙醇中易溶，在水中溶解，在氯仿中微溶，在乙醚中几乎不溶，其水溶液ph为4.5-6.0，熔点约194℃。低浓度的布比卡因可用于局都浸润麻醉，局部伤口止痛，硬膜外分娩镇痛或术后镇痛，神经阻滞麻醉和硬膜外麻醉及脊麻。布比卡因是长效酰胺类局麻药，其作用机制与其它局麻药相同，通过抑制神经细胞钠离子通道，阻断神经兴奋与传导。对运动神经的阻断与药物浓度有关，浓度为0.125％-0.5％时对感觉神经阻滞较好，但几乎无肌松作用。0.75％则可产生较好的运动神经阻断作用。因其脂溶性高，蛋白结合率高，麻醉强度是普鲁卡因的16倍，作用时效是普鲁卡因的8倍。局部麻醉作用强于利多卡因(约强4倍)。其
虽然布比卡因是一种良好的术后镇痛药，但仍然存在一些难题。布比卡因是一种易溶的药物，其对中枢神经系统同样有抑制和兴奋双相作用，血药浓度过高时出现中毒症状。布比卡因毒性较强，尤其是心脏毒性更应注意，心脏毒性症状出现较早，往往循环虚脱与惊厥同时发生，易引起严重的室性心律失常，一旦发生意外，复苏较困难。因此，成人一次或4小时内用药量不应超过150mg，高浓度应加适量肾上腺素，降低药物吸收。一般情况下布比卡因对呼吸的影响不大，毒性反应发生时才出现改变。布比卡因的作用强度大，毒性也大，ld50、致惊阈量和一次最大用量都小于普鲁卡因和利多卡因，逾量或误入血管内可发生严重毒性反应。布比卡因常用剂量和浓度无神经毒性作用，但由于浓度、作用时间和ph值等因素的影响，不能忽视其神经毒性作用。因此，开发一种布比卡因缓释时间长，且无心脏停搏副作用的处方制剂是目前该药制剂开发的一个难题。
现已开发出的布比卡因纳米颗粒主要使用方式为超声震荡处理后配制成悬浊液，在小鼠背根神经节压迫模型中局部注射，以达到持续缓解疼痛的效果。该方法首先需额外的注射，在实际应用中意味着增加了有创操作，必然带来如血肿、感染等额外的风险。而且该动物模型不适用于常见的手术切口痛，另外，该纳米颗粒悬浊液因以液体形式存在，推测其有向四周扩散的趋势，不能在开放性创伤处稳定停留，故在开放性区域，如切口引起的疼痛方面，纳米颗粒的镇痛效果还有待进一步研究。
此外，由于布比卡因是易溶性药物，pacira制药有限公司开发的布比卡因(bupivacaine)1.3％脂质体注射用悬浮液exparel进入体内，无法控制布比卡因释放的量，会突然释放大量布比卡因，形成一个突释，从而产生心脏毒性。因此如何保证布比卡因平均释放也是亟待解决的问题。
综上所述，现有技术中布比卡因颗粒使用时需要额外注射，带来有创操作的不良反应(血肿、感染等)，在局部无法稳定长存，缺乏在手术切口等开放性区域存在的疼痛方面的效果验证，且无法保证布比卡因平均释放。因此需要开发出一种可与手术同时进行的非有创操作的药物组合物，且能够相较纳米颗粒，在缓解开放区域疼痛方面显示出相当或更优的效果。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术中存在的问题，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有布比卡因或其药学上可接受的盐作为活性成分和一种或多种药学上可接受的载体材料。通过新型纳米静电纺丝制作技术，采用布比卡因纳米纺丝膜，使布比卡因具有一定的疏水特性，实现了在保持镇痛作用的同时，缓慢释放布比卡因的效果，延长其作用时间，减少了额外镇痛的措施。本发明提供的纳米纺丝膜避免了负荷量给药及其他药物形式存在的药物突然大量释放的风险，提高用药安全性，减少患者在服药期间发生心脏疾病的风险，缓解突释，可控缓释。
由于药物作用于人，所以要求载药材料无毒、生物相容性好、可生物降解。载药材料分为两大类：一类是天然材料如脂类、糖类、蛋白质等；另一类是合成的高分子材料，如聚氰基丙烯酸烷酯(paca，包括甲酯、乙酯、丁酯、异酯、己酯及异己酯、十六烷基酯)和聚酯(主要有聚乳酸(pla)、聚丙交酯、聚己内酯(pcl)、聚己醇酯、聚羟丁酸、聚羟戊酸等)及其衍生物与共聚物。
在所述药物组合物中，所述的载体材料为高分子聚合材料，可以为paca、pbca(聚氰基丙烯酸丁酯)、pla、pcl、plga、聚丙交酯、聚己醇酯、聚羟丁酸、聚羟戊酸等，优选paca、pcl、pla、plga和聚丙交酯，更优选pla和plga。这些生物可容性载体材料接触体液后通过缓慢水解从而达到缓慢释放布比卡因的效果。
在所述药物组合物中，主药，即布比卡因或其药学上可接受的盐，包括布比卡因、盐酸布比卡因，及本专利阐述的布比卡因游离碱。与载体材料的重量比可以在较宽的范围内选择，例如1：100～1：1，优选1：10～1：1，更优选1：5～1:1，更优选1：3～1：1，进一步优选1：1.5～1:1。主药按重量计，占所述的药物组合物5％～50％，优选为20％～50％。
此外，使用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(plga)作为载体，解决了释放的问题，使得药物缓慢释放。然而作为一种镇痛药，如果暴露量过高，可能造成严重的不良反应，例如心脏毒性，研究发现布比卡因的不良反应包括严重毒性反应，循环虚脱与惊厥，心脏停止搏动。为防止布比卡因暴露值过高，采用包裹碱滴定过的布比卡因粉末可使得药物在一定程度上缓慢释放，从而保证药物的稳定释放，防止了药物在体内溶出时突然大量崩解，造成药物突释，从而导致药物暴露值过高，给患者造成风险。
市售布比卡因通常为盐酸盐形式，布比卡因的游离碱可以通过以下方法获得。将布比卡因盐酸盐粉末溶于蒸馏水中，逐滴加入1m的naoh溶液，并不停搅拌，直至不再有沉淀形成。将得到的游离羟基布比卡因固体过滤，并用蒸馏水洗涤。在烧杯中，向羟基布比卡因中加入蒸馏水(刚刚盖过沉淀)，并搅拌5小时，或者更长时间，移除额外的naoh。将固体过滤，并在低于80度的真空下晾干。干燥的游离羟基布比卡因是白色松软粉末。
本发明的另一方面提供一种含有布比卡因的药物组合物的制备方法，该制备方法将载体材料和布比卡因共同溶解于溶剂中，采用静电纺丝技术，将混合溶液分散于纳米级别的静电纺丝中，纺丝制备过程蒸发除去溶剂，后期处理成厚度为百微米级别的纳米纺丝膜。
其中，所述纳米纺丝膜是指以纳米级别的静电纺丝作为载体，药物以一定方式分散、结合在纺丝中形成含有药物组合物的纳米纺丝膜；纺丝直径可能超过100nm，但通常应小于500nm，平均为300nm。
其中，所述溶剂选自hfip、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、dmso、dhf中的一种或多种，优选hfip。
具体地，本发明药物组合物为纳米纺丝膜的制备方法如下：
1)将布比卡因(bup)或其药学上可接受的盐和其载体材料溶解于溶剂中，得到混合溶液；
2)将步骤1)所得的混合溶液在容器中磁力搅拌10h，得到混合物；
3)将步骤2)得到的混合物置于注射器中；
4)将注射器固定于推注泵，以约0.05mm/min的速度推注；
5)在针尖和接收器间加上高压电场，压强大小约为1kv/cm，同时接收器以约2000r/min的速度转动；
7)通过高压电场的静电力，将注射器中推注出的混合物拉成纳米级别的纺丝，同时电极另一端的转轴将静电纺丝收集于铝箔上；
8)通过60-80℃的热压工艺将纳米膜压制为厚度百微米的膜；
9)洗涤干燥纳米纺丝膜并密封储存。
本发明的另一方面，进一步提供如上所述的药物组合物在制备麻醉剂中的用途，所述麻醉剂可以为局部麻醉剂或全身麻醉剂，并且所述麻醉剂可以用于术后镇痛以减轻由手术引起的急慢性疼痛。
本发明提供了一种含有布比卡因的药物组合物及其制备方法和用途。其有益效果是：
(1)本发明提供的药物组合物的使用可与手术同时进行，且为无创方式，避免了有创操作带来的血肿、感染等不良反应；
(2)本发明通过新型纳米静电纺丝制作技术，采用纳米纺丝膜为药物载体，使布比卡因具有一定的疏水特性，能随载体基质的降解，在体内缓慢释放，体外释放试验证明，其药物释放可持续至使用后30天；
(3)本发明在缓释的基础上，仍然保留了单次负荷量给药的镇痛效果，其动物实验结果证明，其在手术后早期的镇痛效果与术前注射利多卡因相当；
(4)本发明相较于单次负荷给药，镇痛效果能维持更长时间，其动物实验结果证明，负荷给药无法缓解的术后疼痛时期，布比卡因缓释膜组的的疼痛阈值较之显著提高，证明其具有更强更持久的镇痛效果；
(5)本发明提供的纳米纺丝膜不仅实现缓释的功能，更能通过大小的剪裁实现药物使用量的控制，且其形态的可塑性可适用于绝大多数有创操作后镇痛的需要；
(6)本发明提供的纳米纺丝膜体外释放试验证明其使用的初期，药物释放曲线平稳，避免了药物突然大量释的放，提高用药安全性，减少患者在服药期间发生心脏疾病的风险；
(7)相较于纳米颗粒的粉末或悬浊液的使用状态，本发明因其固态膜形式，贴合稳定，避免随体液扩散而镇痛区域无法保证，更适合非封闭创口的使用。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为对照品盐酸布比卡因的hplc图谱。
图2为本发明布比卡因纳米纺丝膜(配方6)体外释放1-30天的单位毫克释放盐酸布比卡因总量。
图3纳米纺丝膜及纳米颗粒实验大鼠对机械刺激的行为反应比较图；其中，横坐标是术后的时间，纵坐标是大鼠对机械刺激的痛觉感受阈值。
图4为本发明布比卡因、plga、布比卡因纳米纺丝膜(配方6)x光衍射图。
图5为本发明布比卡因纳米纺丝及膜的扫描电子显微镜照片。
图中，1、plgawithbupivacaine；2、plga；3、bupivacaine。
具体实施方式
通过如下实施例可进一步解释本发明，但它们不限定本发明的范围。对于本领域技术人员根据本发明内容所作的类似改进与调整，如采用同性质的辅料和技术或者改变药物外观等，均视为本发明包含的内容。
实验用材料及来源
布比卡因盐酸盐：cas号14252-80-3，分子式c18h28n2o·hcl，分子量324.89，购自华威锐科。
plga：poly(d,l-lactide-co-glycolide)，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，丙交酯:乙交酯(65:35)，摩尔质量40,000-75,000，线性分子式[c3h4o2]x[c2h2o2]y，购自sigma-aldrich。
paca：poly(alkylcyanoacrylate)，聚氰基丙烯酸烷基酯,cas号1431724-30-9，分子式c12h11no3，分子量217.22，购自sigma-aldrich。
聚丙交酯：分子量89,000-98,000，购自sigma-aldrich。
pcl:poly(caprolactone)，聚己内酯，线性分子式(c6h10o2)n，购自sigma-aldrich。
实施例1布比卡因游离碱的制备
将局麻药布比卡因盐酸盐沉淀为羟基布比卡因，并形成一种不溶解形式。将盐酸布比卡因粉末溶于蒸馏水中，浓度为10％。将1m的naoh逐滴加入溶液中，不停搅拌，直到不再有沉淀形成。用新鲜的蒸馏水洗涤过滤后，得固体羟基布比卡因。用水将羟基布比卡因移到干净的烧杯中(刚刚盖过沉淀)，搅拌5小时，或者更长。然后用蒸馏水小心地洗，移除额外的naoh。洗涤后，在低于80度的真空晾干过夜。干燥得羟基布比卡因，为白色松软粉末。
实施例2布比卡因纳米纺丝膜的制备一
配方：
制备方法：
按各配方量称取布比卡因(bup)和plga，并将其完全溶解于2ml的六氟异丙醇(hfip)溶液中。磁力搅拌10h后，将得到的plga/bup溶液收集于10ml注射器中。将注射器固定于推注泵，以一定速度(约0.05mm/min)推注。在注射器针尖和接收器间加高压电场(约1kv/cm)，同时接收器以一定速度(约2000r/min)转动。通过高压电场的静电力，将注射器中推注出的混合溶液拉成纳米级别的纺丝，同时收集于接收器上。通过热压器，于一定温度(60-80℃)，将纳米膜压制为可操作厚度的膜。将洗涤、干燥后的纳米纺丝膜于室温密封储存备用。
实施例3布比卡因纳米纺丝膜的制备二
配方：
制备方法：
按各配方量称取布比卡因(bup)和paca，并将其完全溶解于2ml的六氟异丙醇(hfip)溶液中。磁力搅拌10h后，将得到的paca/bup溶液收集于10ml注射器中。将注射器固定于推注泵，以一定速度(约0.05mm/min)推注。在注射器针尖和接收器间加高压电场(约1kv/cm)，同时接收器以一定速度(约2000r/min)转动。通过高压电场的静电力，将注射器中推注出的混合溶液拉成纳米级别的纺丝，同时收集于接收器上。通过热压器，于一定温度(60-80℃)，将纳米膜压制为可操作厚度的膜。将洗涤、干燥后的纳米纺丝膜于室温密封储存备用。
实施例4布比卡因纳米纺丝膜的制备三
配方：
制备方法：
按各配方量称取布比卡因(bup)和聚丙交酯，并将其完全溶解于2ml的六氟异丙醇(hfip)溶液中。磁力搅拌10h后，将得到的聚丙交酯/bup溶液收集于10ml注射器中。将注射器固定于推注泵，以一定速度(约0.05mm/min)推注。在注射器针尖和接收器间加高压电场(约1kv/cm)，同时接收器以一定速度(约2000r/min)转动。通过高压电场的静电力，将注射器中推注出的混合溶液拉成纳米级别的纺丝，同时收集于接收器上。通过热压器，于一定温度(60-80℃)，将纳米膜压制为可操作厚度的膜。将洗涤、干燥后的纳米纺丝膜于室温密封储存备用。
实施例5布比卡因纳米纺丝膜的制备四
配方：
制备方法：
按各配方量称取布比卡因(bup)和pcl，并将其完全溶解于2ml的六氟异丙醇(hfip)溶液中。磁力搅拌10h后，将得到的pcl/bup溶液收集于10ml注射器中。将注射器固定于推注泵，以一定速度(约0.05mm/min)推注。在注射器针尖和接收器间加高压电场(约1kv/cm)，同时接收器以一定速度(约2000r/min)转动。通过高压电场的静电力，将注射器中推注出的混合溶液拉成纳米级别的纺丝，同时收集于接收器上。通过热压器，于一定温度(60-80℃)，将纳米膜压制为可操作厚度的膜。将洗涤、干燥后的纳米纺丝膜于室温密封储存备用。
试验例1高效液相色谱法测定本发明布比卡因纳米纺丝膜的体外释放情况
取以上配方6制得的布比卡因纳米纺丝膜及对照品(盐酸布比卡因针剂，上海禾丰制药有限公司)进行体外释放情况试验，具体操作过程如下：
仪器：安捷伦高效液相色谱仪1260。
方法：分别称取布比卡因纳米纺丝膜20mg或对照品，加入至1ml的磷酸盐缓冲液中，置于透析袋中，再将透析袋置于装有15ml磷酸盐缓冲液的试管中，于37℃摇床，以60次/分的速度摇动。分别在1-30天中的10个时间点取200μl用于后续实验，并向原溶液中补足200μl。
色谱条件：
色谱柱：aglientzorbaxsb-c185u4.6*250mm；流动相：乙腈，磷酸盐缓冲液(pbs，ph3)(21:79,v/v)；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃。
样品预处理方法：
取上述样品液200μl于尖底试管中，加入乙腈0.2ml，超声混匀1分钟，震荡1分钟，静置后，于低温高速离心机中(4℃)，以13000转/分离心15分钟。将上清液2ml加入进样瓶，进样量为10μl。
检测结果：
通过2.5mg/l、1.25mg/l、0.625mg/l、0.3125mg/l、0.078125mg/l、0.03906mg/l共六种不同浓度的对照品盐酸布比卡因得到标准曲线y＝16.604x+11.677，r2＝0.99955。(图1)通过计算得到本发明布比卡因纳米纺丝膜体外释放情况如下：
第一天8.17012μg/mg
第五天24.51772μg/mg
第十天29.69105μg/mg
第二十天43.99410μg/mg
第三十天79.40637μg/mg
选择布比卡因的吸收波段(210nm)，通过软件拟合此波长处波峰的auc，比较1-30日auc，观察到递增趋势。(图2)
结论：由以上结果可知，本发明制得的布比卡因纳米纺丝膜的体外释放延长，最长可至30日。
试验例2大鼠脚底切开模型检测本发明布比卡因纳米纺丝膜的镇痛效果
实验目的：通过建立大鼠脚底切开模型，在手术造模的同时，将本发明布比卡因纳米纺丝膜(配方6)置于手术切口下，脚底肌肉上，比较实验组和对照组间大鼠的行为学变化。
实验动物：sprague-dawley大鼠雌性(北京维通利华实验动物技术有限公司)，160-180g。
建立大鼠脚底切开模型的方法：
首先用异氟烷麻醉大鼠，沿大鼠脚底中线距离足后跟5cm出竖直做一个1厘米左右的切口，将足底屈肌分离，用手术钳纵向钝性破坏该肌肉，放置1mg质量的纳米纺丝膜于切口下，再将大鼠足底皮肤缝合起来，用碘酒消毒伤口，切口表面涂抹抗生素预防感染。
对大鼠手术后1h、2h、3h、6h、12h、1天、2天、3天、5天的动物行为进行观察，主要是检测大鼠手术侧足术前和术后，以及使用布比卡因纳米纺丝膜和布比卡因纳米颗粒的大鼠的机械刺激痛域的差别。
实验结果：大鼠足底切开及肌肉钝性破坏后，机械刺激阈值降低，有痛觉过敏的行为学表现。而切口下放置了盐酸布比卡因纳米纺丝膜的大鼠，机械刺激阈值显著提高。相较于术前注射利多卡因组，盐酸布比卡因纳米纺丝膜在术后早期机械痛域无显著差异，镇痛效果相当，晚期(第3日)有显著提高，显示出更持久的镇痛效果。(图3)
结论：盐酸布比卡因纳米纺丝膜能有效缓解术后疼痛，作用效果在术后早期和术前负荷量使用利多卡因相当，后期显示出更优的镇痛效果。
试验例3布比卡因、plga、纳米纺丝膜的x光衍射
具体结果见图4。结果表明本发明的布比卡因纳米纺丝膜中plga和盐酸布比卡因未独立形成晶体，很好地融合，具有较高的均一性。
试验例4电子扫描显微镜观察布比卡因纳米纺丝和纳米纺丝膜
剪取边长1mm的热压前及热压后的纳米纺丝膜，固定于导电胶上，用液氮进行干燥脱水，得到样品。将样品通过扫描电子显微镜，进行观察拍照，结果发现纳米纺丝的直径符合纳米级别(100-500nm)，热压后的纳米纺丝膜均质性较好，表面平滑，厚度达到100μm，如图5所示。
综上所述，本发明通过新型纳米静电纺丝制作技术，采用布比卡因纳米纺丝膜，使布比卡因具有一定的疏水特性，解决了盐酸布比卡因的释放过快的问题。本发明提供的纳米纺丝膜能够减少药物突然大量释放，提高用药安全性，减少患者在服药期间发生心脏疾病的风险，缓解突释，可控缓释。
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