成纤维细胞生长因子21在急性肝损伤回肠粘膜损伤中的应用的制作方法

本发明涉及成纤维细胞生长因子21(fgf21)的医药新用途，特别涉及fgf21用于治疗急性肝损伤回肠粘膜损伤的新应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

急性肝损伤是一种临床综合征，表现为突然出现明显的肝细胞损害并迅速恶化，导致肝性脑病和凝血功能障碍，病死率极高。临床上造成急性肝损伤的原因有多种，主要有病毒感染、服药不当、食物添加剂、乙醇摄入过量、误服有毒食物、放射线损伤等。

近年来，随着生活品质的提高，服用中草药进行保健、对野味食物的追求以及随意加大临床用药量的人群逐渐增多，使得急性肝损伤的发病率逐步增加。

机体(人体和动物体)的肠道内含有数量庞大的微生物菌群，肠道菌落也可以看为机体的一个细菌器官，在正常情况下，肠道菌群保持一种动态的平衡状态并且与宿主相互作用，深深影响宿主对抗感染的能力。

然而，在许多疾病中，例如肝病、出血性休克、重度烧伤、骨折以及多器官衰竭，肠道菌群的平衡往往被打破，使得肠道菌群成分发生改变，成为机体感染的源头，产生严重的临床症状。

在各种临床疾病中，特别是肝病中，由于肠-肝轴的存在，通过胆汁分泌和肝脏血流的变化，使得肠道菌群的结构和组成发生变化。研究发现，大肠杆菌可以在不损伤肠道上皮细胞的情况下扩大结肠的渗透性。在急性肝损伤中，机体的细胞免疫和体液免疫功能失调，炎性因子和应激激素大量释放，同时肠道粘膜屏障受损，肠道菌群极易发生细菌异位，加重肝损伤，甚至导致多器官功能障碍或全身炎症反应的发生。

因此，在治疗肝病特别是急性肝损伤中，肠道粘膜修复或肠道菌落的控制对治疗肝病的作用往往不可忽略。

目前临床上治疗急性肝损伤时需要积极控制感染，以防止感染扩散加重病情；并联用其他药物加以治疗和控制。

然而，抗感染药物由于具有不同的抗菌谱，以及细菌耐药性，可能对于某些患者并不适用；并且，抗感染药物仅仅控制菌落的繁殖，但对于修复肠道粘膜损伤并无作用，对肝损伤也并无治疗作用。

成纤维细胞生长因子21(fgf21)是一种特异性作用于肝脏、胰岛和脂肪组织的新型代谢调控因子。fgf21具有降低机体血糖血脂、改善胰岛素抵抗、保护胰岛β细胞等多种糖脂代谢调控的功能。

fgf21也是一种内源性调控因子，可以和细胞表面的生长因子受体结合，激活酪氨酸激酶，从而导致下游信号活化，启动一系列功能变化。

fgf21是目前的研究热点，有多种作用还待开发；而研究和开发fgf21新的临床作用是科研人员永远的追求。

针对上述技术问题，本发明人在现有技术的基础上进行改进，研究出了一种成纤维细胞生长因子21在制备治疗急性肝损伤回肠粘膜损伤药物中的新用途。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：fgf21治疗急性肝损伤下的肠粘膜损伤时，不仅修复损伤的肠粘膜，减少肠道中微生物菌群对肝损伤的进一步加重，起到了控制急性肝损伤加重的作用；另外，由于fgf21对肝损伤中的肝脏细胞具有治疗作用，还可以修复肝损伤。使用fgf21可以对急性肝损伤下的肠粘膜损伤和肝损伤同时起到治疗作用，从而完成了本发明。

本发明的目的在于提供以下方面：

本发明提供了一种治疗急性肝损伤的药物组合物，所述组合物包含有成纤维细胞生长因子21。

所述急性肝损伤时伴有肠粘膜损伤，优选急性肝损伤时伴有回肠粘膜损伤。

所述成纤维细胞生长因子21单独使用，或作为活性成分与其他辅料共同使用。

所述成纤维细胞生长因子21以溶于或分散于溶剂的溶液形式使用；

所述药物组合物为粉针剂或注射溶液剂；

成纤维细胞生长因子21的剂量为0-0.5mg/kg，优选为0.01-0.35mg/ml，更优选为0.01-0.3mg/ml。

成纤维细胞生长因子21作为活性成分与辅料溶解/混悬于溶剂中；

所述辅料优选渗透压调节剂、ph调节剂、冻干保护剂、络合剂和抗氧化剂中的一种或多种；

成纤维细胞生长因子21与辅料的用量为0.1％-30％，优选为0.1％-25％，更优选为0.1％-20％，以重量计。

本发明提供了一种成纤维细胞生长因子21(fgf21)或药物组合物在制备治疗急性肝损伤药物中的用途；

其中，成纤维细胞生长因子21在治疗急性肝损伤时提高肝脏中sirt1的表达；

进一步地，成纤维细胞生长因子21在制备治疗急性肝损伤下肠粘膜损伤药物中的用途；

特别是成纤维细胞生长因子21在制备治疗急性肝损伤回肠粘膜损伤药物中的用途。

根据本发明提供的成纤维细胞生长因子21，具有以下有益效果：

成纤维细胞生长因子21或药物组合物可以用于治疗急性肝损伤；

(2)成纤维细胞生长因子21或药物组合物可以用于治疗急性肝损伤时的回肠粘膜损伤；

(3)成纤维细胞生长因子21或药物组合物没有促进细胞增殖的能力，也不会拮抗fgf家族的其他成员的功能，使用安全性非常高。

附图说明

图1示出实验例1中小鼠肝脏的苏木精-伊红染色图：a为空白控制组；b为模型组；c为fgf21低剂量组；d为fgf21中剂量组；e为fgf21高剂量组；f为甘草酸二铵阳性对照组；

图2示出实验例2中小鼠回肠粘膜的苏木精-伊红染色图：a为空白控制组；b为模型组；c为fgf21低剂量组；d为fgf21中剂量组；e为fgf21高剂量组；f为甘草酸二铵阳性对照组；

图3示出实验例3中小鼠回肠粘膜的透射电镜图：a为空白控制组；b为模型组；c为fgf21低剂量组；d为fgf21中剂量组；e为fgf21高剂量组；f为甘草酸二铵阳性对照组；

图4中a示出实验例4中小鼠血清中fgf21含量的变化；b中示出实验例4中western-blot方法测定的fgf21和自噬因子的变化；

图5中示出实验例5中western-blot方法测定的小鼠肝脏的sirt1和fgf21的表达结果图。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。

在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

以下详述本发明。

fgf21是一种内分泌型成纤维细胞生长因子，具有抗氧化应激、抗炎、改善能量代谢、抑制心肌凋亡等心血管保护作用。

本发明中，通过对fgf21的体内体外研究发现，fgf21对于肝损伤特别是急性肝损伤中肝细胞具有治疗作用，降低肝细胞中炎细胞浸润，减少肝细胞空泡变性和/或坏死；

当使用fgf21治疗急性肝损伤时，可以提高肝脏中sirt1(沉默信息调节因子1)的表达，并且，sirt1的表达随fgf21剂量的增加而增大。

sirt1(沉默信息调节蛋白1)属于(烟碱腺嘌呤二核苷酸)依赖性的ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，是一种多重功能蛋白质，研究表明sirt1可以使nf-κb(rela/p65)的310位上的赖氨酸残基脱乙酰化从而抑制nf-κb的转录活性，减少其下游基因的表达促进细胞的凋亡，其中，nf-κb是一种转录因子，在编码细胞因子和与炎症、细胞增殖、凋亡、血管生成和转移等相关蛋白质的基因表达中起着关键的调节作用。研究表明，nf-κb信号通路是炎性反应与急性肝损伤联系的重要通路之一，它的激活可导致下游炎症因子的释放，诱导产生白细胞介素-1(il-1)、il-6及肿瘤坏死因子-α(tnf-α)，这使得炎症因子大面积浸润，从而诱发急性肝损伤甚至肝癌的发展。

p53是参与细胞周期调控的抑癌基因，在众多细胞周期调控因子中，决定细胞分化、生长停滞和细胞凋亡。研究发现，在ccl4、脂多糖(lps)联合d-氨基半乳糖(d-galn)等诱导的肝损伤模型中，模型组p53表达都有显著提高，而给予相应药物治疗后，可显著降低p53表达水平，这说明，在肝脏损伤以及治疗的过程中，p53的表达水平发挥着关键的生物学作用，sirt1可以使p53脱乙酰化从而抑制p53的活性而抗凋亡从而发挥对急性肝损伤的治疗作用。

fgf21还可以治疗急性肝损伤下的肠粘膜损伤，修复肠粘膜损伤，减轻损伤程度；特别的，fgf21可以治疗急性肝损伤下的回肠粘膜损伤，使回肠粘膜绒毛疏松膨大，细胞间连接基本正常。

fgf21治疗急性肝损伤下的肠粘膜损伤时，不仅修复损伤的肠粘膜，减少肠道中微生物菌群对肝损伤的进一步加重，起到了控制急性肝损伤加重的作用；另外，由于fgf21对肝损伤中的肝脏细胞具有治疗作用，还可以修复肝损伤。由于肠-肝轴的存在，肝功能改善后，通过胆汁分泌和肝脏血流的变化，使得肠道菌群的结构和组成进一步改善和平衡，减少对肠道粘膜的刺激；而改善的肠粘膜和肠道微生物组成也会降低对肝损伤的影响。使用fgf21可以对急性肝损伤下的肠粘膜损伤和肝损伤同时起到治疗作用。

因此，本发明提供了一种治疗急性肝损伤的药物组合物，所述组合物包含有成纤维细胞生长因子21。

所述急性肝损伤时伴有肠粘膜损伤，优选急性肝损伤时伴有回肠粘膜损伤。

所述成纤维细胞生长因子21单独使用，或作为活性成分与其他辅料共同使用。

在一种优选的实施方式中，所述成纤维细胞生长因子21以溶于或分散于溶剂的溶液形式使用，所述溶剂为水。

较好地，所述药物组合物中成纤维细胞生长因子21作为活性成分与辅料溶解/混悬于溶剂中，所述辅料优选为渗透压调节剂、ph调节剂、冻干保护剂、络合剂和抗氧化剂中的一种或多种；所述药物组合物中可以是按照常规方法制得的粉针或溶液剂。

所述药物组合物优选注射使用，包括肌肉注射、静脉注射和皮下注射中的任意。所述药物组合物还可以制成缓释制剂进行皮下埋留，持久缓慢释放fgf21。

在药物组合物中，所述冻干保护剂包括甘露醇和谷胱甘肽中的任意；所述渗透压调节剂为氯化钠或葡萄糖；所述ph调节剂包括氢氧化钠、氯化钠、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、醋酸钠中的一种或多种；所述络合剂为乙二胺四乙酸钠；所述抗氧化剂为维生素c、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠中的任意。

成纤维细胞生长因子21与辅料的用量为0.1％-30％，优选为0.1％-25％，更优选为0.1％-20％，以重量计。

所述药物组合物治疗的肝损伤疾病中，可以是酒精、药物或有害物质诱导的急性肝损伤，特别包括四氯化碳诱导的急性肝损伤。

在使用fgf21治疗四氯化碳诱导的小鼠极性肝损伤回肠粘膜损伤时，优选使用0.5mg/kg或1.0mg/kg的剂量进行治疗。

在使用fgf21或含有fgf21的药物组合物治疗人类急性肝损伤时，可以根据本领域公知的方法从实验动物的剂量推导出成人的剂量。

较好地，成纤维细胞生长因子21的剂量为0-0.5mg/kg，优选为0.01-0.35mg/ml，更优选为0.01-0.3mg/ml。

利用所述fgf21治疗急性肝损伤肠粘膜损伤时，fgf21没有促进细胞增殖的能力，也不会拮抗fgf家族的其他成员的功能，使用安全性非常高。

因此，本发明提供了一种fgf21或上述药物组合物在制备治疗急性肝损伤药物中的应用；特别是在制备治疗急性肝损伤下肠粘膜损伤药物中的应用。

所述成纤维细胞生长因子21或药物组合物在治疗急性肝损伤时可以提高肝脏中sirt1的表达；因而本发明还提供了成纤维细胞生长因子21或药物组合物在制备治疗急性肝损伤回肠粘膜损伤药物中的用途。

实施例

实施例1

建立模型小鼠：

取体重为20-25g的健康小鼠，使用四氯化碳(ccl4)诱导小鼠产生急性肝损伤(ali)。

研究方法：

取ali模型小鼠30只，分为5组，每组6只。其中，

模型组(ali组)，为模型小鼠，不进行给药治疗；

实验组设置有3组，分别腹腔注射给药给予低剂量fgf21(0.25mg/kg)、中剂量fgf21(0.5mg/kg)、高剂量fgf21(1mg/kg)；

阳性对照组，以55mg/kg的剂量经灌胃给药给予甘草酸二铵(dg)；

空白对照组(control组)，为正常小鼠，腹腔注射等量生理盐水。

治疗3天。

实验例

实验例1

fgf21缓解急性肝损伤小鼠的肝脏损伤(fgf21：浙江格鲁斯特生物科技有限公司，规格：1mg/ml)

将实施例1中的小鼠，处死，取肝脏组织，进行h&e(苏木精-伊红染色法)染色。

结果如图1所示，图中箭头指向空泡，三角形标记炎细胞浸润。由h&e染色观察可知：

空白对照组(control组)中，肝组织结构正常，肝板排列规则；

模型组(ali组)中，肝组织中央静脉周围有炎细胞浸润，以中性粒细胞为主，大量肝细胞空泡变性或坏死；

低剂量fgf21组(0.25mg/kg)中，肝组织可见水肿和部分坏死发生，但肝损伤程度明显较模型组减轻；同时还可以发现，低剂量fgf21组、中剂量fgf21组(0.5mg/kg)、高剂量fgf21组(1mg/kg)中的肝损伤程度逐步减轻，高剂量fgf21组效果最好，很少有肝细胞空泡变性或坏死，少见炎细胞浸润。

阳性对照组(ali+dg)中，与ali组相比，甘草酸二铵组中的肝脏组织损伤程度明显减轻，其治疗效果与1mg/kg剂量的fgf21疗效相当。

可见，在ccl4诱导的急性肝损伤小鼠中，fgf21能够缓解肝脏损伤，且具有一定的剂量依赖性。

实验例2

fgf21修复急性肝损伤小鼠的回肠粘膜损伤

取实施例1中的小鼠，处死，取回肠粘膜组织，进行h&e(苏木精-伊红染色法)染色。

结果如图2所示，图中箭头示小肠糜烂，圆圈示粘膜上皮水肿。由h&e染色观察结果可知：

空白对照组(control组)中，即a中，肠绒毛呈指状，上皮中可见杯状细胞，小肠腺中可见潘氏细胞，小肠结构正常，未见病变；

模型组(ali组)中，即b中，粘膜水肿变性，部分粘膜上皮扁平，小肠绒毛局部糜烂，病灶处可见炎细胞浸润和纤维增生；

阳性对照组(ali+dg)中，即f中，回肠上皮绒毛正常，未见明显病变；

低剂量fgf21组(c图)、中剂量fgf21组(d图)、高剂量fgf21组(e图)中回肠粘膜损伤程度逐步减轻，其中，fgf21中剂量组和低剂量组部分样本可见粘膜上皮轻度水肿，但较ali组，损伤程度明显减轻，高剂量组回肠上皮绒毛正常，未见明显病变，治疗效果与阳性对照组相当。

可见，在ccl4诱导的急性肝损伤小鼠中，fgf21可以修复急性肝损伤小鼠的回肠粘膜损伤；且治疗效果具有一定的剂量依赖性。

实验例3

fgf21修复急性肝损伤小鼠的回肠粘膜损伤

取实施例1中的小鼠，处死，取回肠粘膜组织，进行透射电镜观察。结果如图3所示，图中a处示正常绒毛；b处示正常细胞连接；c处示绒毛稀疏、脱落、膨大等；d处示细胞连接粗大不清。

由图3可知：

空白对照组(control组)中，见a图，在回肠内侧可见上皮细胞表面覆盖微绒毛，绒毛结构和排列正常，细胞间连接清晰，未见病变；

ali组中，见b图，回肠上皮细胞绒毛大范围降解，绒毛稀疏且长短不一，细胞界限不清，可见部分细胞连接粗大深染，细胞核固缩甚至崩解；

阳性对照组(ali+dg组)中，见f图，回肠上皮基本正常，偶见小范围绒毛疏松膨大，细胞间连接基本正常；

低剂量fgf21组中，回肠上皮细胞绒毛相较ali组中有所好转；低剂量fgf21组(c图)、中剂量fgf21组(d图)、高剂量fgf21组(e图)中回肠粘膜损伤程度逐步减轻，其中高剂量组回肠上皮基本正常，偶见小范围绒毛疏松膨大，细胞间连接基本正常，治疗效果与阳性对照组基本相当。

可见，在ccl4诱导的急性肝损伤小鼠中，fgf21可以修复急性肝损伤小鼠的回肠粘膜损伤。

实验例4

fgf21修复急性肝损伤小鼠回肠粘膜损伤与自噬相关

取实施例1中利用ccl4诱导的ali模型小鼠为实验组，正常健康小鼠作为对照组。在ali模型小鼠建模成功后，分别于6h、12h、24h处死小鼠，取血和肝脏组织，检测血清中fgf21的水平；并使用western-blot方法检测肝脏组织中自噬因子(lc3ⅰ和lc3ⅱ)变化情况。

结果如图4所示，图4中a为b的检测统计结果图，其纵坐标为fgf21在ali小鼠血清中的浓度；其中，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

由图4中b可知，与对照组相比，ccl4诱导的ali小鼠血清和肝脏组织中fgf21、自噬因子lc3ⅱ表达均升高，且在所选时间点6h时表达水平最高，此后，随着损伤时间延长，其表达水平恢复至正常水平左右，这说明，在ccl4诱导的ali小鼠模型中，fgf21和自噬表达均被激活，且可能在肝损伤过程中发挥着重要的保护作用。

实验例5

fgf21增强ccl4诱导的ali小鼠肝脏中sirt1的表达

取实施例1中的空白对照组和实验组，治疗结束后处死小鼠，western-blot方法进行检测，结果如图5所示。

由图5中可知，肝脏中sirt1(沉默信息调节因子1)的表达随fgf21剂量的增加而增大。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。