本发明涉及生物活性物质制备与应用技术领域，具体涉及一种神经酰胺促进剂的制备方法及应用。
背景技术：
神经酰胺在生物体整体中是微量存在的脂质，但在皮肤最外侧的层角质层中占脂质的一半以上，在皮肤的保湿机构、屏障机构中发挥着重要作用。此外，近年来通过促进神经酰胺产生而诱导细胞凋亡、分化诱导、增殖抑制现象也有报道，对炎症性疾病、恶性肿瘤等原因引起的细胞增殖分化疾病的治疗效果还有待于进一步研究。还有研究报道神经酰胺具有骨吸收抑制作用、骨强化作用、牙槽减少抑制作用，对骨质疏松、骨折、腰痛、风湿病等骨关节疾病具有预防和改善作用。
虽然皮肤具有产生神经酰胺的能力，但是产能有限，想要达到良好的皮肤保湿屏障效果，还需要引入神经酰胺类似物或神经酰胺促进剂。其中，已知葡萄糖神经酰胺、半乳糖神经酰胺等神经鞘脂类成分具有促进角质层保持水分、改善皮肤粗糙度的能力。申请号200780040739.3的专利公开了葡萄树液作为有效成分合成神经酰胺促进剂并将该促进剂应用到化妆品与皮肤外用剂。申请号200910118747.6的专利提供了以益母草、山药的植物或提取物作为有效成分的神经酰胺产生促进剂、保湿剂。申请号200910118746.1的专利公开了选自白芷、地黄、白术、甘草、大黄、白及、何首乌和桔梗的植物或其提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂。
上述公开的神经酰胺促进剂或其制备方法存在以下问题：1、神经酰胺类物质大多为水不溶性物质，而现有技术选用中药水提取成分或石油醚提取成分，极性过大或过小，不容易透皮吸收产生促进作用；2、制备过程均采用简单的低温提取、过滤、浓缩，没有公开中草药的前处理、干燥、粉碎过程，工艺虽然简单，但是有效成分提取效率低，增加了原料成本。
技术实现要素：
为了克服上述的技术问题，本发明的目的在于提供一种神经酰胺促进剂的制备方法及应用，筛选菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶作为原料，月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油作为辅料，科学合理地设计出原料选取与预处理、短时热处理、冷冻干燥、粉碎、提取浓缩、滤渣再提取、辅料添加的工艺路线，该神经酰胺促进剂的透皮吸收性好，原料中有效成分提取率高，减少了原料成本，经实验证明具有良好的促进神经酰胺产生的功效，而且能够显著改善脸部皱纹，增强脸部的保湿补水和屏障功能。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种神经酰胺促进剂的制备方法，包括以下步骤：
1)原料选取与预处理：按照重量份计，称取菠萝叶80-120份、白芍12-18份、益母草20-28份、乌龙茶5-11份；其中，菠萝叶选自生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，预处理后静置沥干水分；白芍、益母草、乌龙茶抢水洗净，烘干备用；
本发明在选取神经酰胺促进剂的原料时，《中国中药杂志》第32卷第5期名称为“菠萝叶中新的酰胺类成分”的文章公开了一种研究菠萝叶中化学成分的方法，确定结构为1-o-β-d-葡萄糖-n-正二十二碳酰基-正十六碳-4,10(e，e)-二烯鞘氨醇苷，说明菠萝叶中含有神经酰胺类似物，可能对神经酰胺的产生具有促进作用。现代研究表明，菠萝叶具有消食和胃、止泻等功效，可用于消化不良、胃脘胀痛、夏日暑泻等，还具有调血脂、降血糖、保护心脏、抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种药理作用。
白芍为为毛茛科植物芍药的干燥根，夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾及细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干即可。【性味】苦，酸，微寒。【归经】肝，脾经。【功能主治】养血和营；缓急止痛；敛阴平肝。主月经不调；经行腹痛；崩漏；自汗；盗汗；胁肋脘腹疼痛；四肢挛痛；头痛；眩晕。临床已经证实的药理作用有中枢抑制作用、解痉作用、抗炎抗溃疡作用、对心血管系统的加强作用、抗菌作用、保肝解毒作用等。
益母草为唇形科植物益母草的全草。夏季生长茂盛而花未全开时，割取地上部分，晒干。【性味】苦，辛，微寒。【归经】肝、心包经。【功能主治】活血调经，利尿消肿。用于月经不调，痛经，经闭，恶露不尽，水肿尿少；急性肾炎水肿。益母草中含有益母草碱、水苏碱、益母草定、益母草宁等多种生物碱、苯甲酸、多量氯化钾、月桂酸、亚麻酸、油酸、甾醇、维生素a、芸香甙等黄酮类，又含精氨酸、4-胍基-1-丁醇、4-胍基-丁酸、水苏糖。益母草水溶性成分无论对离体、在位及整体不麻醉动物的子宫皆有兴奋作用，但其真正有效生物碱尚待确定。
乌龙茶亦称青茶、半发酵茶及全发酵茶，品种较多，是中国几大茶类中，独具鲜明中国特色的茶叶品类。乌龙茶是经过采摘、萎凋、摇青、炒青、揉捻、烘焙等工序后制出的品质优异的茶类。乌龙茶中含有机化学成分达四百五十多种，无机矿物元素达四十多种。有机化学成分主要有：茶多酚类、植物碱、蛋白质、氨基酸、维生素、果胶素、有机酸、脂多糖、糖类、酶类、色素等。除了与一般茶叶具有提神益思，消除疲劳、生津利尿、解热防暑、杀菌消炎、祛寒解酒、解毒防病、消食去腻、减肥健美等保健功能外，还突出表现在防癌症、降血脂、抗衰老等特殊功效。
2)短时热处理：将预处理后的菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入蒸汽回转干燥机中，通入60±5℃的热蒸汽处理3-5min，自然冷却至室温；
短时热处理过程中，60±5℃的热蒸汽处理不会使原料过分热涨致孔，热敏性物质、蛋白质、维生素也不至于受热变性，降低了残余水份含量，冷却至室温后活性成分不会失活。
3)冷冻干燥、粉碎：菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入真空冷冻干燥机中，在-10℃～-5℃冷冻干燥1-2h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，超微粉碎得到粒径8-12μm的混合细粉；
冷冻干燥过程中，可以将原料冻结成固体，然后在真空条件下使水蒸气升华出来，热敏性物质、蛋白质、维生素等活性物质会剩留在冻结的冰架子中，干燥后体积差异小，呈现疏松多孔的结构，而且低温下氧气极少，容易被氧气氧化的酚类物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质不会被氧化失活，最大限度地保留了活性物质。粉碎过程中，可以保留不耐高温的黄酮类、苷类、糖类、挥发油等生物活性成分，对中药材的细胞充分粉碎破壁，促进活性成分的释放和溶出，增大比表面积，提高了生物利用度。
4)提取浓缩：混合细粉加入到多功能提取罐内，加入8倍量75％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min，合并提取液；提取液真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去3/4乙醇，过滤得到滤液和滤渣；
提取浓缩过程中，先使用大剂量低浓度的乙醇进行提取，再使用小剂量高浓度的乙醇进行提取。一方面，小粒径的叶皮混合细粉已经在超微粉碎过程充分破壁，有效成分已经基本释放，无需大量的高浓度乙醇进行醇提；另一方面，低浓度乙醇与细粉的接触面积大，醇溶性成分提取率高，再使用高浓度乙醇，补充已蒸发掉的乙醇，增加乙醇浓度，提取出醇溶性较差的活性物质，两步提取液浓缩后，可以得到活性物质含量高的混合成分。减压浓缩除去3/4乙醇、过滤后，使得剩余乙醇溶解了大部分醇溶性有效成分。
5)滤渣再提取：将步骤4)的滤渣加入10倍量的水，搅拌均匀，依次使用6倍量石油醚进行一次萃取，4倍量乙酸乙酯进行二次萃取，4倍量乙醇进行三次萃取；收集二次萃取和三次萃取的油相，减压浓缩，0.5μm纳滤膜过滤，得到棕黄色油状物；
滤渣再提取过程中，一次萃取采用小极性石油醚，可以去除滤渣中的小极性杂质，乙酸乙酯与乙醇极性接近且溶解性好，可以萃取出滤渣中残留的醇溶性有效成分，进一步增加了提取效率和原料的利用率。
6)辅料添加：将步骤4)的滤液、步骤5)的棕黄色油状物混合，浓缩除去乙醇得到混合物a，将混合物a与适量的月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油混合均匀即可。
本发明在辅料添加步骤中，月桂氮酮能够改变皮肤色质层脂质与蛋白结构，促进药物的透皮吸收，对亲水性和疏水性的化合物都能够增强透皮作用；薄荷醇又称薄荷脑，属于环己烷单萜衍生物，研究发现含有薄荷醇的复合促透剂可显著提高促透作用；荜澄茄系樟科木姜子属植物山鸡椒的干燥成熟果实，又名山苍子，其挥发油含量高，与月桂氮酮可以发挥协同促透作用。本发明对促透剂的种类和用量进行了大量的筛选和实验，发现当月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油的剂量分别为混合物a质量的3-5％、4-6％、6-8％时，可以发挥良好的混合促透效果。
作为本发明进一步的方案，所述步骤1)菠萝叶预处理具体为：剪切成1-3cm长条状，使用6-8wt％的碳酸钠溶液浸润20-30min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中超声处理5-8min。
菠萝叶预处理过程中，剪切成长条状增加了菠萝叶的比表面积，在碳酸钠溶液的浸润过程中，增加了与溶液的接触面积，同时利于去除表面的灰尘和农药，使菠萝叶内粘附的胶状物质菠萝朊酶在碱性条件下水解，利于后续工序中活性物质的释放。超声波清洗可以通过超声波空化作用现象使菠萝叶表面残留的碳酸钠溶液扩散溶解于水中，使易变性物质菠萝有机酸溶解于水中，利于后续工序中活性物质的提取分离。
作为本发明进一步的方案，所述步骤3)超微粉碎使用气流粉碎机，研磨气量为6-10m3/min，空气压力为0.7-1.0mpa，分级功率为5.5kw。
作为本发明进一步的方案，所述步骤4)减压浓缩时真空度为-0.08～-0.05mpa，温度为45-52℃，蒸汽压力为0.08-0.12mpa。
作为本发明进一步的方案，所述步骤5)一次萃取时进行1-2min的离心分离，二次萃取时进行40-60s的离心分离，三次萃取时进行20-30s的离心分离。
作为本发明进一步的方案，所述步骤6)月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油的剂量分别为混合物a质量的3-5％、4-6％、6-8％。
本发明还提供了上述神经酰胺促进剂在改善脸部皱纹上的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明的神经酰胺促进剂的制备方法，选择菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶作为原料，月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油作为辅料，科学合理地设计出原料选取与预处理、短时热处理、冷冻干燥、粉碎、提取浓缩、滤渣再提取、辅料添加的工艺路线，该神经酰胺促进剂的透皮吸收性好，原料中有效成分提取率高，减少了原料成本，经实验证明具有良好的促进神经酰胺产生的功效，而且与护肤品、化妆品小剂量混合后便能够显著改善脸部皱纹，增强脸部的保湿补水和屏障功能。
2、短时热处理过程中，60±5℃的热蒸汽处理不会使原料过分热涨致孔，热敏性物质、蛋白质、维生素也不至于受热变性，降低了残余水份含量，冷却至室温后活性成分不会失活；冷冻干燥过程中，可以将原料冻结成固体，然后在真空条件下使水蒸气升华出来，热敏性物质、蛋白质、维生素等活性物质会剩留在冻结的冰架子中，干燥后体积差异小，呈现疏松多孔的结构，而且低温下氧气极少，容易被氧气氧化的酚类物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质不会被氧化失活，最大限度地保留了活性物质。粉碎过程中，可以保留不耐高温的黄酮类、苷类、糖类、挥发油等生物活性成分，对中药材的细胞充分粉碎破壁，促进活性成分的释放和溶出，增大比表面积，提高了生物利用度。
3、提取浓缩过程中，先使用大剂量低浓度的乙醇进行提取，再使用小剂量高浓度的乙醇进行提取；一方面，小粒径的叶皮混合细粉已经在超微粉碎过程充分破壁，有效成分已经基本释放，无需大量的高浓度乙醇进行醇提；另一方面，低浓度乙醇与细粉的接触面积大，醇溶性成分提取率高，再使用高浓度乙醇，补充已蒸发掉的乙醇，增加乙醇浓度，提取出醇溶性较差的活性物质，两步提取液浓缩后，可以得到活性物质含量高的混合成分。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种神经酰胺促进剂的制备方法，包括以下步骤：
1)原料选取与预处理：按照重量份计，称取菠萝叶106份、白芍16份、益母草23份、乌龙茶8份；其中，菠萝叶选自生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，预处理后静置沥干水分；白芍、益母草、乌龙茶抢水洗净，烘干备用；其中，菠萝叶预处理具体为：剪切成1-3cm长条状，使用6wt％的碳酸钠溶液浸润25min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中超声处理7min。
2)短时热处理：将预处理后的菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入蒸汽回转干燥机中，通入62℃的热蒸汽处理4min，自然冷却至室温；
3)冷冻干燥、粉碎：菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入真空冷冻干燥机中，在-8℃冷冻干燥1.8h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，超微粉碎得到粒径8-12μm的混合细粉；其中，超微粉碎使用气流粉碎机，研磨气量为6-10m3/min，空气压力为0.7-1.0mpa，分级功率为5.5kw。
4)提取浓缩：混合细粉加入到多功能提取罐内，加入8倍量75％乙醇，回流提取1.6h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取50min，合并提取液；提取液真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去3/4乙醇，过滤得到滤液和滤渣；其中，减压浓缩时真空度为-0.08～-0.05mpa，温度为45-52℃，蒸汽压力为0.08-0.12mpa。
5)滤渣再提取：将步骤4)的滤渣加入10倍量的水，搅拌均匀，依次使用6倍量石油醚进行一次萃取，4倍量乙酸乙酯进行二次萃取，4倍量乙醇进行三次萃取；收集二次萃取和三次萃取的油相，减压浓缩，0.5μm纳滤膜过滤，得到棕黄色油状物；其中，一次萃取时进行1.6min的离心分离，二次萃取时进行55s的离心分离，三次萃取时进行28s的离心分离。
6)辅料添加：将步骤4)的滤液、步骤5)的棕黄色油状物混合，浓缩除去乙醇得到混合物a，将混合物a与适量的月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油混合均匀即可。其中，月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油的剂量分别为混合物a质量的3％、5％、7％。
实施例2
一种神经酰胺促进剂的制备方法，包括以下步骤：
1)原料选取与预处理：按照重量份计，称取菠萝叶96份、白芍15份、益母草26份、乌龙茶9份；其中，菠萝叶选自生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，预处理后静置沥干水分；白芍、益母草、乌龙茶抢水洗净，烘干备用；其中，菠萝叶预处理具体为：剪切成1-3cm长条状，使用8wt％的碳酸钠溶液浸润22min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中超声处理6min。
2)短时热处理：将预处理后的菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入蒸汽回转干燥机中，通入60±5℃的热蒸汽处理3-5min，自然冷却至室温；
3)冷冻干燥、粉碎：菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入真空冷冻干燥机中，在-10℃～-5℃冷冻干燥1-2h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，超微粉碎得到粒径8-12μm的混合细粉；其中，超微粉碎使用气流粉碎机，研磨气量为6-10m3/min，空气压力为0.7-1.0mpa，分级功率为5.5kw。
4)提取浓缩：混合细粉加入到多功能提取罐内，加入8倍量75％乙醇，回流提取1.8h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取52min，合并提取液；提取液真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去3/4乙醇，过滤得到滤液和滤渣；其中，减压浓缩时真空度为-0.08～-0.05mpa，温度为45-52℃，蒸汽压力为0.08-0.12mpa。
5)滤渣再提取：将步骤4)的滤渣加入10倍量的水，搅拌均匀，依次使用6倍量石油醚进行一次萃取，4倍量乙酸乙酯进行二次萃取，4倍量乙醇进行三次萃取；收集二次萃取和三次萃取的油相，减压浓缩，0.5μm纳滤膜过滤，得到棕黄色油状物；其中，一次萃取时进行1.5min的离心分离，二次萃取时进行48s的离心分离，三次萃取时进行26s的离心分离。
6)辅料添加：将步骤4)的滤液、步骤5)的棕黄色油状物混合，浓缩除去乙醇得到混合物a，将混合物a与适量的月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油混合均匀即可。其中，月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油的剂量分别为混合物a质量的3-5％、4-6％、6-8％。
实施例3
一种神经酰胺促进剂的制备方法，包括以下步骤：
1)原料选取与预处理：按照重量份计，称取菠萝叶115份、白芍18份、益母草27份、乌龙茶10份；其中，菠萝叶选自生长一年两个月以上、未成熟的菠萝，预处理后静置沥干水分；白芍、益母草、乌龙茶抢水洗净，烘干备用；其中，菠萝叶预处理具体为：剪切成1-3cm长条状，使用6wt％的碳酸钠溶液浸润30min，取出后放入盛装有纯化水的超声波清洗器中超声处理8min。
2)短时热处理：将预处理后的菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入蒸汽回转干燥机中，通入65℃的热蒸汽处理3min，自然冷却至室温；
3)冷冻干燥、粉碎：菠萝叶、白芍、益母草、乌龙茶送入真空冷冻干燥机中，在-10℃～-5℃冷冻干燥1-2h；投入粉碎机预粉碎成颗粒状，过20-40目筛，去除细小粉末，超微粉碎得到粒径8-12μm的混合细粉；其中，超微粉碎使用气流粉碎机，研磨气量为6-10m3/min，空气压力为0.7-1.0mpa，分级功率为5.5kw。
4)提取浓缩：混合细粉加入到多功能提取罐内，加入8倍量75％乙醇，回流提取1-2h，再加入4倍量85％乙醇，回流提取40-60min，合并提取液；提取液真空吸入单效外循环浓缩罐内，减压浓缩除去3/4乙醇，过滤得到滤液和滤渣；其中，减压浓缩时真空度为-0.08～-0.05mpa，温度为45-52℃，蒸汽压力为0.08-0.12mpa。
5)滤渣再提取：将步骤4)的滤渣加入10倍量的水，搅拌均匀，依次使用6倍量石油醚进行一次萃取，4倍量乙酸乙酯进行二次萃取，4倍量乙醇进行三次萃取；收集二次萃取和三次萃取的油相，减压浓缩，0.5μm纳滤膜过滤，得到棕黄色油状物；其中，一次萃取时进行1-2min的离心分离，二次萃取时进行40-60s的离心分离，三次萃取时进行20-30s的离心分离。
6)辅料添加：将步骤4)的滤液、步骤5)的棕黄色油状物混合，浓缩除去乙醇得到混合物a，将混合物a与适量的月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油混合均匀即可。其中，月桂氮酮、薄荷醇、荜澄茄油的剂量分别为混合物a质量的3-5％、4-6％、6-8％。
对比例1
与实施例1的区别在于，步骤3)冷冻干燥替换为使用干燥箱于45-50℃干燥至含水量小于5％。
对比例2
与实施例1的区别在于，取消步骤5)滤渣再提取。
对比例3
与实施例1的区别在于，步骤6)未添加月桂氮酮。
神经酰胺促进实验
1、培养条件：在epilife-kg2(kurabo公司)6孔板上播种正常人表皮角化细胞(nhek(f))，培养到成为聚集(confluent)状态。此后变换为epilife-kg2(无增殖添加因子)，分别添加上述实施例1-3、对比例1-3制备的神经酰胺促进剂2微克，对照组采用10％乙醇，培养3日后，从每个孔回收细胞。
2、脂质提取：由blighanddyer法从回收的细胞中提取脂质。将提取液进行氮气干燥后，在氯仿/甲醇混合液中再溶解物制作为脂质样品。蛋白质量由bca法进行定量。
3、神经酰胺量解析：以薄层色谱(tlc)法在提取的脂质中进行解析。以氯仿：甲醇：醋酸＝190：9：1水平方向展开2次，吹干并喷硫酸铜显色溶液，以加热板烘烤并检测神经酰胺，所得值以各自的蛋白量相除得神经酰胺量。具体实验结果见表1。其中，数值是以对照组的神经酰胺量为1时的相对值。
表1.神经酰胺量值
由上表可以看出，本发明实施例的神经酰胺促进剂在脂质的解析后，神经酰胺量值高，说明对正常人表皮角化细胞产生神经酰胺具有良好的促进作用。对比例1由于采用常规的加热干燥，容易被氧气氧化的酚类物质、n-酯酰基鞘氨醇类物质会被氧化失活，导致有效成分含量降低，神经酰胺促进作用下降。对比例2由于缺少滤渣再提取，有较高含量的活性成分会残留在滤渣内，导致原料的提取率降低，促进作用下降。对比例3由于缺少促透剂月桂氮酮，使得促进透皮吸收的效果降低。
改善脸部皱纹实验
选取脸部皱纹明显、皮肤干燥枯黄，年龄在40-60之间，无皮肤过敏史的女性志愿者60人，每组20人，使用实施例1-3制备的神经酰胺促进剂，涂抹于容易产生皱纹的眼角周边和额头部位，早晚各使用一次，15天一个疗程。采用二维图像解析法测定涂布前后的眼角小皱纹，统计平均小皱纹率和小皱纹改善率。其中，二维图像解析法参见[武田克之他监修化妆品有用性-评价技术进步与将来展望药事日报社p170(2001)]。具体结果见表2。
表2.脸部皱纹改善结果
由上表可以看出，本发明实施例制备的神经酰胺促进剂对改善脸部皱纹效果显著，适合推广使用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。