专利名称：神经酰胺产生促进剂的制造方法
技术领域：
本发明涉及能够促进皮肤产生神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法。
背景技术：
皮肤具有产生神经酰胺(ceramide)和葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide)的能力。在皮肤中、特别是表皮角质层中聚集着由表皮细胞合成分泌得到的神经酰胺，它是细胞间脂质的主要成分。而由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神经酰胺或者神经鞘磷脂(sphingomyelin)的形式被储存起来；之后被排出至细胞外,在葡糖脑苷酯酶(glucocerebrosidase)和神经磷脂酶(sphingomyelinase)的作用下,再次形成神经酰胺，从而发挥作为细胞间脂质的功能。皮肤中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺具有提高皮肤的保湿功能和皮肤的屏障功能等的生理作用。但是，近来由于环境、气候等的影响，皮肤容易变得干燥，因此由皮肤自身产生神经酰胺等来改善皮肤的保湿功能就显得不足够。因而人们尝试了从外部向皮肤补充神经酰胺的方法。例如，在专利文献I中记载了培养假丝酵母(Candida)属的微生物来制造葡萄糖神经酰胺的方法,通过将该葡萄糖神经酰胺涂布在人体的干燥性皮肤上能够改善皮肤的保湿功能。该方法是直接从培养后的菌体中获取大量存在的葡萄糖神经酰胺，因此所合成的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架与人体中存在的神经酰胺类的神经酰胺骨架不同，其在两处具有碳碳双键且具有支链。因此，将这种从微生物中直接提取得到的葡萄糖神经酰胺涂布在人体皮肤上的话，有可能不能与人体皮肤相适应而产生使用安全性方面的问题。另外， 从外部向皮肤补充神经酰胺的方法与以往使用的保湿剂等同样有保湿效果的持续性不够的问题，而且有些状态的皮肤对从外界补给的神经酰胺等的吸收不充分，从而导致不能充分发挥保湿效果。而另一方面，如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡萄糖神经酰胺的产生能力，则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，而能够通过促进皮肤自身产生神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺来提高皮肤的屏障功能和保湿功能。这样，由于是由皮肤自身产生神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，所合成的是皮肤所具有的常规结构的神经酰胺等，因而其不存在与皮肤的适应性不好等的安全性问题。因此最近关于在皮肤角质层中产生促进表皮神经酰胺等的生成的物质的研究相当热门。其中，作为能够促进神经酰胺生成的物质，已报道的有以灵芝、蜂花粉(BeePollen)、川芎等的提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂(专利文献2 4)。然而，由于这些神经酰胺产生促进剂全都是从植物原料提取得到，其提取操作耗费时间长，且在天然资源的可利用性方面有限制，因而其制造成本高。另外，在专利文献5中，公开了一种能够活化皮肤表层内部的表皮细胞自身的神经酰胺合成的神经酰胺合成促进剂，其以含有烟酸和/或烟酰胺的菌培养物为有效成分，该菌培养物可以是乳酸菌培养物、双歧杆菌培养物、香菇菌体培养物或者酵母菌培养物。但是，该促进剂的制备过程中使用的培养基实质上以烟酸和/或烟酰胺作为有效成分，因此这种神经酰胺合成促进剂的制备成本较高。另一方面，人们对红酵母属的微生物已有一些研究。例如，红酵母属的某些种对烃类有弱氧化作用，并能合成β_胡萝卜素。如粘红酵母粘红变种能氧化烷烃生产脂肪，含量可达干生物量的50 60%。在一定条件下还能产生α-丙氨酸和谷氨酸，产蛋氨酸的能力也很强，可达干生物量的I %。但是，目前还没有利用红酵母属的微生物来制备神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的报道。专利文献1:日本特开2010-22217号公报专利文献2 :日本特开2005-194240号公报专利文献3 :日本特开2010-70499号公报专利文献4 :日本特开2010-150237号公报专利文献5 :日本特开平9-194383号公报
发明内容
本发明就是为了解决上述现有技术中存在的技术问题而做出的，目的在于提供一种低成本且高效地制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法。本发明人为了解决上述技术问题进行了专心研究，结果发现在含有豆渣和糖类的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物，能够高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂；从而完成了本发明。本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。根据本发明的制造方法，能够使用特定的微生物并利用豆渣这样的容易获得的物质作为培养基的主要原料，从而能够廉价且高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，该促进剂能够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺/葡萄糖神经酰胺的能力，从而有效提高皮肤的保湿能力。
具体实施例方式本发明的制造方法是在含有豆渣和糖类的培养基中培养红酵母属的微生物，并从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。 作为在本发明中使用的红酵母属(Rhodotorula)的微生物，可以列举出粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、小红酵母(Rhodotorula minuta)、浅红酵母(Rhodotorula pallida)、深红酵母(Rhodotorularubra)等。其中，从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，优选粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)或粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
本发明所涉及的红酵母属(Rhodotorula)的微生物都可以从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)或江南大学工业微生物资源和信息中心(CICM)等商业渠道购买得到。在本发明的制造方法中，可以单独使用I种上述微生物，也可以组合2种以上的上述微生物进行使用。本发明中使用的培养基是含有豆渣和糖类的培养基。豆渣和糖类都是容易获得的物质，因而，本发明的培养基具有成本低的优点。并且，除此之外，也可以适当添加例如1%的蛋白胨、O. 5%的酵母粉等。其中，豆渣是指，将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、再经过滤、除水、浙干而得到的物质。也可以使用食品产业中压榨豆浆等的豆制品制造工序中残留的大豆残渣。糖类可以是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等，它们可以任意单独使用或混合使用。而从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，其中优选葡萄糖。从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，本发明的培养基优选由豆渣、葡萄糖和水构成，进一步优选培养基中豆渣的含量为5 20w/ 、更优选8 12w/v%,葡萄糖的含量为O. 2 2w/v%、更优选O. 8 1. 2w/v%。从红酵母属(Rhodotorula)微生物的生理特性、以及提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，优选在27 35°C下进行上述培养。从红酵母属(Rhodotorula)微生物的生理特性、以及提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，上述培养时间优选为I 7天，更优选为48 96小时，更优选为68 76小时。从得到更纯的产品的观点出发，优选将通过所述培养获得的培养物进一步进行精制从而得到上清液。作为精制的方法，可以根据需要适当组合使用过滤、离心分离、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、结晶化等的常用的操作来进行。优选通过离心分离获得上清液，该离心分离的速度优选为2000 4000rpm、更优选为2500 3500rpm,离心时间优选为O 20分钟，更优选为5 15分钟。可以在离心后获得的上述上清液中加入乙醇，用来进行灭菌，并将加入了乙醇的上清液作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。也可以通过离心分离从培养液中除去菌体，再超声波处理，离心分离，回收上清液。接着，再将回收后的上清液过滤除去杂质等，真空下干燥处理后作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。通过培养本发明的红酵母属(Rhodotorula)微生物并从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，具有在正常人体的角化细胞中使神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的量增加的作用。因此，通过培养本发明的红酵母属(Rhodotorula)微生物而从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，可以用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生的治疗目的或非治疗目的的使用，也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用，或为维持健康状态的使用等。并且，所述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。
通过培养本发明的红酵母属(Rhodotorula)微生物并从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，也可以用于制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可以作为使角质层中的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺增加并恢复和提高皮肤的屏障功能和保湿功能的医药品、准医药品、化妆品等使用。另外，该神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂也可以作为以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、并根据需要标明该概念的准医药品、化妆品使用。作为本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的使用形态，可以是用于向培养细胞中添加的添加剂，也可以是配合到皮肤洗净剂、化妆品等皮肤外用剂中使用。例如，可以列举化妆水、乳液、凝胶、霜、软膏等各种形态。而作为外用剂的基齐U，只要是公知的外用基剂即可，没有特别限制。在配制各种皮肤外用剂时，可以单独地使用本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，或与在皮肤洗净剂和化妆品等皮肤外用剂中通常配合的油性成分、保湿剂、粉体、色素、乳化剂、增溶剂、紫外线吸收剂、增稠剂、药效成分、香料、防菌防霉剂、植物提取物、醇类等适当组合来使用。将本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂添加到培养的表皮细胞中来促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的情况下，作为该促进剂的干燥物的添加量优选为O. 0001 10w/v%，更优选为O. 001 5w/v%。当添加量为O. 0001w/v%&上时，能得到充分的促进效果；而当添加量为10w/V%以下时，对表皮细胞的刺激性更小。
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将本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂配合在皮肤外用剂使用时，从有效促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生、从而有效提高皮肤的保湿能力、而且不易显示出培养物的颜色和气味的观点出发，其配合量优选为皮肤外用剂总量的O. 01 20w/v%,更优选为O.1 10w/v%。实施例下面，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。实施例1<神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备(发酵液处理)>首先，按照以下方法制备培养基将大豆放入水中浸泡12小时，使大豆充分吸收水分，然后将吸收了水分的大豆研磨破碎，将其过滤并除去液体成分，剩余残渣浙干，得到豆渣。将该豆渣与葡萄糖以及水相混合，并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到10界八％和lw/v%，将该混合物作为培养基。然后，将IOOml的上述培养基加至三角烧瓶中，接种一定量的粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号CICIM Y0250)，在 30°C下培养 3 天。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，取Iml混合液作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品A，存于4°C冰箱中以备用作细胞培养用添加物。对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品B、C，将样品B、C分别以50%乙醇溶解而配制成1%、0. 1%浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。<神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价>(细胞培养)首先，取正常人的活化角质化细胞(Cascade Co. ,Ltd)作为原代细胞，于75cm2培养瓶中(含有生长因子的培养基2ml) ,37°C XO2浓度为5%的条件下培养细胞至80 90%浓度。进行传代，传代细胞至175cm2方瓶中继续培养细胞至80 90%浓度。然后将传代后的人体表皮细胞接种到12孔板中，每孔容积为2ml，细胞浓度为I X IO5个细胞/ml，继续培养细胞至80 90%浓度。然后，在上述12孔板中更换不含有生长因子的培养基，将样品A、B、C和对照品(浓度为50V/V%的乙醇水溶液)分别加入上述12孔板中(η = 2)，相同培养条件下培养3天。3天培养后，弃去上清培养液，以2ml PBS (磷酸盐缓冲液)对细胞进行2次清洗，再加入Iml的PBS至板孔中，以细胞收集器(细胞铲)收集细胞至试管中，以备后续神经酰胺/葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。(神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认)在回收得到的含有细胞的PBS溶液中加入甲醇氯仿=2. 5ml 1. 25ml的溶剂，进行振动20分钟，进行离心(3000rpm，5分钟)分离，从而得到上清液a和沉淀b。将上清液a用于神经酰胺/葡 萄糖神经酰胺量的分析，将沉淀b用于蛋白质含量的分析。(I)神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量的分析在由此得到的上清液a中加入PBS 氯仿=1. 25ml 1. 25ml的溶剂，进行振动20分钟，进行离心(3000rpm，5分钟)分离，得到上下两相。回收下相，并在30°C、氮气保护下进行干燥40分钟。在得到的干燥品中加入100 μ I的氯仿甲醇=2ml Iml的溶剂进行溶解，并用下述薄板层析(TLC)法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(分别记为Cer和GlyCer,单位为μ g/ml)的解析。将神经酰胺(或葡萄糖神经酰胺)标准品与样品溶液点至干燥TLC板上，以 CHC13 CH30H CH3C00H(190 9 lv/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至薄板顶端，以吹风机吹干展层剂；重复以上步骤一次。然后以CHCl3 CH30H C3H60(76 20 4v/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至距薄板底端2. 5cm处，停止展层，以吹风机吹干。喷以硫酸铜磷酸溶液，吹干，将层析板放置于180°C烘烤板上烘烤7分钟显色。扫描显色TLC板并进行神经酰胺(或葡萄糖神经酰胺)分析。(2)蛋白质含量的分析为了表征细胞中的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量，进行蛋白质含量分析。在上述沉淀b中加入90 μ I的SDS (十二烷基磺酸钠)溶液并进行混合，在60°C下加热2小时使蛋白质变性降解，冷却后在其中添加100 μ I的2N的HCl溶液，按照BCA Kit (蛋白质定量分析试剂盒)法测定其中蛋白质的量(记为Pro，单位为μ g/ml)。(3)分析结果
对于本发明品和对照品的样品，分别测定Cer/Pro和GlyCer/Pro (见下式)。以对照品的Cer/Pro和GlyCer/Pro为I,在表I中表示本发明品的Cer/Pro和GlyCer/Pro的相对值。另外，以对照品每孔中的蛋白质的量为100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值(Pro. (%))，并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(相对于对照品的相对量)，即，Cer/Well = Cer/ProXPro. (% ), GlyCer/ffell = GlyCer/ProXPro. (% ) 一并在表I中表不。如果Cer/Pro (或Cer/Well)大于I (对照品的值)，则表明该样品具有神经酰胺产生促进效果；如果GlyCer/Pro (或GlyCer/Well)大于I (对照品的值),则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。如表I所示，确认了本发明品A、B和C具有神经酰胺产生促进效果。实施例2在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0433)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。
然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，取Iml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品D，存于4°C冰箱中以备用作细胞培养用添加物。对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品E、F，将样品E、F分别以50%乙醇溶解而配制成1%、0.1 %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品D、E、F的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例2的样品E、F具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例3在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICM，编号 CICM Y0430)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICMY0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，取Iml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品G，存于4°C冰箱中以备用作细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品G的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例3的样品G具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例4在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘红酵母(Rhodotorula glutinis)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICM，编号CICMY0148)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品H，将样品H以50%乙醇溶解而配制成I %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品H的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例4的样品H具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例5在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0324)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养 。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品1、J，将样品1、J分别以50%乙醇溶解而配制成1%、0.1 %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品1、J的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例5的样品1、J具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例6在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0337)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，取Iml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品K，存于4°C冰箱中以备用作细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品K的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例6的样品K具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例7在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0394)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品L，将样品L分别以50%乙醇溶解而配制成I %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品L的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例7的样品L具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例8在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0418)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，取Iml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品M，存于4°C冰箱中以备用作细胞培养用添加物。对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品N、0，将样品N、O分别以50%乙醇溶解而配制成1%、 0.1 %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品Μ、Ν、0的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例8的样品M、N、O具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。实施例9在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，用粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(保藏于江南大学工业微生物资源和信息中心CICIM,编号 CICM Y0423)代替粘性红圆酵母(Rhodotorula mucilaginosa)(编号 CICM Y0250)，除此以外，与实施例1同样进行培养。然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2. 5倍的无水乙醇稀释，对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm) 10分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品P，将样品P以50%乙醇溶解而配制成0.1 %浓度的溶液，存于4°C冰箱中作为细胞培养用添加物。按照与实施例1同样的方法评价样品P的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表不在表I中。如表I所示，确认了实施例9的样品P具有神经酰胺和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。
表I
权利要求
1.一种神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 在含有豆渣和糖类的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
2.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述红酵母属(Rhodotorula)的微生物是粘性红圆酵母(Rhodotorulamucilaginosa)或粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
3.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述糖类是葡萄糖。
4.如权利要求3所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养基由豆渣、葡萄糖和水构成。
5.如权利要求4所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养基中所述豆洛的含量为8 12w/v%,所述糖类的含量为O. 8 1. 2w/v%。
6.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 在27 35 °C下进行所述培养。
7.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 所述培养时间为I 7天。
8.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 将通过所述培养获得的培养物进行离心，从而得到所述上清液。
9.如权利要求8所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中， 在离心后获得的所述上清液中加入乙醇后，将其作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
10.如权利要求9所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法， 其中，进一步对所述加入了乙醇后得到的物质通过超声波处理、离心分离、过滤、真空干燥处理进行精制后，得到神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
11.豆渣的发酵提取物用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物得到的。
12.豆渣的发酵提取物作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物得到的。
13.豆渣的发酵提取物在制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途， 所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物得到的。
14.如权利要求11 13的任一项所述的用途，其中， 所述红酵母属(Rhodotorula)的微生物是粘性红圆酵母(Rhodotorulamucilaginosa)或粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
全文摘要
本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养红酵母属(Rhodotorula)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。根据本发明的制造方法，能够利用容易获得的物质作为培养基并利用特定的微生物，来廉价而高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。
文档编号C12P1/02GK103060382SQ20111031646
公开日2013年4月24日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者孔凡旗 申请人:花王株式会社