一种含有靶向性酯多肽的混杂脂质体的制备方法与流程

本发明属于制药领域，具体地，涉及一种含有靶向性酯多肽的混杂脂质体的制备方法。
背景技术：
：脂质体是指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。因其具有缓释型和低毒性等特点在药物传递体系中发挥着重要的作用。脂质体是通过自身的性质或对其表面的修饰可以得到不同的靶向给药或缓控释的目的。姜黄素(cur)是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类化合物，是中药姜黄的主要活性成分。研究表明，cur是一种安全有效的具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种作用的药物，其中姜黄素在用于预防和治疗肿瘤、对多种肿瘤细胞的产生、增殖、转移均具有抑制作用，因此，cur常被用作抗肿瘤药物。但是，cur不溶于水，且水溶液在中性至碱性ph条件下不稳定，其水溶液4℃下存放三天，体外抗癌活性明显下降。将cur包封于类脂质双分子层内制备脂质体形成载药体系是研究的方向，其涉及脂质体的稳定性、药物的包载率、如何延长脂质体进入机体后的存留时间、提高生物利用率以及在工业生产中的量化等问题。酯多肽作为一种功能性多肽材料，由于其具有疏水的饱和碳链和亲水的多肽链段，这种两亲性结构与类脂质分子的结构极其相似，其优良的自组装性能和在水中的靶向脂质体可以提高药物对目标组织的靶向性以及与目标组织的亲和力与结合度。多肽修饰的包载药物的脂质体可以增加药物在体内的选择性，减少药物的毒副作用，提高药物治疗指数。多肽分子是机体内一类重要的生物活性物质，将其作为导向物以配体-受体特异性结合的方式应用于靶向药物递送系统，具有良好的研究价值和应用前景。通过设计氨基酸序列，可以获得一系列8～16个氨基酸残基的自组装多肽。多肽自组装主要是通过一系列的非共价键作用力如氢键、静电作用、疏水作用、范德华力、芳香堆积、水合作用等驱动实现的。两亲性多肽具有两亲性、良好的生物相容性和生物可降解性，且易于进行分子设计和结构修饰等特点，因而自组装多肽在作为疏水性药物载体方面具有巨大的潜力。对于不同的疏水性药物，如何能有效地提高包封率并降低其渗漏、提高生物利用度，则需要根据制剂要求找出最合适的制备工艺。技术实现要素：针对上述情况，本发明的目的在于提供一种含有靶向性酯多肽的混杂脂质体的制备方法，所述制备方法采用一种含rgd多肽和c12序列的两亲性多肽作为靶向材料，姜黄素为模型药物制备脂质体，解决了疏水性药物因水中溶解度低而给药困难、生物利用度低的问题，同时制备出的脂质体具有包封率高、粒径分布均匀、稳定性好、安全低毒的优点。为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：一种含有靶向性酯多肽的混杂脂质体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、称取卵磷脂、胆固醇和酯多肽，置于玻璃容器中，向玻璃容器中加入无水乙醇溶解，得混合液；所述酯多肽的化学结构式为：步骤二、向混合液中加入姜黄素无水乙醇溶液，混匀，在旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机相至瓶壁上形成均匀透明的薄膜；随即趁热加入磷酸缓冲盐溶液将薄膜洗脱分散，42-48℃水浴常压旋转水合20-40min，超声10-20min使充分溶解，得混杂脂质体溶液。作为对上述方案的进一步优化，所述卵磷脂和胆固醇的质量比为1:1～3:1；姜黄素含量为0.1～0.25mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为30-50ml，浓度为0.01mol/l；酯多肽的含量为0.001g。作为对上述方案的更进一步优化，所述卵磷脂和胆固醇的质量比为2:1；姜黄素含量为0.15mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为50ml。作为对上述方案的进一步优化，所述超声的频率为30khz，温度为30℃。作为对上述方案的进一步优化，步骤二所述减压蒸发的绝对压强为0。有益效果：1、本发明采用的多肽分子为c12kkgrgds序列，其中的rgd序列是由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，可与11种整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附，提高病灶组织对目标药物的粘附。本发明所述制备方法利用一种含rgd多肽和c12脂肪链的两亲性多肽作为靶向材料、姜黄素为模型药物制备的脂质体，靶向性强，解决了因疏水性在水中溶解度低而导致给药困难的问题，脂质体具有包封率高、粒径分布均匀、渗漏率低、稳定性好、安全低毒等优点，使得药物能高效率到达病灶部位并发挥药效作用，提高生物利用率。2、本发明方法采用的处方简单，工艺条件稳定性良好，易于产业化，具有较大推广价值。该方法制得的姜黄素脂质体包封率高。脂质体的体外毒性试验证明制备脂质体的材料卵磷脂和胆固醇及添加的靶向材料c12对细胞来说，毒性是非常小的，基本可以忽略，符合药物载体低毒的要求，可以作为药物载体。另外，该酯多肽混杂脂质体具有靶向定位作用，可以显著提高被载药物在病灶组织中的蓄积量，而有效提高药效，并降低药物的毒副作用，有望被开发为新型的靶向药物载体。附图说明图1是脂质体粒径分布图；图2是不同浓度的普通脂质体与c12脂质体对c6细胞的细胞毒性对比图。具体实施方式下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。一种含有靶向性酯多肽的混杂脂质体的制备方法：1、实验步骤采用薄膜分散法来制备脂质体。精密称取卵磷脂、胆固醇和c12kkgrgds多肽于500ml圆底烧瓶中，加入适量无水乙醇，超声使之完全溶解；再加入已配好的姜黄素无水乙醇溶液，在旋转蒸发仪上减压蒸发除去有机相(控制温度在45℃)至瓶壁上形成均匀透明的薄膜；随即趁热加入磷酸缓冲盐溶液将薄膜洗脱分散，42-48℃水浴常压旋转水合20-40min，超声10-20min使充分溶解，得混杂脂质体溶液。所述c12kkgrgds多肽，购于上海强耀生物技术有限公司，纯度>95％；过程中，关于卵磷脂和胆固醇的质量比、姜黄素的加入量、酯多肽的加入量以及用于溶解的磷酸盐缓冲液的加入量对制备的脂质体的性能指标是至关重要的。上述超声的频率为30khz，温度为30℃；减压蒸发的绝对压强为0，相对压力为-0.01mpa；所述卵磷脂和胆固醇的质量比为1:1～3:1；姜黄素含量为0.1～0.25mg；磷酸缓冲盐溶液的加入量为30-50ml，浓度为0.01mol/l。2、研究脂质体制备的最佳原料配比采用正交试验来寻找最佳配比，以脂质体的包封率作为考察的指标，最终确定最优处方。合理安排和分析众多因素的试验方法，最终选择了三个主要因素进行分析，即卵磷脂与胆固醇比例a，姜黄素用量为b，pbs用量c，每个因素确定三个水平，a因素各水平数依次为1:1，2:1，8:1；b因素的各水平数依次为0.1，0.15，0.25；c因素的各水平数依次为30，40，50，选用l9(33)正交设计表，如下表1所示。表1：正交试验设计优化脂质体处方及制备工艺的实验设计与结果测定结果：随着卵磷脂与胆固醇比例的增加，脂质体的包封率先增大后减小；随着姜黄素用量的增加，脂质体的包封率也随之增加；随着pbs用量的增加，脂质体的包封率也随之增加。所以最优水平组合为a2b2c3，即卵磷脂和胆固醇的比例为2:1，其中，卵磷脂0.02g，胆固醇0.01g；姜黄素的质量为0.15mg；pbs为50ml。3、处方优化在以上优化的最优条件下，添加不同量的靶向材料c12kkgrgds多肽，分别制备出靶向脂质体。以包封率为考察指标，最终确定c12kkgrgds多肽的用量为0.001g。4、靶向脂质体的粒径分布采用动态光散射(dls)来检测粒径分布。将0.2ml新鲜制备所得的脂质体混悬液以2.5ml二次蒸馏水稀释。每次测定均重复3次。测定结果如图1所示：其平均粒径为115nm(分散系数pdi为0.131)。由图1分析来看，制备出的脂质体粒径较小，分布均匀。5、稳定性试验包载rgd肽的脂质体与空白脂质体样品液在4±2℃下静置避光保存5天，并在第1，3，5天测定渗漏率。结果如表2所示。表2：含肽靶向脂质体与空白脂质体的渗漏率时间1天3天5天渗漏率含肽脂质体82.7875.0873.3411.4％空白脂质体92.8387.6980.5813.2％测定结果：五天内测得的渗漏率，含肽脂质体比空白对照脂质体的渗漏率小。6、脂质体的体外毒性试验未载药脂质体通过mtt法，选用c6细胞进行体外毒性试验。c6细胞按6000个/孔的浓度种于96孔板中。经含有10％fbs的dmem(200μl/孔)培养24h后，换入200μl含有特定浓度脂质体的新鲜培养基继续培养48h。以200μl新鲜培养基置换出孔中溶液后，向每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，培养4h。除去培养基，并在每个孔中加入150μldmso。在570nm下，经酶标仪(bio-rad,model550,usa)测定吸光度值(od)。相对细胞活性由如下公式计算：细胞活性(％)＝[od570(样品)/od570(对照)]×100。其中，od570(对照)表示不含脂质体的测定值，而od570(样品)表示含有脂质体的测定值。测定结果如图2所示，当脂质体的浓度达到200μg/ml时，c6细胞的相对存活率都在80％以上，表明制备脂质体的材料卵磷脂和胆固醇及添加的靶向材料c12kkgrgds对细胞来说，毒性是非常小的，基本可以忽略，符合药物载体低毒的要求，可以作为药物载体。当前第1页12