子宫内膜异位症改善用原材料及其制造方法与流程

本发明涉及子宫内膜异位症改善用原材料，特别是涉及利用苷元型异黄酮(也称为“异黄酮苷元”)的子宫内膜异位症改善用原材料及其制造方法。

背景技术：

一般希望改善子宫内膜异位症，例如也提出了子宫内膜异位症相关疾病的治疗药(参照专利文献1)等。可是，专利文献1记载的治疗药并非针对女性体内大量拥有的雌激素进行治疗。

另一方面，子宫内膜异位症是子宫内膜样组织在子宫腔外生长并发展的疾病，5％至10％生育年龄的女性患病(非专利文献1)。子宫内膜异位症的主要症状为骨盆疼痛和不孕(非专利文献2)。如果闭经则症状改善，因而众所周知，雌激素与病灶的发展和维持相关(非专利文献3)。在子宫内膜异位症病灶局部，雌激素直接诱导细胞因子而与炎症相关(非专利文献4)。炎症性细胞因子在子宫内膜异位症病灶局部促进雌激素合成，结果，正反馈加重病灶的发展-维持(非专利文献5)。以这种方式，子宫内膜异位症被认为是雌激素依赖性炎症疾病，激素和炎症性细胞因子两者与病灶的发展、维持和临床症状相关(非专利文献6)。

低剂量雌激素-孕激素、gnrh激动剂、孕激素等对于子宫内膜异位症的内分泌的治疗对病灶发展、骨盆疼痛是有效的。可是，它们会抑制排卵，因而无法直接用于希望妊娠的女性。期待有副作用小、能够用于所有子宫内膜异位症患者的新的子宫内膜异位症治疗药。

异黄酮是具有弱的雌激素作用的植物来源非类固醇天然物。异黄酮与雌激素结构类似，因而能够与雌激素受体(er)结合而发挥雌激素样作用。异黄酮的活性非常弱，为雌激素的千分之一至万分之一，因而，对于雌激素血液浓度高的生育年龄女性，异黄酮也具有抗雌激素作用。大豆中，作为糖苷型异黄酮，主要含有染料木苷和大豆苷，是大豆重量中仅有约0.2～0.3％左右的珍贵的功能性成分，大豆胚芽的异黄酮含量比大豆整体高约10倍。而且，胚芽所含的异黄酮的组成与全大豆所含的异黄酮的组成是不同的，含有大量大豆苷异黄酮。可是，糖苷型异黄酮无法直接吸收至体内，利用肠道细菌的酶将糖苷型异黄酮的糖链分解形成苷元型异黄酮后被吸收。苷元型异黄酮的糖链已经被分解，因而跟肠道细菌的作用无关，在胃、肠道被快速吸收(非专利文献7～9)。

根据过去的研究，提示下述可能性：经历过体外受精的患者的异黄酮口服摄取会改善黄体期孕酮的效果，胚移植成功率、临床妊娠率上升(非专利文献10)。还有植物来源异黄酮在妊娠初期控制来自子宫内膜的前列腺素分泌的报告(非专利文献11)。此外，在190名闭经后女性的随机试验中，12周的aglymax口服摄取使潮热症状减轻(非专利文献12)。苷元型异黄酮与糖苷型相比，在体内吸收迅速、吸收率也高(非专利文献13)。染料木素促进雌激素依赖性乳癌细胞(mcf-7)的细胞增殖(非专利文献14)、使他莫昔芬的抑制效果降低(非专利文献15)。另一方面，大豆苷元抑制mcf-7的增殖(非专利文献16)、使他莫昔芬的治疗效果改善(非专利文献17)。这些报告表明，根据异黄酮种类的不同，对靶细胞的效果是不同的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2009-209158号公报

专利文献2:日本专利第3014145号公开公报

专利文献3:日本专利第4397525号公开公报

非专利文献

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非专利文献22:bulunse，子宫内膜异位症(endometriosis)，nengljmed2009，360:268-79。

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非专利文献24:monsivaisd,dysonmt,yinp,navarroa,coonjs5th,pavoneme,bulunse，雌激素受体β通过由血清和糖皮质激素调节的激酶活化来调节子宫内膜异位细胞的存活(estrogenreceptorβregulatesendometrioticcellsurvivalthroughserumandglucocorticoid-regulatedkinaseactivation)，fertilsteril2016，105:1266-73。

非专利文献25:zhangl,cuir,chengx,duj，血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶的抗细胞凋亡作用是由激活ikb激酶的新机制介导的(antiapoptoticeffectofserumandglucocorticoid-inducibleproteinkinaseismediatedbynovelmechanismactivatingikbkinase)，cancerres2005，65:457-64。

技术实现要素：

发明所要解决的课题

对于女性保健而言，异黄酮受到了关注，但还不知道其对于子宫内膜异位症的效果，为了理解临床效果、药理作用，需要详细的分析。

因此，本发明是鉴于这样的点而做出的，其目的在于，提供作为利用苷元型异黄酮的原材料的、能够改善子宫内膜异位症的子宫内膜异位症改善用原材料及其制造方法。

用于解决课题的方法

为了实现前述目的，本发明人等进行了深入研究，使用从子宫内膜异位症性囊肿分离的子宫内膜异位症基质细胞和子宫内膜异位症小鼠模型，将苷元型异黄酮对于子宫内膜异位症的效果与糖苷型异黄酮对于子宫内膜异位症的效果相比较，完成了作为以下本发明的子宫内膜异位症改善用原材料。作为苷元型异黄酮，使用作为通过基于专利文献2和专利文献3的制造方法制造的原材料的aglymax(注册商标)。

本发明涉及的第一方式的子宫内膜异位症改善用原材料的特征在于，具有有改善子宫内膜异位症作用的苷元型异黄酮。

而且，根据这样的构成，通过将苷元型异黄酮用任何方法给药-应用，子宫内膜异位症得以改善。

此外，本发明涉及的第二方式的子宫内膜异位症改善用原材料的特征在于，在第一方式中，

前述改善子宫内膜异位症的作用包括下述作用中的至少一种：

-抑制子宫内膜异位症基质细胞的增殖，

-降低子宫内膜异位症细胞的il-6、il-8、芳香化酶和cox-2的基因表达，

-降低子宫内膜异位症细胞的pge2的蛋白质水平，

-降低子宫内膜异位症细胞的芳香化酶酶活性，

-抑制子宫内膜异位症细胞中被tnf-α促进的iκb的磷酸化，

-在子宫内膜异位症细胞的荧光免疫染色中阻碍p65的核内摄取，

-作为erβ拮抗剂的phtpp抑制苷元型异黄酮对于子宫内膜异位症细胞带来的增殖抑制效果，

-erβ敲低细胞抵消苷元型异黄酮对于子宫内膜异位症细胞的效果，

-erα拮抗剂mpp不会抵消aglymax对于子宫内膜异位症细胞改善子宫内膜异位症的作用，

-降低子宫内膜异位症细胞中sgk1的基因表达，

-阻碍子宫内膜异位症模型小鼠的囊肿形成，

-降低子宫内膜异位症细胞中的ki67染色比例。

而且，根据这样的构成，通过将苷元型异黄酮例如口服给药，子宫内膜异位症相关的多个项目得以改善。

此外，本发明涉及的子宫内膜异位症改善用原材料的制造方法的特征在于，对豆类接种曲霉而制曲，通过对该制曲处理得到的生成物加水而使该生成物中的蛋白质水解，同时，使前述豆类中的异黄酮化合物的配糖体分解，生成含有大量苷元的异黄酮化合物，制造含有以前述豆类为原料的苷元型异黄酮的子宫内膜异位症改善用原材料。

而且，根据这样的构成，可以发挥下述优异的作用效果：能够切实地制造子宫内膜异位症改善用原材料，能够切实地提供可以改善子宫内膜异位症的子宫内膜异位症改善用原材料。

发明效果

根据本发明涉及的子宫内膜异位症改善用原材料，能够通过利用苷元型异黄酮的原材料来改善子宫内膜异位症。

根据本发明涉及的子宫内膜异位症改善用原材料的制造方法，能够切实地制造可以改善子宫内膜异位症的、利用苷元型异黄酮的子宫内膜异位症改善用原材料。

附图说明

图1中，a为aglymax带来的关于子宫内膜异位症基质细胞和正常子宫内膜的增殖的特性图，b为异黄酮40(后述)带来的关于子宫内膜异位症基质细胞和正常子宫内膜的增殖的特性图。

图2中，a为显示基于实时pcr，对照、aglymax、异黄酮40关于il-6、il-8、芳香化酶和cox-2的基因表达状态的特性图，b为对照、aglymax关于pge2蛋白质水平的特性图，c为对照、aglymax关于芳香化酶酶活性的特性图。

图3中，a为aglymax关于被tnf-α促进的iκb的磷酸化抑制的特性图，b为aglymax的关于p65的摄取阻碍的特性图。

图4中，a为aglymax和phtpp的关于细胞增殖抑制的特性图，b为aglymax和mpp的关于细胞增殖抑制的特性图，c为关于aglymax对于sierβ和对照的细胞增殖抑制的特性图，d为关于aglymax和对照的sgk1基因表达的特性图，e为显示aglymax的药理机制的说明图。

图5中，a为显示子宫内膜异位症样病变的照片，b为显示a的病变大小的照片，c为显示将对照、aglymax和异黄酮40给药的小鼠中囊肿个数的特性图，d为显示c情况下囊肿重量的特性图，e为显示将对照和aglymax给药的小鼠中囊肿部分的ki67的染色比例的特性图。

具体实施方式

以下，参照图1至图5对本发明涉及的子宫内膜异位症改善用原材料的实施方式进行说明。

基于本发明，通过以下的实验等，确认通过将作为子宫内膜异位症改善用原材料的苷元型异黄酮对检测物给药-应用，子宫内膜异位症得以改善。

1.关于异黄酮

将前述aglymax(尼基莫生物科技有限公司制)用作作为本发明的子宫内膜异位症改善用原材料的苷元型异黄酮。子宫内膜异位症改善用原材料的制造方法在下文描述。该aglymax是通过基于专利文献2和专利文献3的制造方法将大豆胚芽用曲霉发酵，经过提取-浓缩过程而制造的苷元型异黄酮，成分构成是大豆苷元、染料木素和大豆黄素为7:1:2。

作为比较原材料，使用aglymax的前体物质、作为糖苷型异黄酮的异黄酮40(多摩生物化学株式会社制)。

2.关于检测物

关于患者，从24名接受卵巢子宫内膜异位症性囊肿摘除术的患者(平均年龄36.8岁，24-44岁)获得子宫内膜异位症基质细胞。从12名接受卵巢良性肿瘤摘除术的患者(平均年龄34.9岁，22-41岁)获得正常子宫内膜细胞。使用从至少手术6个月前以后未接受过激素治疗的患者的检测物。遵照赫尔辛基宣言，在获得京都府立医科大学伦理审查委员会的认可后开始研究(ere-e-306)。从全部患者获得了知情同意承诺。

3.实验项目

3-1.关于子宫内膜异位症基质细胞的增殖

(实验方法)

细胞处理和细胞增殖分析如下进行。

子宫内膜异位症基质细胞如先前报道的那样进行处理、分离(非专利文献18)。在96孔板上，以每1孔5000个细胞的方式播种。用aglymax和dmso处理24小时，72小时后，通过wst-8分析测定细胞增殖。利用多孔multiplex9120(bio-rad)，用450nm的波长测定。

(实验结果)

aglymax对于子宫内膜异位症基质细胞显示出增殖抑制效果，而异黄酮40未确认到该效果。

进一步进行说明，通过wst-8分析，测定aglymax和异黄酮40对于子宫内膜异位症基质细胞和正常子宫内膜的效果。aglymax浓度依赖性抑制子宫内膜异位症基质细胞的增殖(p<0.01)，在正常子宫内膜中不显示增殖抑制效果(参照图1a)。而异黄酮40在子宫内膜异位症细胞和正常子宫内膜中均不显示增殖抑制效果(参照图1b)。根据这些结果，以后的研究是将aglymax浓度设为20μm而进行的。

3-2.关于mrna和cdna合成、实时pcr

(实验方法)

从子宫内膜异位症基质细胞提取rna使用的是rneasyminikit(qiagen)，遵循实验步骤(protocol)。rna浓度利用nanodrop(thermoscientific)测定。cdna合成使用revertraaceqpcrrtkit(toyobo)和geneamppcr9700(appliedbiosystems)。实时pcr使用powersybrgreenandsteponereal-timepcrsystem(appliedbiosystems)。引物的靶基因设为il-6、il-8、芳香化酶、cox-2、sgk1和gapdh。

(实验结果)

aglymax抑制il-6、il-8、芳香化酶和cox-2的基因表达。异黄酮40不抑制它们的基因表达。进一步，aglymax抑制pge2的蛋白表达和芳香化酶酶活性。

进一步进行说明，通过实时pcr，调查子宫内膜异位症细胞的il-6、il-8、芳香化酶和cox-2的基因表达。与对照相比，aglymax使4个基因的表达降低(p<0.05)，利用异黄酮40，基因表达未被抑制(参照图2a)。aglymax使pge2的蛋白质水平降低(p<0.05)(参照图2b)。与mrna水平同样地，aglymax使子宫内膜异位症细胞的芳香化酶酶活性降低(p<0.05)(参照图2c)。

3-3.关于蛋白质印记(westernblot)和荧光免疫染色

(实验方法)

细胞蛋白提取使用ripa缓冲液(ripabuffer)(nacalaitesque)和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegels)(atto)。一抗使用磷酸化抑制剂κb(phosphorylatedinhibitorκb)(p-iκb)、总抑制剂κb(total-inhibitorκb)(t-iκb)、erb(abcam)、gapdh(cellsignalingtechnology)，二抗使用抗兔免疫球蛋白g(againstrabbitigg)(cellsignalingtechnology)。荧光免疫染色是，在盖玻片上进行细胞播种后，一抗使用磷酸化组蛋白h3(phosphor-histoneh3)(ser10)，二抗使用alexa-偶联二抗(alexa-conjugatedsecondaryantibodies)(cellsignalingtechnology)。用pi(vectorlaboratories)激发荧光，用fv1000激光共聚焦扫描电镜(fv1000confocallaserscanningmicroscope)和fluoviewsoftware(olympus)分析。

(实验结果)

得到了nf-κb通路的分析以及蛋白质印记和荧光免疫染色的结果。

进一步进行说明，调查了aglymax在细胞内信号传导通路中的效果。aglymax抑制在子宫内膜异位症细胞中被tnf-α促进的iκb的磷酸化(参照图3a)。进一步通过荧光免疫染色确认到aglymax阻碍p65的摄取(参照图3b)。

3-4.关于elisa和芳香化酶酶活性测定

(实验方法)

pge2的蛋白浓度用pge2highsensitivityenzymeimmunoassay(eia)kit(enzolifescience)测定。通过已经报道的[³h]-water法测定芳香化酶酶活性(非专利文献19)。

(实验结果)

aglymax通过erβ抑制子宫内膜异位症的细胞增殖。进一步抑制sgk1的表达。

进一步进行说明，用加入了作为erβ拮抗剂的phtpp的培养液，通过wst-8分析，测定细胞增殖。phtpp抑制aglymax的增殖抑制效果(图4a)。进一步，通过转染sirna将erβ敲低，通过wst-8分析，调查增殖抑制效果。erβ敲低细胞抵消了aglymax的效果(图4b)。加入erα拮抗剂mpp，同样地通过wst-8分析进行测定，aglymax的效果未被抵消(参照图4c)。进一步，aglymax使sgk1的基因表达降低(p<0.05)(参照图4d)。

3-5.关于利用子宫内膜异位症模型小鼠进行的研究

(实验方法)

在balb/c小鼠(7周龄)卵巢摘除后，用雌二醇(e2:0.5mg/小鼠/周)给药，使激素动态稳定。将从同型小鼠摘下的子宫组织切碎，投至腹腔内(非专利文献20)。从子宫组织移植1周后开始，给予分别含有0.6％aglymax和0.65％异黄酮40的饵食。给予饵食4周后，将腹腔内形成的囊肿摘下。测量囊肿个数、囊肿重量。通过ki67染色评价细胞增殖能力。

(实验结果)

aglymax抑制子宫内膜异位症模型小鼠的囊肿形成，而异黄酮40未显示抑制效果。

进一步进行说明，子宫内膜异位症样病变在小鼠腹腔内生长(参照图5a)。病变的大小为2至10mm(参照图5b)。给予含有aglymax的饵食的小鼠的囊肿个数(参照图5c)、囊肿重量(参照图5d)与对照和异黄酮40相比降低(p<0.05)。aglymax与对照相比使ki67染色比例降低(p<0.05)(参照图5e)。

3-6.关于统计分析

统计分析使用mann-whitneyu-test，数据用平均值±标准偏差表示。p值是将0.05以下设为有显著差异。

4.作用效果汇总

该实验是调查aglymax和异黄酮40对子宫内膜异位症基质细胞和正常子宫内膜细胞、子宫内膜异位症模型小鼠的药物效果的最初的研究。aglymax仅在子宫内膜异位症细胞中确认到增殖抑制效果，因而提示可以用于子宫内膜异位症患者。进一步确认到通过erβ、-nf-κb通路显示药理作用。在模型小鼠中，aglymax显示出囊肿形成抑制，而异黄酮40不显示。aglymax的浓度是在20μm进行研究的，需要进一步详细的浓度设定。

子宫内膜异位症是局部的骨盆炎症性疾病(非专利文献21)。在子宫内膜异位症组织中，活动性巨噬细胞分泌il-6、il-8等炎症性细胞因子。这些细胞因子对病灶的发展维持是有贡献的。aglymax抑制il-6、il-8的mrna表达。该结果与细胞增殖抑制相关。进一步抑制芳香化酶、cox-2、pge2，从而提示对病灶局部的雌激素产生抑制、骨盆疼痛有效。总之，aglymax抑制子宫内膜异位症加剧相关因子。

这里，对aglymax通过何种机制对子宫内膜细胞显示抗炎症作用、细胞增殖抑制进行分析。子宫内膜异位症细胞与正常子宫内膜相比erβ的表达高(非专利文献22)。作为aglymax的主要构成异黄酮的大豆苷元与erβ弱结合(非专利文献23)。如由结果所示，通过阻断erβ，aglymax的效果降低。在erα中，aglymax的效果未被抑制，因而表明药理效果是借助于erβ的。

nf-κb在子宫内膜异位症中是重要的控制因子。aglymax抑制被tnf-α促进的iκb的磷酸化和p65的核内摄取，显示出抗炎症作用。在子宫内膜异位症中，sgk1被erβ控制(非专利文献24)。sgk1促进iκb的磷酸化，促进nf-κb活性(非专利文献25)。aglymax也抑制sgk1的基因表达。aglymax通过抑制该通路而发挥抗炎症作用(参照图5e)。

用子宫内膜异位症模型小鼠来评价aglymax和异黄酮40的效果判定。从子宫组织移植1周后开始，给予分别含有6％aglymax和6.5％异黄酮40的饵食。aglymax与对照和异黄酮40相比使囊肿个数和囊肿重量降低。这些结果证明，aglymax在吸收至小鼠体内时也与在体外(invitro)具有同样的效果。

结论是，aglymax通过erβ、-nf-κb通路抑制子宫内膜异位症的细胞增殖，抑制子宫内膜异位症模型小鼠的病变形成。期待这些药理作用的抑制子宫内膜异位症的病灶发展和骨盆疼痛的效果。

5.子宫内膜异位症改善用原材料的制造方法

5-1.制造工序

子宫内膜异位症改善用原材料的制造方法可以通过专利文献2和专利文献3记载的方法来进行。

具体地，如下进行。

即，在专利文献2中，对豆类接种曲霉而制曲，通过对该制曲处理得到的生成物加水而使该生成物中的蛋白质水解，同时，使前述豆类中的异黄酮化合物的配糖体分解，生成含有大量苷元的异黄酮化合物，制造以前述豆类为原料的子宫内膜异位症改善用原材料。

这种情况下，同时还进行前述豆类中植酸的除去。

此外，在专利文献3中，通过进行下述工序来制造子宫内膜异位症改善用原材料：

(1)将通过使用微生物的发酵而水解的大豆用非极性溶剂脱脂，使得到的脱脂生成物干燥；

(2)将工序(1)中得到的干燥脱脂生成物用极性溶剂抽提，使得到的含有异黄酮化合物的提取物浓缩干燥凝固；

(3)将工序(2)中得到的浓缩干燥凝固提取物用极性溶剂溶解，进一步加水稀释后进行分离，得到不溶性物质，

前述极性溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或它们与水的混合物；以及

(4)根据需要将工序(3)中得到的不溶性物质洗涤、干燥而将溶剂除去。

5-2.原料

专利文献2的实施例中，使用豆类中的大豆粕作为原料。

专利文献3的实施例中，使用大豆中的大豆胚轴作为原料。

作为子宫内膜异位症改善用原材料的原料，优选使用含有大量苷元型异黄酮的大豆胚轴。

5-3.作为制造结果物的子宫内膜异位症改善用原材料

以大豆胚芽为原料，通过专利文献2和专利文献3记载的制造方法制造的子宫内膜异位症改善用原材料含有大量苷元型异黄酮。

作为苷元型异黄酮，含有大豆苷元、染料木素和大豆黄素。它们中的1种也可以用作子宫内膜异位症改善用原材料。

尤其在aglymax中，大豆苷元、染料木素和大豆黄素按重量比为7:1:2。

以这种方式，根据本发明的制造方法，能够发挥下述优异的作用效果：能够切实地制造子宫内膜异位症改善用原材料，能够切实地提供可以改善子宫内膜异位症的子宫内膜异位症改善用原材料。