子宫内膜异位的判定方法

子宫内膜异位的判定方法
【专利摘要】本发明提供用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p和hsa-miR-518d-3p中的1种以上的miRNA的浓度的、以上述miRNA的扩增引物为主要成分的子宫内膜异位诊断药。本发明还提供包括测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p和hsa-miR-518d-3p中的1种以上的miRNA的浓度的工序的子宫内膜异位的检测方法。本发明的子宫内膜异位诊断药及使用其的诊断方法简便、侵袭性低、且灵敏度和特异性高。
【专利说明】子宫内膜异位的判定方法
[0001] 夺叉申请
[0002] 本申请基于日本专利申请2012-124595 (2012年5月31日申请）主张优先权，其 内容作为参照组合入本说明书中。

【技术领域】
[0003] 本发明涉及新型的子宫内膜异位诊断标记物及利用该标记物的子宫内膜异位的 诊断。

【背景技术】
[0004] 子宫内膜异位目前通过经阴道超声波造影及磁共振造影法诊断，其确诊通过腹腔 镜检查进行。另外，作为子宫内膜异位诊断标记物，已知有CA125等血中蛋白标记物。
[0005] 除CA125以外，还研究了作为血清CA19-9的诊断标记物的有用性（FERTILITY AND STERILITY 78 (2002) 733-739:非专利文献1)。另外，也提出了将各种炎症标 记物与CA-125 (均为蛋白标记物）组合的诊断方法（FERTILITY AND STERILITY 89 (2008) 1073-1081 :非专利文献 2)。
[0006] 另夕卜，报告了子宫内膜异位患者的子宫内膜中的miRNA表达解析（Mol Endocrinol 25(2011)821-832 :非专利文献3)。在该文献中，在患者的子宫内膜组织中，显 示10种miRNA表达增强、12种miRNA表达减少。但是，对于这些miRNA在血中的表达没有 任何提及。
[0007] miRNA (Micro RNA，微RNA)是指在机体中内源性存在的、19?23个碱基的单链RNA 分子。目前为止鉴定了 700种以上的人类miRNA，已知靶标基因的mRNA(信使RNA)依赖于 序列发挥作用，具有控制基因表达的功能，但其详细的作用机理及其生理学的作用尚未很 好地解明。
[0008] 本说明书中引用的参考文献如下。这些文献所记载的内容全部组合入本说明书中 作为参照。
[0009] 现有技术文献
[0010] 非专利文献
[0011] 非专利文献 I :FERTILITY AND STERILITY 78(2002)733-739
[0012] 非专利文献 2 :FERTILITY AND STERILITY 89(2008) 1073-1081
[0013] 非专利文献 3 :Mol Endocrinol 25(2011)821-832


【发明内容】

[0014] 发明要解决的问题
[0015] 本发明的目的在于提供比现有的方法更简便、侵袭性低、且灵敏度及特异性高的 来自血液的试样中的子宫内膜异位诊断标记物。另外，本发明的目的在于提供容易组合多 种标记物进行测定的来自血液的试样中的子宫内膜异位诊断标记物、以及使用其的诊断方 法。
[0016] 解决问题的方法
[0017] 本发明人等在研究来自子宫内膜异位患者血液的试样中的约600种miRNA的表达 时发现：hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p 及 hsa-miR-518d_3p 的 3 种 miRNA 的表达增强。基 于该表达，本发明人等进一步反复研究，完成了本发明。
[0018] 即本发明提供：
[0019] [1] 一种子宫内膜异位诊断药，其用于测定来自受检者血液的试样中的选自 hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p 及 hsa-miR-518d-3p 中的 1 种以上 miRNA 的浓度，且以该 miRNA的扩增引物为主要成分；
[0020] [2]包含[1]的诊断药的子宫内膜异位诊断试剂盒；
[0021] [3]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-708 ;
[0022] [4]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-127-3p ;
[0023] [5]根据[1]所述的子宫内膜异位诊断药，其中，miRNA为hsa-miR-518d-3p ;
[0024] [6]根据[1]和[3]至[5]中任一项所述的子宫内膜异位诊断药，其中，来自血液 的试样为血浆；
[0025] [7] -种子宫内膜异位的检测方法，其包括：测定来自受检者血液的试样中的选 自 hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p 及 hsa-miR-518d_3p 中的 1 种以上 miRNA 的浓度的工序；
[0026] [8]根据[7]所述的方法，其包括：将上述miRNA的浓度与正常对照中的上述 miRNA的浓度比较，确定上述miRNA的浓度是否为高值的工序；
[0027] [9]根据[7]或[8]中任一项所述的方法，其包括：确定上述miRNA的浓度是否为 临界（cut off)值以上的工序；
[0028] [10]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-708 ;
[0029] [11]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-127-3p ;
[0030] [12]根据[7]至[9]中任一项所述的方法，其中，miRNA为hsa-miR-518d-3p ;
[0031] [13]根据[7]至[12]中任一项所述的方法，其中，来自血液的试样为血浆；
[0032] [14] -种诊断受检者的子宫内膜异位的方法，其包括：测定来自受检者的血液的 试样中的选自 hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p 及 hsa-miR-518d_3p 中的 1 种以上 miRNA 的 浓度的工序；
[0033] [15]根据[14]所述的方法，其包括：将上述miRNA的浓度与正常对照中的上述 miRNA的浓度比较，确定上述miRNA的浓度是否为高值的工序；
[0034] [16]根据[14]或[15]所述的方法，其包括：确定上述miRNA的浓度是否为临界 值以上的工序。
[0035] 发明的效果
[0036] 本发明的子宫内膜异位诊断药及诊断方法比现有的方法（经阴道超声波造影、磁 共振造影法、腹腔镜、血中蛋白标记物等）更为简便，侵袭性低，灵敏度及特异性高。另外， 本发明的子宫内膜异位诊断药及诊断方法中，容易组合多种标记物进行测定，通过组合多 种标记物，能够灵敏度良好、特异性地诊断子宫内膜异位。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1表示患者及对照的2组间的hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p及 hsa-miR-518d_3p的三种miRNA的表达分布。
[0038] 图2表示通过ROC解析进行的单独miRNA的子宫内膜异位检测能力的评价。各纵 轴表示灵敏度，横轴表示假阳性率（1-Specificity (1-特异性））。
[0039] 图3表示使用利用多种miRNA的预测模型时的检测能力的评价。
[0040] 发明的【具体实施方式】
[0041] 本发明提供，用于测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、 hsa-miR-127-3p及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA(本说明书中，有时称为"本发明 的miRNA"）的浓度，且以上述miRNA的扩增引物为主要成分的子宫内膜异位诊断药（本说 明书中，有时称为"本发明的诊断药"）。
[0042] 本说明书中，受检者是指患有或者疑似患有子宫内膜异位的人。在来自受检者 的血液的试样中包含全血、血清及血浆。该试样优选为血清或血浆，更加优选为血浆。此 夕卜，通常认为血清miRNA浓度与血浆miRNA浓度相关（例如、参照Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(2008) 10513-10518)。
[0043] 本发明中，在来自子宫内膜异位患者的血液的试样中被发现表达增强的miRNA为 hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p 及 hsa-miR-518d_3p 的 3 种。这些 miRNA 的喊基序列如下 所述，也可以参照 miRBase (http://www. mirbase. org/index. shtml)。
[0044] hsa-miR-708 (aaggagcuuacaaucuagcuggg)序列编号 I
[0045] hsa-miR-127_3p (ucggauccgucugagcuuggcu)序列编号 2
[0046] hsa-miR-518d_3p (caaagcgcuucccuuuggagc)序列编号 3
[0047] 本发明的子宫内膜异位诊断药以能够扩增这3种miRNA中的1种或其以上的 miRNA的引物（本说明书中，有时称为"本发明的扩增引物"。）作为主要成分。使用这些扩 增引物，将本发明的miRNA以聚合酶链式反应（PCR)等进行扩增，由此能够测定来自血液的 试样中的本发明的miRNA的浓度，能够进行子宫内膜异位的简便且迅速的检查。
[0048] 本发明的扩增引物为单链的寡核苷酸，优选为DNA。扩增引物有正向引物和反向引 物，将这两种组合使用。典型而言，正向引物具有与miRNA序列的中间核酸的5'侧的6? 10个碱基相同的序列（其中，在引物为DNA时，代替U而具有T)，反向引物具有与miRNA序 列的中间核酸的3'侧的6?10个碱基的序列互补的序列。
[0049] 任意地，引物在与其伸长方向的相反侧，也可以具有对于扩增产物的识别、纯化、 亚克隆等有用的添加的序列（例如编码His-tag的序列或限制酶识别部位）。这样的添加 的序列优选为1?15碱基的长度。各扩增引物的序列选定为各引物的特异性高，在分子内 不形成二级结构，引物彼此不杂交。各扩增引物的长度优选为12?30个核苷酸，更优选为 15?25个核苷酸。
[0050] 进而，为了使PCR产物的定量容易，优选正向引物及反向引物的一方或两方被荧 光标识。作为荧光标识，可以列举荧光色素、消光物质、供体色素、受体色素。
[0051] 本发明的扩增引物能够使用通用的DNA合成装置（例如、Applied Biosystems公 司制Model 394)化学地合成，但也可以使用在该【技术领域】中所公知的其他方法合成。
[0052] 在另一个观点中，本发明提供子宫内膜异位诊断试剂盒。试剂盒除本发明的诊断 药之外，还可以包括用于对试样进行前处理的试剂、PCR用的试剂及酶、缓冲液、容器以及使 用的指南等。
[0053] 从又一个观点中，本发明提供包括测定来自受检者血液的试样中的选自 hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p 及 hsa-miR-518d_3p 中的 1 种以上 miRNA 的浓度的工序的 子宫内膜异位的检测方法（本说明书中，有时称为"本发明的方法"。）。
[0054] 为了测定试样中的miRNA的浓度，从试样中提取RNA制备模板cDNA，将其作为模板 使用本发明的扩增引物进行PCR，由此使试样中所含的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p 及hsa-miR-518d-3p中的1种以上miRNA扩增。
[0055] 从试样中提取RNA的方法在该【技术领域】中是熟知的，例如可以使用胍-异硫氰酸 酯及苯酚-氯仿提取。或者也可以使用市售的RNA提取试剂。然后，可以将所得到的总RNA 进行尺寸分级，得到miRNA。例如，能够使用Trizol LS reagent(Life Technologies Inc.) 从试样中提取 RNA，使用 mirVana miRNA isolation kit (Life Technologies Inc.)的过滤 管（Filter cartridge)，分离制备 RNA 组分。
[0056] 以RNA作为模板合成cDNA的方法在该【技术领域】也是熟知的。作为引物，能够使 用市售的随机引物或莖环逆转录引物（Stem-loop reverse transcription primers),在 dNTPs的存在下使用逆转录酶合成cDNA。
[0057] 接着，将这样制备的DNA或cDNA作为模板，使用本发明的扩增引物进行PCR。优选 使用实时PCR扩增法，对miRNA进行定量。特别地，在优选方式中，能够利用使用TaqMan (商 品名）探针的定量RT-PCR，测定来自血液的试样中的miRNA的浓度。
[0058] 在miRNA的浓度的测定中，为了校正测定值的偏差，优选包含适当的内部标准。作 为内部标准，可以列举例如已知表达量没有变动的miRNA、snRNA或mRNA，具体而言，可以列 举β-肌动蛋白、甘油醛β-磷酸脱氢酶、及核糖体蛋白质P1。另外在同时测定大量（例如 200以上）的miRNA的情况下，能够使用这些全部的表达量的中间值作为内部标准。
[0059] 本发明的miRNA的浓度可以使用将具有与hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p或 hsa-miR-518d-3p的一部分相同或互补的序列的探针固定化得到的微阵列，利用杂交法进 行测定。此外，也可以使用新一代测序法（next-generation sequencing),直接测定miRNA 的浓度。
[0060] 将这样得到的来自受检者的血液的试样中的本发明的miRNA的浓度，与正常对照 中的本发明的miRNA的浓度比较，确定是否为高值。在受检者的上述试样中的本发明的 miRNA的浓度与正常对照比较为高值的情况下，判定该受检者患有子宫内膜异位或者疑似 患有子宫内膜异位。"正常对照"是指来自被诊断为没有患子宫内膜异位的人的血液的试 样。优选预先测定多个正常对照中的各miRNA的浓度，预先求出对照组平均表达量。
[0061] 在优选方式中，本发明的方法包括确定使用来自受检者血液的试样中的miRNA的 浓度构建的预测模型函数是否为临界值以上的工序。临界值是指以判定、诊断疾病为目的 设定的值，本发明中的临界值是指，为了知道是否疑似患有子宫内膜异位而设定的、使用来 自受检者的血液的试样中的本发明的miRNA的浓度构建的预测模型函数的值。受检者的上 述试样中的本发明的miRNA的浓度为临界值以上的情况下，受检者就被判定为患有子宫内 膜异位或者疑似患有子宫内膜异位。关于该临界值的设定方法虽然没有特别规定，但能够 使用逻辑（Logistic)回归分析构建取0到1之间的值的预测模型函数，通过进行关于规定 的受检者组和对照组的集团的ROC曲线分析而求得。
[0062] 在特定的方式中，作为临界值能够使用如下的值：
[0063] 作为上述试样中的miRNA 使用 has-miR-708、has-miR-127-3p 和 has-miR-518d-3p 三种miRNA的情况下，作为其临界值，能够使用0. 1以上且0. 9以下、优选0. 31以上且0. 68 以下、更优选〇. 40以上且0. 59以下的值。
[0064] 作为上述试样中的miRNA使用has-miR-708和has-miR-518d_3p两种miRNA的情 况下，作为其临界值，能够使用〇. 1以上且〇. 9以下、优选0. 34以上且0. 66以下、更优选 0. 38以上且0. 54以下的值。
[0065] 作为上述试样中的miRNA使用has-miR-708的情况下，作为其临界值，能够使用 0. 1以上且0. 9以下、优选0. 42以上且0. 60以下、更优选0. 46以上且0. 58以下的值。
[0066] 作为上述试样中的miRNA使用has-miR-127-3p的情况下，作为其临界值，能够使 用0. 1以上且0.9以下、优选0.44以上且0.55以下、更优选0.49以上且0.55以下的值。
[0067] 作为上述试样中的miRNA使用has-miR-518d_3p的情况下，作为其临界值，能够使 用0. 1以上且0.9以下、优选0.44以上且0.56以下、更优选0.47以上且0.53以下的值。
[0068] 另外，本发明的方法也能够通过测定来自从1位受检者在某一时刻仅1次分离的 血液的试样中的本发明的miRNA的浓度而进行，但由于本发明的miRNA的浓度伴随从子宫 内膜异位发病的时间的增长而增大，所以也能够通过测定从1位受检者经时地采集的试样 中的本发明的miRNA的浓度而进行。此时，由于不与正常对照的miRNA的浓度比较而能够 进行子宫内膜异位的检测，所以优选。此时，试样的采集例如在从初诊开始两周到完全治愈 为止的期间、以1周1次左右的间隔进行。即，本发明的诊断方法也包括疾病发展的监控方 法以及治疗经过的监控方法。
[0069] 本说明书中明示引用的全部专利及参考文献的内容都作为参照组合入本说明书 中。在本说明书中使用的情况下，由"包含/包括（comprising)···"的表达所表示的方式包 括由"本质上由…构成（essentially consisting of)"的表达所表示的方式、以及由"由… 构成（consisting of)"的表达所表示的方式。
[0070] 以下利用实施例更加详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。 实施例
[0071] (来自患者以及对照受检者的血清试样）
[0072] 由经阴道子宫镜诊断的子宫内膜异位患者（20例）及与患者组的年龄相配的对照 受检者（20例（其中9例为子宫内膜异位以外的良性妇科疾病患者，11例为健康人））的血 清试样由Cureline Inc. (South San Francisco,美国卡利福尼亚州）购入。血清试样在 使用之前保存于-80°C。各受检者的临床信息记载于表1。
[0073] [表 1]
[0074] 受检者的监床信息
[0075]

【权利要求】
1. 一种子宫内膜异位诊断药，其用于测定来自受检者血液的试样中的选自 hsa-miR-708、hsa-miR-127_3p 及 hsa-miR-518d_3p 中的 1 种以上 miRNA 的浓度，且以所述 miRNA的扩增引物为主要成分。
2. -种子宫内膜异位诊断试剂盒，其包含权利要求1所述的诊断药。
3. 根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中， miRNA 为 hsa-miR-708。
4. 根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中， miRNA 为 hsa-miR-127_3p。
5. 根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中， miRNA 为 hsa-miR-518d_3p。
6. 根据权利要求1所述的子宫内膜异位诊断药，其中， 来自血液的试样为血浆。
7. -种子宫内膜异位的检测方法，其包括： 测定来自受检者血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及 hsa-miR-518d_3p中的1种以上miRNA的浓度的工序。
8. 根据权利要求7所述的方法，其包括： 将所述miRNA的浓度与正常对照中的所述miRNA的浓度比较，确定所述miRNA的浓度 是否为高值的工序。
9. 根据权利要求7所述的方法，其包括： 确定所述miRNA的浓度是否在临界值以上的工序。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中， miRNA 为 hsa-miR-708。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中， miRNA 为 hsa-miR-127_3p。
12. 根据权利要求7所述的方法，其中， miRNA 为 hsa-miR-518d_3p。
13. 根据权利要求7所述的方法，其中， 来自血液的试样为血浆。
14. 诊断受检者的子宫内膜异位的方法，其包括： 测定来自受检者的血液的试样中的选自hsa-miR-708、hsa-miR-127-3p及 hsa-miR-518d_3p中的1种以上miRNA的浓度的工序。
15. 根据权利要求14所述的方法，其包括： 将所述miRNA的浓度与正常对照中的所述miRNA的浓度比较，确定所述miRNA的浓度 是否为高值的工序。
16. 根据权利要求14所述的方法，其包括： 确定所述miRNA的浓度是否在临界值以上的工序。
【文档编号】C12Q1/68GK104411834SQ201380027968
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年5月30日 优先权日:2012年5月31日
【发明者】内山秀文 申请人:武田药品工业株式会社