用于释放益生菌和保持其酶活性的粘膜粘附装置的制作方法

本发明涉及用于施加于粘膜的粘膜粘附装置，用于释放活的益生菌和/或它们的酶。具体而言，本发明涉及粘膜粘附颊膜形式的医疗装置，其中对于通过释放短乳杆菌atcc4006和/或通过释放和保持它们的药理学有用的酶活性治疗其他粘膜会获得的结果，颊粘膜是良好的预测模型。
背景技术：
：牙菌斑是一种生物膜，并且是口腔中存在的细菌生态系统(微生物区)的主要组分。构成该微生物区的细菌种类数量非常多，数量级达到数千种，并且预计其中约一千种组成牙齿周围的生物膜。根据研究人员的报道，口腔微生物区形成颊环境的防御体系的一部分，阻止致病性细菌对口腔的定殖。非常可能的情况下，这种防御功能解释了其随时间的相对稳定性，尽管环境改变时常发生(marsh和brandshaw，1995；kolenbrander和palmer，2004)。因此，发生牙齿生物膜的组成失衡能导致出现龋齿、牙周问题和口臭(badet和thebaud，2008)。例如，龋齿的特征为属于变形链球菌群的链球菌的生长(selwiz等，2007)。另一方面，以牙周炎为例，牙周问题与诸如牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌和放线共生放线杆菌的细菌种类的生长相关，这些细菌能躲避宿主的防御并定殖在牙龈下面的部位，导致组织损伤(houle等，2003；offenbacher，1996)。化疗和放疗能很频繁地导致口腔粘膜炎，口腔粘膜炎包括颊粘膜最表层细胞的快速死亡，出现非常疼痛的炎症和溃疡，变为细菌和病毒感染的容易靶点。口腔粘膜炎的影响能严重损害个体的生活质量，限制他们自我进食的能力(naidu等，2004)。乳酸菌是革兰氏阳性细菌，其特征为具有从己糖发酵为乳酸或乳酸和乙醇的过程中衍生其自身存活需要的能量的能力。同时，乳酸杆菌(lactobacillus)、明串珠菌属(leuconostoc)、片球菌属(pediococcus)、链球菌属(streptococcus)和乳球菌属(lactococcus)被分类为乳酸菌。从糖产生乳酸的其他细菌为双歧杆菌，但通过不同的代谢途径。乳酸菌和双歧杆菌被包括在称为″益生菌″细菌组别中，益生菌具有多种有益作用，最重要的是在哺乳动物、特别是人的肠道中，但是不仅于此。乳酸菌和双歧杆菌分泌多种抗微生物物质，诸如有机酸、过氧化氢和细菌素，并且与颊病原体竞争粘膜上的粘附位点(reid等，2003；meurman，2005)。因此，利用乳酸菌和双歧杆菌来解决口腔微生物失调的病理学效应是有前景的治疗人类和动物的备选疗法，除此之外还是通过保持合适的牙齿健康和口腔健康料理个人卫生的有效方法。事实上，乳酸菌和双歧杆菌能通过调节它们生活环境的ph和/或氧化还原电势而破坏致病性微生物的活力，刺激非特异性免疫机制，以及调节激素和细胞免疫应答(erickson等，2000；marco等，2006)。短乳杆菌atcc4006菌株能产生大量精氨酸脱亚胺酶和鞘磷脂酶。特别是，原核生物酶精氨酸脱亚胺酶是该细菌的特征(dimarzio等，2001)并且负责分解精氨酸。通过该酶的活性，短乳杆菌atcc4006菌株导致作为聚胺合成前体的影响肿瘤细胞的体外生长精氨酸从环境中被去除(dimarzio等，2001)。由于真核细胞还使用精氨酸来产生作为炎症过程的重要介质的一氧化氮(n0)，从细胞环境去除前体精氨酸能显著减少n0产生并因此调节免疫应答。细菌鞘磷脂酶一种能水解paf(血小板活化因子)的酶，paf是强的炎症细胞因子(rui-dongduan，2006)。该益生菌在还涉及粘膜中炎症过程的疾病中的功效可能归功于这种酶活性。除了牙科学领域的应用之外，例如，用于治疗粘膜炎、口疮性口炎和龋齿，一般的乳酸菌以及特别是短乳杆菌atcc4006还可以例如用于阴道炎和阴道病、直肠炎症、窦炎、耳炎和结膜炎、胃炎和食管炎。最近证实，短乳杆菌atcc4006在治疗一些口腔疾病中能具有有益效果。该益生菌目前在市场上为片剂制剂，用于在口腔溶解，名称为dellariccia等(dellariccia等，2007)已经在一组患有慢性牙周炎的患者中评估了短乳杆菌atcc4006的这种制剂的抗炎效应，得到了正面效果。除此之外，短乳杆菌已被证实为阻止产黑色普雷沃菌导致的颊生物膜形成的有前景的药剂，产黑色普雷沃菌是牙周炎的致病因素之一(vuotto等，2013)。piyushshah等(2013)在患有牙周炎的患者样本中比较了口腔施用单独的和多西环素与和抗生素的组合，并且在患有侵袭性牙周炎的患者样本中比较了单独的和多西环素与和抗生素的组合，并证实益生菌对牙龈炎症、龋齿发生和颊环境中乳杆菌的存在具有有益作用。含有短乳杆菌atcc4006的片剂的功效也已经在治疗患有白塞氏综合征的患者的口腔溃疡中得到证实(tasli等，2006)。最近，在具有针对安慰剂的对照的双盲随机研究中，已证实含有短乳杆菌atcc4006的锭剂对减少牙龈出血、斑块酸产生和口腔中不希望的细菌的数量具有正面作用(campus等，2013)。toiviainen，a.等(2014)描述了利用鼠李糖乳杆菌gg和动物双歧杆菌乳酸亚种bb-12的锭剂短期(4周)治疗健康患者中的牙龈炎症和斑块。该研究证实了该菌株用于减少斑块和牙龈炎症的活性。日益增加的抗生素抗性现象的频率导致对益生菌关注的增加，诸如短乳杆菌atcc4006的益生菌能够作用于口腔中发生的问题。除此之外，在肿瘤学领域，有效和无毒性治疗粘膜疾病状态能大大增加经历化疗治疗的个体的顺应性。因此，寻找能延长释放时间、延长作用位点的存在以及保持所述益生菌表达的酶活性的施用乳酸菌和双歧杆菌的有效手段非常重要。因此，选择合适的递送系统对于通过利用乳酸菌和双歧杆菌治疗一般的粘膜并且特别是口腔的功效是重要的。粘膜粘附是天然或合成聚合物或包含其的药剂载体向粘膜的粘附。该现象可以用于药物递送，并且特别有用于用益生菌粘膜治疗，特别是颊治疗，使得能够实现细菌和细菌产生的有益物质的局部释放。通常，粘膜粘附材料包含亲水性大分子，其含有大量能形成氢键的基团，特别是羟基或羧基。粘膜粘附过程包括形成粘膜表面之间非常近且亲密的接触，特别是覆盖其的粘液素，并且材料的聚合物链包含粘膜粘附体系。这种亲密接触本质上是基于形成继发交联键，特别是氢键。需要基于个体药物应用评价调节药物释放和制剂向粘膜粘附的可能性。关于涉及粘膜粘附的内在机制的综述，参见smart，j.d.(2005)和yadav，v.k.等，2010。颊用途的粘膜粘附系统的实例描述于abruzzo等，2012和salamat-miller等，2005。膜形式的药剂(口腔薄膜；otf)特别适合用于口腔，这得力于诸如膜厚度和易于施用的性质(pehandwong，1999)。具有合适设计的制剂的otf能粘附于口腔粘膜，在与唾液的接触中缓慢溶解。除此之外，在疾病需要时，膜能直接施加于病变的表面，允许更好地处理问题。粘膜粘附膜的生产通常通过″铸造(casting)″来进行(siemann，u.，2005)。对于可用于产生基于粘膜粘附的递送系统的材料的详细总数，参见上文的yadav，v.k.等。本领域技术人员知晓粘膜粘附递送的特别复杂性，其受到多种因素的影响，诸如所用聚合物的性质，粘膜粘附聚合物存在的浓度，所用聚合物链的柔性，它们相对于诸如ph、初始接触时间的环境因子的空间构象，以及所用聚合物的膨胀能力。除此之外，很多生理学因素也与粘膜粘附递送最合适的成功有关，诸如所治疗的粘膜表面上存在的粘液素分子的更换，以及疾病进程中粘膜的物理化学状态(上文yadav，v.k.等)。除了上文描述的因素，当涉及向口腔递送乳酸菌和双歧杆菌时，非常重要的是在制备粘膜粘附制剂的过程中和使用前保存的阶段中所述细菌尽可能地保持活力，使得它们能在作用位点有效且以活的形式释放，并最终保护它们有用的酶活性。乳酸菌和双歧杆菌的颊粘膜粘附递送迄今的研究很少，因此使用这些细菌用于局部口腔治疗的兴趣是非常新近的。关于一些益生菌在预防和治疗口腔问题的用途的数据事实上在近期才获得。最近，saha，s.等(saha，s.等，2013)介绍了将含有浓度为0.012-1％的羧甲基纤维素(cmc)的otf用于颊使用。这些otf为乳酸细菌发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)ncib5221构建了载体。这些作者描述的方法提供了在双蒸水中制备cmc溶液，向其添加需要量的源自新鲜培养物的、经过离心并在0.85％w/v盐溶液中重悬的细菌。随后，将膜在层流空气下室温干燥12小时，并且在室温下在皮氏培养皿中保持密封。如此获得的otf表现出生产过程中益生菌活力显著丧失(两个数量级的幅度)，直径为100mm(10cm)的膜中含有约6.75x108细菌。保存中观察到活力进一步丧失(约一个数量级的幅度)，并且最终在室温下保存150天后完全不存在活的益生菌。另一特殊方面在于这些膜的高溶解速率，约4分钟，如果希望在作用位点调节益生菌的释放，这可能是一个障碍。事实上，益生菌体外释放在约5分钟后才达到最大峰值。heinemann等(heinemann等，2013)配制了″口腔崩解膜″作为嗜酸乳杆菌或动物双歧杆菌乳酸亚种w的载体。这些菌株被加载于包含羧甲基纤维素、明胶和淀粉的膜。同样，在这种情况下，所描述的方法提供了制备聚合物溶液，向其添加需要量的源自新鲜培养物的、经过离心并在0.9％w/v盐溶液中重悬的细菌。不同的是，干燥步骤在通风炉中30℃下进行24小时。在该研究中，在膜制备过程之后，计数结果显示益生菌损失小于15％，但是保存90天后，益生菌活力大幅下降。因此，基于以上，需要开发相比于文献中描述的膜具有创新性质的粘膜粘附膜。技术实现要素：技术问题本发明涉及粘膜粘附膜形式的医疗装置，用于释放活的乳酸菌和双歧杆菌(益生菌)和/或释放和保持它们的药理学有用的酶活性。技术方案本发明的目标包括制备含有至少一种细菌菌株的粘膜粘附膜，其中：a)至少一种细菌和双歧杆菌中存在的有益酶活性能长期保留，并且b)至少一种细菌和双歧杆菌的体内释放是局部的，并且随时间显著延长。在加工和保存阶段保持预选菌株的活力和菌株中存在的有益酶活性的方面，以及在作用位点体内释放活细菌方面，这些膜具有优异的性质。本发明的另一目标为颊粘膜粘附膜，其中特别优选的乳酸细菌为短乳杆菌atcc4006，特别优选的粘膜粘附聚合物为羟丙基甲基纤维素(hpmc)。其他优选乳酸菌和双歧杆菌为唾液乳杆菌dsm24800、植物乳杆菌dsm24801、嗜热链球菌dsm24731、嗜酸乳杆菌dsm24735、德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌dsm24734、副干酪乳杆菌dsm24733、植物乳杆菌dsm24730、长双歧杆菌dsm24736、婴儿双歧杆菌dsm24727、短双岐杆菌dsm24732以及它们相应的混合物，以及与atcc4006的混合物。本发明的另一目标为制备所述含有选自乳酸菌和双歧杆菌至少一种菌株以及它们相应的酶活性的粘膜粘附膜的方法。至少特别优选的菌株为短乳杆菌atcc4006。其他优选乳酸菌和双歧杆菌为唾液乳杆菌dsm24800、植物乳杆菌dsm24801、嗜热链球菌dsm24731、嗜酸乳杆菌dsm24735、德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌dsm24734、副干酪乳杆菌dsm24733、植物乳杆菌dsm24730、长双歧杆菌dsm24736、婴儿双歧杆菌dsm24727、短双岐杆菌dsm24732及其混合物。本发明的另一目标为利用所述粘膜粘附膜来预防和治疗动物和人的粘膜中的失调和病症，特别是口腔、生殖器、肛门、鼻腔、咽部、食管和结膜的粘膜。本发明的另一目标为利用所述粘膜粘附膜来治疗肤病症和肿瘤，例如治疗黑色素瘤、擦伤、开放伤口、皮肤溃疡、一般褥疮，特别是压力性褥疮。从以下详细描述和附加的权利要求能清楚地看出其他目标。附图描述图1：利用扫描电子显微镜获得的图像，显示了乳酸细菌短乳杆菌atcc4006仅存在于其以脱水形式被喷雾到粘膜粘附膜的一侧(图1a)。图1b显示了无细菌的膜的基底侧。图2：含有未加载的hpmc或含有乳酸细菌短乳杆菌atcc4006的粘膜粘附膜的体外水合作用测试的结果。每个点的数据指三个不同批次的5个不同的膜。图3：在12个月保存期(48周)中、2-8℃和24℃(室温)的温度下，粘膜膜中乳酸细菌短乳杆菌atcc4006的存活，(a)批次i；(b)批次ii；(c)批次iii。t0＝基线；t1＝2周；t2＝4周；t3＝8周；t4＝12周；t5＝24周；t6＝36周；t7＝48周。图4：在12个月保存期(48周)中、2-8℃和24℃(室温)的温度下，粘膜膜中酶活性的进展，(a)批次i；(b)批次ii；(c)批次iii。t0＝基线；t4＝12周；t5＝24周；t6＝36周；t7＝48周。发明实施方式在本文中且出于本发明的目的，术语″粘膜粘附otf″(口腔薄膜；otf)和″粘膜粘附膜″被视为同义词，并因此它们的使用也意图用于除口腔粘膜之外的全部类型的粘膜。在本文其他部分且出于本发明的目的，术语″益生菌″表示至少一种选自上文定义的乳酸菌和双歧杆菌的菌株以及它们的混合物。发明人意外地发现一种制备方法，使得可能获得含有大量活益生菌的粘膜粘附otf(口腔薄膜；otf)，它们能在合适的环境条件下长期保持活力和/或酶活性(长至12个月及以上)。在体内，每次单次施用后，根据本发明的粘膜粘附otf实现有活力的益生菌向口腔或向一般粘膜的延长释放(至少10小时)。合适的粘膜粘附聚合物描述于上文的yadav，v.k.等。常用于制备粘膜粘附膜并因此为本领域技术人员所知的单体例如为：甲基丙烯酸羟乙酯(hema)；羟基乙氧基乙基甲基丙烯酸酯(heema)；羟基二乙氧基乙基甲基丙烯酸酯(hdeema)；甲氧乙基甲基丙烯酸酯(mema)；甲氧基乙氧基乙基甲基丙烯酸酯(meema)；甲氧基二乙氧基乙基甲基丙烯酸酯(mdeema)；二甲基丙烯酸乙二醇酯(egdma)；n-乙烯基-2-吡咯烷酮(nvp)；n-异丙基aam(nipaam)；乙酸乙烯酯(vac)；乳酸(la)；丙烯酸(aa)；甲基丙烯酸(maa)；n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(hpma)；乙二醇(eg)；丙二醇(pg)；peg丙烯酸酯(pega)；peg甲基丙烯酸酯(pegma)；peg二丙烯酸酯(pegda)；peg二甲基丙烯酸酯(pegdma)；环氧乙烷(eo)；环氧丙烷(po)，及其组合，为了获得粘膜粘附均聚物和共聚物。特别合适的粘膜粘附聚合物选自基于或含有藻酸钠或透明质酸、明胶和羧甲基纤维素的聚合物。羟丙基甲基纤维素特别适合用于生产根据本发明的粘膜粘附膜。根据本发明的粘膜粘附膜还可以利用其他已知粘膜粘附聚合物来制备，例如，含有纤维素的聚合物或纤维素聚合物，诸如例如羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，基于或含有环氧乙烷或环氧丙烷的聚合物，基于或含有β-葡聚糖，诸如普鲁兰多糖(β-1，4-；β-1，6-葡聚糖)的聚合物，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯醇，藻酸钠，透明质酸钠，聚乙二醇，诸如黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶、阿拉伯胶的胶类，聚丙烯酸，丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物和共聚物，羧乙烯聚合物和共聚物，淀粉，天然和合成明胶，琼脂糖胶，多糖，葡聚糖，黄原胶，琼脂糖-黄原胶，淀粉，壳聚糖，右旋糖酐，果胶，纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，丙基纤维素；及其混合物或组合。本领域技术人员已知的增塑性物质(使最终的膜更具柔性的物质)可以添加到这些聚合物，相对于所用聚合物的重量，通常比例为0.5-30％或优选为0.5-20％。在这些增塑性物质中，我们提到例如，聚环氧烷，诸如聚乙二醇和聚丙二醇，小有机分子，诸如甘油，甘油单乙酸酯，甘油三乙酸酯(也称为三醋精)，聚山梨醇酯，鲸蜡醇或山梨醇，单独使用或作为混合物使用。其中，优选增塑剂为聚丙二醇和peg(聚乙二醇)。粘膜粘附是基于压实技术，并且本领域技术人员可以根据最终用途选择最合适的粘膜粘附体系。根据本发明的粘膜粘附膜是通过称为″膜铸造″的技术制备。相比于本领域技术人员已知的基本方法，根据本发明的膜铸造方法进行了重大变化。这种变化包括，在溶剂中制备聚合物溶液，溶剂通常为水，而不向其中混合益生菌，正与目前的实践规定和上文saha等描述的相反。除此之外，在根据本发明的变型中，增塑剂优选添加至粘膜粘附聚合物的水性溶液，不同于上文saha等的描述。粘膜粘附膜生产的全部步骤优选在无菌环境中实施。制备根据本发明的粘膜粘附膜的方法包括以下步骤：-将粘膜粘附聚合物与水(优选量为1％w/w-3％w/w)和增塑剂(优选量为0％或0.5％-5％w/w，基于聚合物重量)混合，轻柔搅拌有利于溶解，进行例如超过8小时和12小时。然后，粘性溶液优选允许室温下静置另外的10-12小时，确保气泡消失；-将上述制备的混合物浇注到平坦表面，以实现均匀的厚度，优选≤5mm。可以使用需要尺寸的合适的模具，并允许≥30℃的温度下、优选30-60℃、更优选45-55℃下进行干燥，通常进行2小时，优选4-6小时。-使益生菌(例如，短乳杆菌atcc4006)或预选的酶产物(例如精氨酸脱亚胺酶或鞘磷脂酶)沉积和分布在上述步骤获得的脱水的膜的表面上，例如通过喷雾，益生菌是按照需要的每单位表面积浓度并处于纯的和脱水的形式，例如，冻干形式或通过喷雾干燥或本领域技术人员已知的其他技术脱水的产物；-然后，干燥上述步骤获得的粘膜粘附膜，直至制备物达到恒重。该干燥步骤在诸如硅胶的脱水剂的存在下在室温实施，优选在真空下实施，通常进行18-26小时，直至获得适度脱水的稳定产品。通过该方式获得的otf具有高度可重复的技术参数。它们的厚度≤1mm，优选≤500μm，更优选≤100μm，例如为80.00-90.00μm，例如88.33μm，并且形状被设定为使得益生菌的释放是单向的，即仅存在于膜的一侧(参见图1)。该性质在已知的otf中不存在(saha等)，这使得最终使用者能根据治疗需求使益生菌直接接触粘膜或外部环境(例如颊腔)。图1a显示了用细菌冻干物喷雾的膜表面上均匀分布的乳杆菌。一个特别有利且预料不到的性质在于能够加载于每个粘膜粘附膜的益生菌的量。事实上，甚至可能向直径1cm的otf上加载1x108cfu或更多细菌，通常为1x102-1x1012cfu。相比于已知技术中的颊粘膜粘附膜，特别是相对于上文saha等作出的工作，这是特别有利的。相比于已知技术中的颊粘膜粘附膜，加载大量益生菌和延长细菌释放的可能性提供了相当可观且无法预料的改进。个体批次中粘膜粘附膜之间的重量变化是相当有限的，并且为9.0mg-9.6mg。与重量类似，膜的厚度也证实为具有很好的可重复性，变化幅度为约5-10％，且标准差值低，如实施例部分的表1所示。这些数据表明，在重量和厚度方面，该生产方法能提供可重复获得的均匀膜。膜可以被细分成单元，通常尺寸为10x10cm，并且被包装于合适的初级包装中，用于药学和非药学用途。然后，在施用时，可以用普通剪刀将每个单元裁剪，将膜的尺寸调整为该单元被施用的部分，例如，粘膜病变，特别是颊粘膜病变。也可以将膜制备成条状并缠绕以形成带，在使用时可以裁剪。有利的是，膜的各个部分含有均匀浓度的活性成分(益生菌和/或酶)。关于根据本发明的otf的体外水合作用能力的数据显示于图2，并且涉及在模拟人唾液存在下，相比于无益生菌的膜，对加载有益生菌的膜的测量(实验细节参见下文的“实施例”部分)。在所用的实验条件下，根据本发明的0tf被证实为相对缓慢地发生水合，最大百分比水合作用峰位于120分钟(2小时)；在该阶段中，otf转变为胶状半固体体系，其实现有效粘膜粘附和随时间延长释放。相比于已知技术中的otf，该特性是相当可观的改进。例如，saha等(上文)的粘膜粘附膜表现出高溶解速率(约4分钟)，益生菌的体外最大峰释放在约5分钟后。根据本发明的加载益生菌的粘膜粘附膜比没有益生菌的膜更难发生水合。但是，该特征似乎不是它们体内功能的阻碍，如下文所示。在健康志愿者进行体内粘膜粘附测试，下文的“实施例”部分所述。在使用根据本发明的otf时，没有志愿者报告任何不适，并且将膜从口腔移除之后，未表现出炎症或牙龈粘膜损伤的体征。颊粘膜对于该结果能在治疗其他粘膜时实现提供了良好的预测模型。一旦粘附至牙龈粘膜，膜需要约2小时实现完全水合作用，并且继续保持粘附8±2小时，直至其被移除或溶解。膜对粘膜的快速粘附不会产生由于存在外来物的正常不适感觉，这也减少唾液生产。该性质有利于颊腔中和粘膜上益生菌及其酶产物的优异表现。对健康志愿者研究益生菌体内释放。这些实验的实验流程如下文“实施例”部分所述。表3和4显示了将膜的含有益生菌一侧朝向颊腔施用时获得的数据(表3)和with将膜的含有益生菌一侧朝向牙龈粘膜施用时获得的数据(表4)。在施用膜之前(t0h)和之后2小时(t2h)和10小时(t10h)，收集唾液样品。将膜的益生菌朝向颊腔施用时获得的数据表明，根据本发明的粘膜粘附膜能逐步释放益生菌，并且显著增加口腔中的乳杆菌群体。在t10h，个体d和e中乳杆菌浓度增加特别明显，此外在来自个体a和b的样品中也是明显的。关于健康志愿者测试的数据显示于表4，其中使用粘膜粘附胶将含有益生菌的一侧朝向牙龈。同样在本测试中，在施用后10小时，在全部志愿者中观察到益生菌计数的增加。该现象在个体b和e中更明显，其中从值低于检测限开始，益生菌浓度达到3.61logcfu和4.36logcfu的值。根据本发明的粘膜粘附膜还可能保护加载的细菌中有用的酶活性。“实施例”部分报告的表5显示了在将膜的益生菌朝向颊腔施用之后，测量在如上文所述获得的唾液样品中瓜氨酸获得的结果。瓜氨酸是由精氨酸脱亚胺酶带来的精氨酸转化反应的终产物。这些数据特别是关于含有益生菌短乳杆菌atcc4006的根据本发明的粘膜粘附膜，该细菌具有明显的精氨酸脱亚胺酶活性。施用膜之后2小时，唾液样品中瓜氨酸的量增加(除个体d之外)，证实酶从膜的释放。施用膜之后10分钟，瓜氨酸的量还发生了下降(除个体a之外)。10小时之后，活性降低可以解释为10小时治疗之后，酶表达的降低或酶的活性由于可能的环境改变而受到抑制。还在生产后保存期间研究了根据本发明的粘膜粘附膜的表现。“实施例”部分的表2显示了在+2-8℃和+24℃保存指定时间段的膜的水含量。观察到水含量下降，可能是由于容器中保存能封住环境中存在的水分。此外，正如所预期的，膜保存在+24℃比膜保存在+2-8℃丢失更多的水。但是，这种现象未显示膜的特性和完整性的任何显微镜改变。还研究了益生菌短乳杆菌atcc4006的存活，同样是保存在如上文所述的相同温度的三个批次的实验膜。图3所示数据显示了对于三个生产批次，12个月保存期间益生菌短乳杆菌atcc4006的存活。在批次i中，当粘膜粘附otf保存在+2-8℃中，活细菌细胞从8.20logcfu降至4.92logcfu(损失高达3.28log；60.00％存活)，并且当膜保存在+24℃时，降至4.22logcfu(损失等于3.98log；51.46％存活)。在批次ii中，在+2-8℃下，活细菌细胞从7.31logcfu降至3.37logcfu(损失等于3.94log；46.10％存活)，并且在+24℃下，降至3.13logcfu(损失等于4.18log；42.82％存活)。在批次iii中，在+2-8℃下，活细菌细胞从7.61logcfu降至6.02logcfu(损失等于1.59log；79.11％存活)，而在+24℃下，下降至5.35logcfuat+24℃(损失等于2.26log；70.30％存活)。+2-8℃下保存的颊膜中益生菌短乳杆菌atcc4006的平均存活为61.74％，而+24℃保存时为54.86％。还评估了精氨酸脱亚胺酶的酶活性的保留，同样是保存在如上文所述的相同温度的三个批次的实验膜。图4显示了2-8℃和+24℃的温度下，在12个月的膜保存期监测的菌株短乳杆菌atcc4006的精氨酸脱亚胺酶活性。在全部三个批次中，在2个温度下，酶活性受到了药理学可接受的降低。保存在+2-8℃的颊膜中存在的酶活性的平均值从时间0点的1.72μmols/h/膜降低至12个月保存期之后的0.93μmols/h/膜。保存在+24℃的颊膜中存在的平均酶活性值从时间0点的1.95μmols/h/膜降低至12个月保存期之后的0.85μmols/h/膜。图3和图4显示的结果表明，产生膜的方法与益生菌活力高度相容，并且允许微生物以及它们的代谢活性能令人满意地保存至少12月的期限，特别是在冷条件下。未发现真菌和细菌的污染痕迹。适合于施用于根据本发明的膜的乳杆菌和双歧杆菌为：嗜酸乳杆菌，布氏乳杆菌，短乳杆菌，干酪乳杆菌，链状乳杆菌，纤维二糖乳杆菌，卷曲乳杆菌，弯曲乳杆菌，德氏乳杆菌，詹氏乳杆菌，莱氏乳杆菌，小乳杆菌，植物乳杆菌罗氏乳杆菌，唾液乳杆菌，罗伊氏乳杆菌，鼠李糖乳杆菌gg，动物双歧杆菌乳酸亚种bb-12，青春双岐杆菌，角双歧杆菌，两岐双岐杆菌，链状双歧杆菌，齿双歧杆菌，艾氏双歧杆菌，婴儿双歧杆菌，长双歧杆菌，植物双歧杆菌，假链状双歧杆菌，假长双岐杆菌，乳酸链球菌，棉籽糖乳酸链球菌，嗜热链球菌，以及以上的混合物。单个使用或作为混合物的优选菌株为：短乳杆菌atcc4006，唾液乳杆菌dsm24800，植物乳杆菌dsm24801，嗜热链球菌dsm24731，嗜酸乳杆菌dsm24735，德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌dsm24734，副干酪乳杆菌dsm24733，植物乳杆菌dsm24730，长双歧杆菌dsm24736，婴儿双歧杆菌dsm24727，短双岐杆菌dsm24732。短乳杆菌atcc4006是特别优选的。单独或与上文列出的乳酸菌和双歧杆菌组合施用于根据本发明的膜的优选的酶选自：酸性、中性和碱性鞘磷脂酶，精氨酸脱亚胺酶，它们也可以获自非活细菌，例如，被超声裂解或使用不会伤害感兴趣的酶活性的方法灭活和裂解的细菌。膜也可以含有或关联于合成或天然来源的其他活性组分，例如，具有局部麻醉作用的物质，诸如，举例而言为利多卡因和丙胺卡因，抗炎活性物质，例如，酪洛芬、布洛芬、山金车、绣线菊、锦葵，抗生素，例如多西环素，或化妆品和药妆品，例如，皮肤清洁剂(clarifier)。膜也可以含有其他赋形剂物质，诸如味道调整物质，例如，精油，食品和药学用途准许的天然或合成调味剂，甜味剂，着色剂，人工甜味剂和本领域技术人员已知的用于制备颊使用制剂的其他物质。除此之外，根据本发明的粘膜粘附膜可以与其他药学上、药妆品和皮肤病学上的活性组分组合包含在套装产品中，用于组合、同时、依次或延迟施用。根据本发明的粘膜粘附膜可以用于预防和治疗能够认知为被上文定义的益生菌有效治疗的动物和人的粘膜的疾病状态和疾病，以及用于个人卫生照料。特别优选的益生菌为短乳杆菌atcc4006。其他优选益生菌为唾液乳杆菌dsm24800，植物乳杆菌dsm24801，嗜热链球菌dsm24731，嗜酸乳杆菌dsm24735，德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌dsm24734，副干酪乳杆菌dsm24733，植物乳杆菌dsm24730，长双歧杆菌dsm24736，婴儿双歧杆菌dsm24727，短双岐杆菌dsm24732。特别优选的口腔疾病状态，例如为，不同来源的颊溃疡，满口烂斑和齿根膜疾病状态。胃、生殖器、肛门、鼻腔、耳和皮肤粘膜的疾病状态，诸如，以非限制性举例的方式，阴道炎和阴道病、直肠炎症、窦炎、耳炎、结膜炎、胃炎、食管炎、粘膜损伤、系统性疾病的粘膜临床症状、擦伤、开放伤口、皮肤溃疡和褥疮，特别是压力性褥疮，是特别优选的。具体而言，口腔疾病状态例如为龋齿、牙周病症和口臭、牙龈炎、口腔粘膜炎、口疮性口炎、溃疡，诸如患有白塞氏综合征患者中存在的口腔溃疡、微口腔生物失衡、粘膜细胞增殖和炎性过程、急性和慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙龈出血、链球菌生长相关的疾病状态，特别是属于变形链球菌群的链球菌生长相关的疾病状态，诸如牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌和放线共生放线杆菌的细菌物种生长相关的疾病状态。根据本发明的膜还可用于缓解接受化疗治疗的患者中引起粘膜受累的问题，从而增加抗肿瘤治疗的顺应性。影响皮肤的肿瘤，例如，黑色素瘤，也是优选的。本发明的优势可以总结如下：-高益生菌加载，这得力于使用冻干益生菌，实现高于新鲜培养物的浓度；-生产过程简化；-保存期限长，保存稳定性好，特别使用细菌酶产物的情况下；-膜两个表面上差异性分布，允许定向释放酶或细菌和不同施用(朝向口腔或朝向粘膜)；-延长的粘膜粘附体系原位保留；-活性组分的延长/持久释放；-长水合作用时间(吸水性/水摄取)，支持延长释放；-极低的膜重量和厚度，这得力于制剂策略，特别是与制备方法有关。这些数据提示，根据本发明的粘膜粘附膜适合于延长的和根据需要治疗的疾病状态朝向口腔或齿龈的合适定向释放，这得力于益生菌仅存在于粘膜粘附膜的一侧。根据本发明的粘膜粘附膜可以用于制备药学和非药学用途的制品，例如，个体一次性单元制品，其可以包装在合适的初级包装单元，或较大尺寸的单元，在施用时可以使用剪刀将其后续分割，从而将膜的尺寸调整为所要施用的单元的部分。例如，还能够将膜制备成条，经过合适的包装并缠绕成带，可以在施用时切割。通过本发明的方法，能够获得高度柔性膜，厚度为0.01-2mm，优选0.015-0.2mm，这很好地适合粘膜，特别是颊粘膜。提供以下实施例意图在于举例说明本发明，而不应视为限制其范围。材料羟丙基甲基纤维素(hpmc，methocelk100)，聚乙烯基吡咯烷酮k15(pvp)和丙二醇(pg)获自fluka(米兰，意大利)。短乳杆菌atcc4006获自namu(首尔，韩国)，为纯冻干形式[(1011集落形成单位/克(cfuc/g)]。mrs、营养琼脂(na)和sabouraud右旋糖琼脂(sda)获自difco(becton，dickinsonandco.，sparks，md)；anaeroculta获自merckkgaa(darmstadt，德国)。全部其他化学品和溶剂均为分析级的并获自carloerba(米兰，意大利)。水合作用、粘膜粘附和释放研究在用磷酸升至ph6.8的水性缓冲液(33.87mmkh2po4，46.79mmna2hpo4·12h2o)中进行。实施例1：制备含有hpmc和丙二醇的otf羟丙基甲基纤维素(2.5％w/w)和丙二醇(1％)溶解于蒸馏水，搅拌溶液8小时。允许粘性溶液在室温静置过夜，以确保气泡消失。然后，将该溶液(6.7g)浇注并均匀分布在皮氏培养皿(直径5cm)并在50℃干燥5小时。随后，使用高度1cm、直径1cm的玻璃环限定表面积，将短乳杆菌atcc4006的冻干粉末喷雾到1cm直径的膜表面上(12.7mg/cm2)。最后，将皮氏培养皿置于干燥器24小时，直至膜达到恒重。实施例2：实施例1的颊膜的表征2.1.膜厚度从每个批次的三个膜的结果确定平均厚度(三丰测量器，三丰制造公司，东京，日本)和平均重量(电平衡)。在每个批次中每个膜的5个点评估厚度均匀性。实施测量的结果显示于表1。表1.每个实验生产批次的三个不同粘膜粘附膜(a，b和c)的厚度。数据表示为膜上随机选点的5次测量的平均值±标准差。批次i批次ii批次iiia88.33±5.2985.28±5.0780.00±5.94b83.07±5.8982.10±5.1286.37±4.02c83.33±6.0584.18±6.4485.29±6.232.2.颊膜水合作用研究在模拟人唾液的ph6.8的磷酸盐缓冲液中实施体外水合作用研究，在预定时间测量重量增加(abruzzo等，2012)。将膜称重并置于用ph6.8磷酸盐缓冲液浸湿的滤纸上(直径40mm)并在置于之前浸湿于水合作用介质并置于用相同缓冲液填至0.5cm深度的皮氏培养皿的海绵上(5cmx5cmx2cm)。水吸收被测定为6小时后膜的重量增加，使用以下公式：％水吸收(wu)＝(whip-whp-wdi)/wdi其中whip为水合的膜和湿滤纸的重量，whp为湿滤纸的重量，wdi为干燥膜的初始重量。在每个批次的三个膜进行测量，结果显示于图2。2.3.通过热重分析(tga)测定水含量用taq50仪器测量根据本发明的粘膜粘附膜的水含量(β＝10km-1，静态空气氛围，温度30-i00℃，保持恒定在100℃持续15分钟)，以在不同保存状态下研究水含量并评估膜的完整性。在每个批次的三个膜进行测量。制造三个批次的膜。这些批次保存在脱水容器中，例如含有无水硅胶中，保存在两个不同温度(+2-8℃和+24℃)持续6个月。在不同时间评估水含量：时间零点(t0)，2周(t1)、4周(t2)、8周(t3)、12周(t4)、24周(t5)、36周(t6)和48周(t7)。表2.值代表每个批次三个测量值的平均值±sd2.4.颊膜的粘膜粘附性质的体内研究在年龄为25-40岁的5名健康志愿者测试颊膜的粘膜粘附性质。指示志愿者将施加于犬齿上的牙龈粘膜，压住60秒(perioli等，2004)并且在测试阶段禁止饮食。测试前，禁止热饮(例如，茶、咖啡、奶等)至少2小时，同时禁止含有益生菌的食物/饮料和抗菌漱口水至少一周。观察膜5小时。监测志愿者来评估任何粘膜刺激和停留时间(膜完全移除需要的时间)。2.5.稳定性研究2.5.1.短乳杆菌atcc4006的活力在不同时间间隔评估保存在2-8℃和+24℃的粘膜粘附颊膜的短乳杆菌atcc4006的活力(t0＝基线；t1＝2周；t2＝4周；t3＝8周；t4＝12周；t5＝24周；t6＝36周；t7＝48周)，如图3所示。将颊膜悬浮在10ml含有0.05％的l-半胱氨酸的磷酸盐缓冲液(ph6.8)。完全溶解膜需要37℃孵育24小时。将生理溶液的连续稀释液接种于含有0.05％l-半胱氨酸的琼脂糖mrs平板，其为乳杆菌的选择性培养基。在厌氧条件下，使用含有anaeroculta的厌氧罐，将全部平板在37℃孵育48小时。除此之外，为了评估膜的微生物污染，将相同连续稀释液接种于na和sda平板，以分别计数全部细菌和真菌。在厌氧条件下，使全部平板在37℃(na)和30℃(sda)孵育48小时。以双平行样品，进行平板计数。将获得的结果转化为对数值，并计算平均值和标准差。2.5.2.酶活性的保留在不同时间间隔评估保存在2-8℃和+24℃的粘膜粘附颊膜的短乳杆菌atcc4006的酶活性(t0＝基线；t1＝2周；t2＝4周；t3＝8周；t4＝12周；t5＝24周；t6＝36周；t7＝48周)，如图4所示。将颊膜重悬于1ml的0.9mnacl中，并使用misonix超声装置在冰中超声处理(30分钟，1分钟超声和1分钟休息交替进行)(获自膜的未处理的细菌提取物)。按照zuniga等(1998)所述并进行一定改动，测定精氨酸脱亚胺酶活性。简单而言，使用引用文献中介绍的已知操作，在含有10mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)、3mm的l-精氨酸和一定量的获自膜的未处理的细菌提取物的反应混合物中测定精氨酸脱亚胺酶。37℃孵育1小时后，通过添加12mhcl中断反应。样品在11000g离心20min。使用改良的archibald方法(archibald，1944)测定反应中产生的瓜氨酸。1.5ml的酸混合物(h2so4-h3po4；1∶3，体积/体积)和0.25ml的1.5％w/v的二乙酰一肟(2，3-丁二酮一肟)添加至1ml离心样品。上述获得的混合物避光煮沸30分钟。避光冷却10分钟之后，在490nm读取样品和按照相同方式制备的标准品(游离瓜氨酸)的吸收度。颊膜中精氨酸水解表达为μmol瓜氨酸/h/膜，通过使用游离瓜氨酸获得的标准曲线测定。2.6.体内释放研究2.6.1.短乳杆菌atcc4006释放在年龄25-40岁的5名健康志愿者进行益生菌的体内释放研究。在一系列实验(表3)中，使粘膜粘附膜粘附于牙龈粘膜，如上文所述，使具有益生菌的一侧朝向口腔。在施加膜之前(t0h)和之后2小时(t2h)和10小时(t10h)获得唾液样品。将1ml唾液连续稀释以测定乳杆菌的量，如微生物分析章节所述。在其他实验(表4)中，使用粘膜粘附膜，其中具有益生菌的一侧朝向齿龈，以研究对龈粘膜的释放。表3.取自健康志愿者(a，b，c，d，e和f)的唾液样品的乳杆菌浓度。施加粘膜粘附膜，其中益生菌朝向口腔。在施用膜之前(t0h)和之后(t2h，t10h)进行计数，并表示为logcfu平均值±sd。表4.使用亲水性棉拭子，来自健康志愿者(a，b，c，d，e和f)的牙龈拭子的乳杆菌浓度。施加粘膜粘附膜，其中益生菌朝向齿龈。在施用膜之前(t0h)和之后(t10h)进行计数，并表示为logcfu平均值±sd。使用无益生菌的一侧将膜施用于齿龈后，在施用膜(t0h)之前和之后10小时(t10h)，也获得了牙龈拭子。将拭子立即浸没于2ml的生理溶液。然后，将生理溶液稀释，使得能够计数乳杆菌。唾液样品和拭子的乳杆菌的检测限为10cfu/m1(1logcfu/m1)。2.6.2.精氨酸脱亚胺酶释放在年龄25-40岁的5名健康志愿者进行精氨酸脱亚胺酶的体内释放研究。使粘膜粘附膜粘附于牙龈粘膜，其中使具有益生菌的一侧朝向口腔。在施加膜之前(t0h)和之后2小时(t2h)和10小时(t10h)获得唾液样品。按照之前章节2.5.2中所述，测定唾液样品的精氨酸脱亚胺酶活性。唾液样品中的精氨酸水解表示为mm瓜氨酸。表5.来自5名志愿者(a，b，c，d和e)的唾液样品的精氨酸脱亚胺酶活性。在施用膜之前(t0h)和之后(t10h)实施计数，其中具有益生菌的一侧朝向口腔，结果表示为瓜氨酸平均浓度(mm)of±sd。2.7.形态学分析进行sem(扫描电子显微镜)分析，以研究颊膜的形态学结构。将膜固定在合适的载体上，并在氩气氛下用金/钯包被。然后，使用设定为1.5kv的leo420显微镜(le0electronmicroscopyltd.，英国)观察样品。2.8.统计学分析全部实验以三平行测试进行。结果表示为平均值±sd。anova检验用于确定统计学显著性。p值＜0.05认为差异具有显著性。实施例3：制备含有hpmc、pvp和丙二醇的otf羟丙基甲基纤维素(2.5％w/w)，聚乙烯基吡咯烷酮k15(17.5％w/w)和丙二醇(8％w/w)溶解于蒸馏水，搅拌溶液8小时。允许粘性溶液在室温静置过夜，以确保气泡消失。然后，将该溶液浇注并均匀分布在皮氏培养皿达到厚度0.5mm，并在50℃干燥5小时。随后，使用高度1cm、直径1cm的玻璃环限定表面积，将短乳杆菌atcc4006的冻干粉末喷雾到1cm直径的膜表面上(12.7mg/em2)。最后，将皮氏培养皿置于干燥器24小时，直至膜达到恒重。实施例4：制备含有其他粘膜粘附聚合物的otf使用以下聚合物重复实施例3：藻酸钠，透明质酸钠，阿拉伯胶，明胶以及以上的混合物。将以下益生菌的混合物施加于膜：唾液乳杆菌dsm24800，植物乳杆菌dsm24801，嗜热链球菌dsm24731，嗜酸乳杆菌dsm24735，德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌dsm24734，副干酪乳杆菌dsm24733，植物乳杆菌dsm24730，长双歧杆菌dsm24736，婴儿双歧杆菌dsm24727，短双岐杆菌dsm24732。施加益生菌混合物的浓度为10至15mg/em2。实施例5：使用涂胶机制备含有hpmc、pvp和丙二醇的otf羟丙基甲基纤维素(2.0％w/w)、聚乙烯基吡咯烷酮k15(18.0％)和丙二醇(4.0％)溶解于蒸馏水，搅拌溶液8小时。粘性溶液在室温静置过夜，以确保气泡消失。然后，使用装备有合适的刮刀的mathislte-s(m)涂胶机(mathis，oberhasli，瑞士)，铺开该溶液。铺开在硅酮基底上厚度500微米。然后，将这样铺开的溶液干燥(涂胶机提供有加热通道)，在50℃强制循环4分钟。随后，使用高度1cm、直径1cm的玻璃环限定表面积，将短乳杆菌atcc4006的冻干粉末喷雾到1cm直径的表面上(12.7mg/cm2)。然后，使用＜40℃温度下、持续8分钟的强制循环进一步干燥膜。最后，将膜切割，并包装在不透水分和氧气的小袋的个体单元中。当前第1页12