非共价组装的生物基质层的制作方法

发明领域本发明提供了一种厚度在3nm至40μm范围内的生物基质层，所述生物基质层包括浓度在0.1μm至1000μm范围内的带负电荷的聚合物(ncp)以及浓度在0.1μm至1000μm范围内的肽-聚乙二醇-缀合物，基本上由这些成分组成或者由这些成分组成。本发明进一步涉及用于组装生物基质层的方法。所述生物基质层可以装载细胞和类器官(organiods)。所述生物基质层的若干特性例如厚度、刚性和孔隙率可以通过选择所述ncp和所述肽-聚乙二醇-缀合物的类型并且在制备所述生物基质层的过程中调节其浓度来进行调节。本发明提供了带负电荷的聚合物(ncp)和肽-聚乙二醇-缀合物的组合库(combinatoriallibrary)，所述组合库可以进一步含有生物功能肽，其中所述库使得能够调节所述生物基质层的表面以实现特定细胞类型的选择性培养、生物医学装置的涂层等。此外，本发明提供了包括所述组合库中的成分的试剂盒。所述生物基质层模仿细胞外基质，并且可以用于各种生物医学应用中。
背景技术：
：：塑料瓶中的标准细胞培养无法模拟天然细胞外基质(ecm)的复杂性。已开发出各种化学涂层表面来满足特定细胞类型的需求(meiy、sahak、bogatyrevsr、yangj、hookal、kalciogluzi等人，“用于人多能干细胞克隆生长的生物材料的组合开发(combinatorialdevelopmentofbiomaterialsforclonalgrowthofhumanpluripotentstemcells)”，natmater2010年，9(9)：768-778；celizad、smithjgw、patelak、hookal、rajamohand、georgevt等人，“用于人多能干细胞扩张和多谱系分化的新型聚合物的发现(discoveryofanovelpolymerforhumanpluripotentstemcellexpansionandmultilineagedifferentiation)”，advancedmaterials，2015年，27(27)：4006-4012)。对生物材料的开发和工程设计还有其他要求，例如，再现特定于细胞类型的3d环境和天然ecm的机械性质。在广泛使用的水凝胶中，例如，基质胶(matrigel)已被用作模拟ecm的生物基质，但是无法轻易地针对特定细胞类型和组织的需要对其进行调节。ecm组成的变化已表明会影响受损肝组织的修复(klaasm、kangurt、viilj、k、minajevaa、vadik等人，“细胞外基质组成的变化会引导受损干组织的修复(thealterationsintheextracellularmatrixcompositionguidetherepairofdamagedlivertissue)”，scientificreports，2016年，6：27398)以及诱导多能干细胞的扩张(adnann、miem、haquea、hossains、mashimoy、akaiket等人，“用于小鼠诱导多能干细胞的长期培养和维持的限定拟生态基质的构建(constructionofadefinedbiomimeticmatrixforlong-termcultureandmaintenanceofmouseinducedpluripotentstemcells)”，bioconjugatechemistry，2016年)。为了开发针对特定应用特制的生物基质，已经通过化学合成(rangaa、gobaas、okaway、mosiewiczk、negroa、lutolfmp，“用于细胞命运的系统级分析的3d壁龛微阵列”(3dnichemicroarraysforsystems-levelanalysesofcellfate)，naturecommunications，2014年，5：4324；klimjr、lil、wrightonpj、piekarczykms、kiesslingll，“用于人多能干细胞的限定糖胺多糖结合基层”(adefinedglycosaminoglycan-bindingsubstratumforhumanpluripotentstemcells)，natmethods，2010年，7(12)：989-994；vegasaj、veiseho、doloffjc、mam、tamhh、bratliek等人，“组合水凝胶库使得能够识别减轻灵长类动物异物反应的物质”(combinatorialhydrogellibraryenablesidentificationofmaterialsthatmitigatetheforeignbodyresponseinprimates)，natbiotech，2016年，34(3)：345-352)，或者使用来自各种猪组织的ecm(beachleyvz、wolfmt、sadtlerk、mandass、jacobsh、blatchleymr等人，“用于高通量筛选和细胞功能系统分析的组织矩阵阵列”(tissuematrixarraysforhigh-throughputscreeningandsystemsanalysisofcellfunction)，natmeth，2015年，12(12)：1197-1204)来生成组合库，以便用于体外细胞培养应用以及体内生物相容性分析。已经开发了通过将肝素和与肝素结合肽缀合的四臂聚乙二醇(星形peg)混合形成的非共价水凝胶系统(wieduwildr、tsurkanmv、chwalekk、murawalap、nowakm、freudenbergu等人，“非共价肽-肝素水凝胶的最小肽模体”(minimalpeptidemotiffornon-covalentpeptide-heparinhydrogels)，jamchemsoc，2013年，135(8)：2919-2922)。肽具有简单(ba)n模体(其中b是碱性残基arg/lys，a是ala)，而增加重复数n将生成更硬的水凝胶。(ba)n与肝素在大量水凝胶形成过程中的相互作用与从无规卷曲到α-螺旋的转化相关，而胶凝时间(从瞬间到数个小时)取决于肽和硫酸化寡糖的选择(wieduwildr、krishnans、chwalekk、bodena、nowakm、drechseld等人,“非共价水凝胶珠作为细胞培养的微载体”(noncovalenthydrogelbeadsasmicrocarriersforcellculture)，angewcheminted，2015年，56(13)：1521-3773)。通过改变肽和硫酸化寡糖(例如硫酸葡聚糖、肝素)组分，生物材料可以针对应用例如3d细胞培养和药物释放来定制(wo2014040591a2)。此动态网络呈现出对于注射能力而言至关重要的剪切稀化和自恢复性质。小鼠体内的注入水凝胶已呈现出高生物相容性，并且不会引起不良炎症反应(tondera,c.等人(2017)，“通过免疫活性裸鼠体内的肽-寡糖相互作用交联的可注射水凝胶系统的体内检查。”(invivoexaminationofaninjectablehydrogelsystemcrosslinkedbypeptide–oligosaccharideinteractioninimmunocompetentnudemice)，adv.funct.mater.，27，27，1605189)。wo2008/124165a2公开了非共价、自组织水凝胶，所述水凝胶通过将二肽模体偶联至聚合物链而生成。还已知的是低分子量肝素以及与星形peg结合的肽。水凝胶由肽与肝素之间的非共价键形成。源自hip的肽含有序列(ka)4(noriyamaguchi等人：“多糖-聚(乙二醇)星形共聚物水凝胶的流变性表征”(rheologicalcharacterizationofpolysaccharide-poly(ethyleneglycol)starcopolymerhydrogels)，biomacromolecules，第6卷第4期，2005年5月28日(2005-05-28)，第1931-1940页；noriyamaguchi等人：“作为生产生物活性水凝胶的支架的多糖聚(乙二醇)星形共聚物”(polysaccharidepoly(ethyleneglycol)starcopolymerasascaffoldfortheproductionofbioactivehydrogels)，biomacromolecules，第6卷第4期，2005年7月(2005-07)，第1921-1930页。通常，由星形peg与肝素结合肽和肝素或低分子量肝素的缀合物组成的水凝胶的形成从以下文献中已经是已知的：us6958212b1；kyungjaejeong等人：“环境敏感水凝胶中共价与物理相互作用之间的相互影响”(interplaybetweencovalentandphysicalinteractionswithinenvironmentsensitivehydrogels)，biomacromolecules，第10卷第5期，2009年3月23日(2009-03-23)，第1090-1099页；mikhailv.t等人：“具有可控机械性质的可酶降解肝素-聚乙二醇凝胶”(enzymaticallydegradableheparin-polyethyleneglycolgelswithcontrolledmechanicalproperties)，chemicalcommunications，第46卷第7期，2009年12月16日(2009-12-16)，第1141-1143页；mikhailv.tsurkan等人：“具有双功能肽接头的模块化星形peg-肝素-凝胶”(modularstarpeg-heparin-gelswithbifunctionalpeptidelinkers)，macromolecularrapidcommunications，第31卷第17期，2010年8月16日(2010-08-16)，第1529-1533页；sealb.l.等人：“通过酶敏感共价交联键稳定的物理基质”(physicalmatricesstabilizedbyenzymaticallysensitivecovalentcrosslinks)，actabiomaterialia，第2卷第3期，2006年5月1日(2006-05-01)，第241-251页；alisonb.pratt等人：“用于原位组织工程的合成细胞外基质”(syntheticextracellularmatricesforinsitutissueengineering)，biotechnologyandbioengineering，第86卷第1期，2004年2月12日(2004-02-12)，第27-36页；brandoni.seal等人：“基于肽与多糖之间亲和相互作用的物理聚合物基质”(physicalpolymermatricesbasedonaffinityinteractionsbetweenpeptidesandpolysaccharides)，biomacromolecules，第4卷第6期，2003年11月1日(2003-11-01)，第1572-1582页；freudenbergu.等人：“一种有助于神经变性疾病的细胞替代疗法的星形-peg-肝素水凝胶平台”(astar-peg-heparinhydrogelplatformtoaidcellreplacementtherapiesforneurodegenerativediseases)，biomaterials，第30卷第28期，2009年10月(2009-10)，第5049-5060页；niet.等人：“生产含肝素的水凝胶以调节细胞响应”(productionofheparincontaininghydrogelsformodulatingcellresponses)，actabiomaterialia，第5卷第3期，2009年3月(2009-03)，第865-875页；benoit等人：“肝素功能化peg水凝胶对三维人间充质干细胞成骨分化的影响”(theeffectofheparin-functionalizedpeghydrogelsonthree-dimensionalhumanmesenchymalstemcellosteogenicdifferentiation)，biomaterials，第28卷第1期，2007年1月1日(2007-01-01)，第66-77页；brandonl.seal等人：“环境敏感拟生态聚合物基质的粘弹性性状”(viscoelasticbehaviorofenvironmentallysensitivebiomimeticpolymermatrices)，macromolecules，第39卷第6期，2006年2月23日(2006-02-23)，第2268-2274页。但是，上文讨论的常规含肝素水凝胶体积大，其制备需要大量且因此而昂贵的原料，并且难以包括生物功能肽，所述生物功能肽使得能够开发用于定制细胞培养应用的生物材料。因此，上文讨论的常规大体积水凝胶无法始终正确地模拟细胞外基质，因此其在生物医学应用中使用存在缺点。相反，基于生物基质层的组合筛选是一种开发用于定制细胞培养应用的生物材料的有前景策略。已经研究了包括不同生化线索的库，但其中只有少数能同时再现细胞外基质的相关生化、物理和结构特征。技术实现要素：为了克服常规水凝胶的障碍和缺点，本发明的目的是提供一种生物基质层，所述生物基质层具有可调节3d结构和形态以及可调节表面，以用于特定细胞类型的选择性培养、生物医学装置的涂层等。所述生物基质层应稳定、生产容易且便宜，并且所述生物基质层的成分应使得能够进行组合筛选，以开发用于定制细胞培养应用的生物材料。此目的通过提供根据权利要求1所述的生物基质层来解决。本发明的生物基质层代表基于液相-液相分离(凝聚)和糖胺多糖-肽相互作用的非共价系统，并且能够生成生物基质膜的库。糖胺多糖，特别是硫酸化糖胺多糖与生物功能肽结合，所述生物功能肽由式(i)中的r1表示。这些构建单元(buildingblocks)是以组合学方式组装的，并且影响所得3d生物基质的生化组成、机械性质和形态。可以使用本发明的生物基质层来执行定制生物材料的筛选。在细胞保留其增殖和分化潜能的情况下，特定细胞系和/或细胞类型的附着取决于ncp的类型，特别是gag的类型，以及生物功能肽的浓度。因此，本发明提供了一种生物基质层，所述生物基质层合适地模拟细胞外基质，因此就其在生物医学应用中的使用而言是有利的。此外，本发明提供一种包括组合库的构建单元的试剂盒，其中所述试剂盒使得能够筛选定制生物材料。简单的逐步移液使得能够建立夹层结构，以用于不同细胞的隔离共培养。因此，所述非共价系统是用于筛选用于单层和多层细胞培养模型的组织特异性细胞外基质模拟的理想工具。在一个实施方式中，提供了一种制备本发明的生物基质层的方法。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节生物基质层的3d结构和形态，特别是厚度、刚性和孔隙率的方法。附图说明本发明的具体实施方式将参照附图在工作实施例中描述。图1示出用于不同薄层形成方法的方案。常规水凝胶方案：将高浓度(mm)的组分混合，并将所得混合物移液到细胞培养基或缓冲溶液中，以形成粘着的水凝胶膜。生物基质层方案：将低浓度(μm)的组分混合，形成溶液中的液滴，其然后在重力作用下沉到底部并且形成多孔或粘着的水凝胶膜，具体取决于组成。所用缩写：peg：聚(乙二醇)，gag：糖胺多糖。图2示出生物基质层的形成。a)生物基质组成方案。b)常规水凝胶方案：通过将包括peg和ka7的2.5mm若丹明标记的肽-聚乙二醇-缀合物与2.5mm14kda溶液的新鲜混合物移液到pbs中发生相分离。c-d)生物基质层方案：将相等比例的包括peg和ka7溶液的50μm罗丹明标记的肽-聚乙二醇-缀合物与50μm(c)或10μm(d)的14kda肝素混合，形成薄层。e)通过将相等比例的包括peg、rgdsp和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物与50μm14kda肝素混合(各自最终浓度25μm)并在37℃下孵育来形成水凝胶薄层的时间过程。f)通过将相等比例的包括peg、rgdsp和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物与50μm14kda肝素(各自最终浓度25μm)混合制备的生物基质层的透射电子显微镜(tem)图像。g)通过将相等比例的包括peg、rgdsp和ka7的5μm肽-聚乙二醇-缀合物与5μm14kda肝素(各自最终浓度2.5μm)混合制备的生物基质层的tem图像。图3示出生物基质层形态和机械性质的分析。a)生物基质层的厚度取决于组成。通过将包括peg和ka7或者peg、rgdsp和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物与50μm不同ncp以不同摩尔比率混合来形成层。出于标记目的，使用包括peg-cwgg-ka7-rho的10％肽-聚乙二醇-缀合物。对于其他ncp，使用与14kda肝素相同的重量/体积。b)使用afm测量生物基质层的杨氏模量。以1:1的peg-肽-缀合物与ncp之间比率形成层。基质胶被用作对照和基准。实验在两个不同日进行，每个实验重复三次。误差条线示出标准偏差(n＝6)。图4示出对生物基质层上的原代人间充质基质细胞(msc)附着的分析结果。通过混合相等比例的包括peg和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物(具有不同百分比的包括peg、rgdsp和ka7的肽-聚乙二醇-缀合物)与50μm14kda肝素或相同重量/体积的其他ncp来形成层。对照表面涂覆有纤连蛋白。孵育过夜后，将细胞用鬼笔环肽-cf633(肌动蛋白)和dapi(细胞核)染色，并采集和定量荧光图像。a)在不同生物基质层和纤连蛋白涂层上培养的msc的图像(细胞核为白色，肌动蛋白为灰色)。与纤连蛋白涂层相比，对在不同生物基质层上培养的msc进行分析b)细胞计数和c)细胞面积。每孔接种1250个msc。实验在两个不同日进行，每个实验重复三次。比例尺为100μm。误差条线示出标准偏差(n＝6)。图5示出在生物基质层上的a-b)原代人脐静脉内皮细胞(huvec)和c-d)新生儿人真皮成纤维细胞(hdfn)附着的分析结果。其中示出与纤连蛋白涂层相比，不同生物基质层组成的细胞计数和覆盖面积定量。通过混合相等比例的包括peg和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物(具有不同百分比的包括peg、rgdsp和ka7的肽-聚乙二醇-缀合物)与50μm14kda肝素或相同重量/体积的其他ncp来形成层。对照表面涂覆有50μg/ml纤连蛋白。孵育过夜后，将细胞用鬼笔环肽-cf633(肌动蛋白)和dapi(细胞核)染色，并使用荧光转盘共聚焦显微镜来成像并且定量。每孔接种2500个hdfn或huvec。实验在两个不同日进行，每个实验重复三次。比例尺为100μm。误差条线示出标准偏差(n＝6)。图6示出与层粘连蛋白涂层相比，生物基质层上原代小鼠神经元祖细胞(npc)附着和增殖的分析结果。a)通过将相等比例的包括peg、rgdsp和ka7的50μm肽-聚乙二醇-缀合物与50μm不同gag混合来形成层。使用14kda肝素，以及重量相等的其他ncp。b)通过将包括peg、rgdsp和ka7的5μm肽-聚乙二醇-缀合物与5μm不同ncp混合来形成层。使用14kda肝素，以及重量相等的其他ncp。a和b)将2500个细胞接种在膜上并孵育2天，然后用edu染色用于增殖，用hoechst33342染色用于细胞数目。所有实验在两个不同日进行，每个实验重复三次。误差条线示出标准偏差(n＝6)。图7示出与层粘连蛋白涂层相比，生物基质层上原代小鼠神经元祖细胞(npc)分化的分析结果。通过将相等比例的包括peg、rgdsp和ka7的5μm肽-聚乙二醇-缀合物与5μm不同ncp混合来形成层。使用14kda肝素，以及重量相等的其他ncp。a)在具有不同gag和层粘连蛋白的生物基质层上培养6天后，神经元(map2ab)和星形细胞(gfap)分化细胞的荧光图像。细胞核用hoechst33342蓝色染色。b)标准化为层粘连蛋白的map2ab阳性细胞的速率分析。c)标准化为层粘连蛋白的gfap阳性细胞的密度分析。所有实验在两个不同日进行，每个实验重复三次。误差条线示出标准偏差(n＝6)。比例尺为50μm。星号表示统计显著性***：p≤0.01。图8示出不同细胞类型的逐层共培养(layer-by-layerco-culture)的结果。通过将包括peg、rgdsp和ka7的5μm肽-聚乙二醇-缀合物与0.7mg/ml硫酸软骨素a混合来在pbs(ph7.4)中形成底层。孵育过夜后，接种5000个hdfn并孵育过夜。作为第二生物基质层，将hdfn细胞培养基中新鲜混合的包括peg、rgdsp和ka7的2.5mm肽-聚乙二醇-缀合物与3.5mm14kda肝素(总共5μl)移液到顶部。然后接种2500个msc作为顶层。细胞用鬼笔环肽-cf633(肌动蛋白)染色，并使用荧光转盘共聚焦显微镜成像。a)逐层共培养形成方案。b)逐层组装的z-stack和侧视图。c)msc在顶层的最大投影。d)hdfn在底层的最大投影。比例尺为1mm。图9示出通过将6种不同ncp与组合肽库中的成分相结合来组装生物基质试剂盒的示例。所述试剂盒可以用于筛选本发明生物基质层的理想组成。图10示出测得的光散射，表明当添加ncp时肽-peg缀合物与不同ncp的凝聚。图11示出测得的光散射，表明peg-r1缀合物与包括不同r1肽的肝素的凝聚。图例中的数字表示包括在被试peg-r1缀合物中的不同r1肽的序列id号(seqidno)。在perkinelmerls45荧光分光光度计上在500nm下用1200秒测量含有包括peg、r1和ka7的肽-聚乙二醇-缀合物与肝素的混合物的溶液的光散射能力。将肝素添加到包括peg、r1和ka7的肽-聚乙二醇-缀合物溶液中，直到每个组分的最终浓度达到5μm。最初使用pbs缓冲液或包括peg和ka7溶液的5μm肽-聚乙二醇-缀合物(以三角形标记)来观测基线。观测到稳定基线后，在150秒的时刻添加肝素溶液。光的散射立即增加，表明存在由凝聚引起的混浊。所有测量值均表明包括peg、r1和ka7缀合物的被试肽-聚乙二醇缀合物与代表ncp的肝素的相互作用。图12示出在含有10％fbs和无血清培养基的标准培养基中扩增的原代人间充质基质细胞(msc)的分析结果。图13示出在含有10％fbs和无血清培养基的标准培养基中扩增的原代人间充质基质细胞(msc)的分析结果。(a)将msc培养3天，然后固定并用hoechst和cellmaskgreen染色。通过将5μm硫酸右旋糖酐(ds)与包括peg、rgdsp和ka7的2.5μm肽-聚乙二醇-缀合物(包括序列id号17的r1肽)以及不含r1序列的2.5μmpeg-cwgg-ka7，或者与包括peg、rgdsp和ka7的2.5μm肽-聚乙二醇-缀合物以及包括peg、yrsrkysswyvalkrk和ka7的2.5μm肽-聚乙二醇-缀合物(包括序列id号348的r1肽)混合来涂覆表面，从而形成生物基质层。使用单纯塑料进行比较。比例尺为100μm。培养1天和3天后，使用从固定细胞的荧光图像得出的细胞计数来计算倍增时间(td)。(b)与在含血清的培养基中的塑料相比，在生物基质涂层上培养的msc的td。(c)与在无血清的培养基中的塑料相比，在生物基质涂层上培养的msc的td。数据表示两次独立实验的平均值±标准偏差(sd)。通过t-试验来分析各值之间的差异，并在图中显示p值(n.s.-不显著)。图14示出在培养5代后，通过流式细胞术对人诱导多能干细胞(ipsc)进行的干性(stemness)标志物表达的分析结果。ipsc已在由5μm肝素与包括peg、pqvtrgdvftmp和ka7的2.5μm肽-聚乙二醇-缀合物(包括序列id号241的r1肽)以及包括peg、wqpprari和ka7的2.5μm肽-聚乙二醇-缀合物(包括序列id号336的r1肽)的混合物制成的a-c)生物基质层上扩增。使用由9μg/ml(基质胶)溶液制备的d-f)涂层来进行比较。a)和d)呈现相衬图像(10x)。b,c,e,f)表示分析的干性标志物tra1-60和ssea4或sox2和oct4的荧光信号强度的直方图和等值线图。比例尺为100μm。图15示出在培养5天后，通过免疫细胞化学法对源自人诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(npc)进行干性标志物表达分析的结果。a)npc已在由5μm肝素与2.5μmrgdsp(序列id号17)和2.5μmyrsrkysswyvalkrk缀合peg(序列id号348)的混合物制成的生物基质层上扩增。使用由9μg/ml(基质胶)溶液制备的涂层来进行比较。如荧光图像所示，细胞用4％pfa固定，并用hoechst33342、sox1和pax6染色。b)相对于总细胞数设置pax6和sox1阳性细胞的细胞数。比例尺为100μm。图16示出分化为神经元10天后，源自人诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(npc)的荧光图像，如用抗tuj1抗体进行的免疫细胞化学过滤(staining)所示。npc首先在由5μm硫酸皮肤素与包括peg、r1和ka7的5μm肽-聚乙二醇-缀合物的混合物组成的生物基质层上扩增，所述肽-聚乙二醇-缀合物包括表2给出的肽库中的一个或两个不同肽序列。扩增2天后，将培养基更换为图式培养基(patterningmedia)6天，然后在成熟培养基中4天。如荧光图像所示，细胞用4％pfa固定，并对抗tuj1抗体染色。所示的5张图像示出促进神经元生长的功能性r1序列。比例尺为100μm。具体实施方式本发明提供一种生物基质层，所述生物基质层包括以下各项、基本上由以下各项组成或者由以下各项组成：·浓度在0.1μm至1000μm范围内的带负电荷的聚合物(ncp)；以及·根据式(i)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-cw-间隔物-r1-间隔物-(bx)n(i)；其中-所述间隔物不存在或为二肽、三肽或四肽，其中所述二肽、三肽或四肽由甘氨酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基辛酸和3-氨基丙烯酸或其组合组成，所述间隔物优选为二肽，最优选为二肽gg；-cw不存在或者为由氨基酸半胱氨酸和色氨酸组成的二肽；-b是赖氨酸或精氨酸，x选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或天冬氨酸，并且n是选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数；-r1表示生物功能肽，并且可以不存在或者是包括5至30个氨基酸的肽；-peg以0.1μm至1000μm范围内的浓度包括在内；-r1如果存在，以0.1μm至4000μm范围内的浓度包括在内；并且-(bx)n以0.4μm至4000μm范围内的浓度包括在内。本发明在一个实施方式中提供一种生物基质层，所述生物基质层包括以下各项、基本上由以下各项组成或者由以下各项组成：·浓度在0.1μm至1000μm范围内的带负电荷的聚合物(ncp)；以及·根据式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-r1-(bx)n(ia)其中-b是赖氨酸或精氨酸，x选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或天冬氨酸，并且n是选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数；-r1表示生物功能肽，并且可以不存在或者是包括5至30个氨基酸的肽；-peg以0.1μm至1000μm范围内的浓度包括在内；-r1如果存在，以0.1μm至4000μm范围内的浓度包括在内；并且-(bx)n以0.4μm至4000μm范围内的浓度包括在内。在一个实施方式中，本发明提供一种生物基质层，所述生物基质层包括以下各项、基本上由以下各项组成或者由以下各项组成：·浓度在0.1μm至250μm范围内的带负电荷的聚合物(ncp)；以及·根据式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-r1-(bx)n(ia)其中-b是赖氨酸或精氨酸，x选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或天冬氨酸，并且n是选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数；-r1表示生物功能肽，并且可以不存在或者是包括5至30个氨基酸的肽；-peg以0.1μm至250μm范围内的浓度包括在内；-r1如果存在，以0.1μm至1000μm范围内的浓度包括在内；并且-(bx)n以0.4μm至1000μm范围内的浓度包括在内。相应地，在进一步优选实施方式中，本发明提供一种生物基质层，所述生物基质层包括以下各项、基本上由以下各项组成或者由以下各项组成：·浓度在900μm至1000μm范围内的带负电荷的聚合物(ncp)；以及·根据式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-r1-(bx)n(ia)其中-b是赖氨酸或精氨酸，x选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或天冬氨酸，并且n是选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数；-r1表示生物功能肽，并且可以不存在或者是包括5至30个氨基酸的肽；-peg以900μm至1000μm范围内的浓度包括在内；-r1如果存在，以3500μm至4000μm范围内的浓度包括在内；并且-(bx)n以3500μm至4000μm范围内的浓度包括在内。例如，当使用pbs缓冲液中包括2.5μm至7.5μm，优选地为5μm的组分的各个原液来制备本发明的生物基质层时，达到所述生物基质层中的这些组分浓度。如本文中所有实施方式中一般描述的那样发生凝聚，并且形成本发明的生物基质层，其中组分浓度相对于pbs缓冲液上清液在上文所述的范围内。发明人意外发现，当将仍为流体性的肽-聚乙二醇-缀合物和ncp构建单元移液到缓冲液或细胞培养介质中时，观测到液相-液相分离(凝聚)。此外，通过将两种生物基质组分以50μm或更低的浓度(ncp以及肽-聚乙二醇-缀合物的干溶液(stemsolution)中在混合前的浓度)(即远低于用于形成常规大体积水凝胶的浓度)混合，液相-液相分离将导致形成凝聚层液滴。液滴进行非共价凝胶化，并在孔板底部形成薄膜。为了形成根据本发明的生物基质层，需要聚合物网络，所述聚合物网络形成所述生物基质层的结构骨架。通常，所述聚合物网络可以是任何聚合物网络。优选地，所述聚合物网络能够自组装。能够自组装的聚合物网络易于生产、保证了生物基质构建单元的均匀分布，并且不需要用于形成薄层聚合物的额外步骤。在优选实施方式中，所述聚合物网络是生物基质。在一些实施方式中，所述生物基质可以包括两种或更多种聚合物成分，以便利用每种聚合物成分赋予所得生物基质的性质。适用于形成生物基质以提供聚合物网络的聚合物的非限定性示例包括聚乙烯醇(pva)、聚乙二醇、聚(丙烯酸)及其衍生物；聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚磷腈、有机硅、聚丙烯酰胺、聚乙烯基吡咯烷酮、聚-羟基乙基甲基丙烯酸酯、聚氨酯及其衍生物；或其组合。在更优选的实施方式中，适用于形成本发明的生物基质层的聚合物是聚乙二醇(peg)。peg是由环氧乙烷单体组成的低聚物或聚合物。由于不同应用需要不同的聚合物链长，因此peg是通过环氧乙烷的聚合制备的，并且可以商购得到300g/mol至10,000,000g/mol的宽分子量范围。尽管具有不同分子量的peg可用于不同应用中，并且由于链长效应而具有不同物理性质(例如粘度)，但是它们的化学性质几乎相同。根据聚合过程中使用的引发剂，也可以使用不同形式的peg，最常用的引发剂是单官能甲基醚peg或甲氧基聚(乙二醇)，简称mpeg。较低分子量的peg也可以作为较纯的低聚物获得，称为单分散、均匀或离散的。peg也可以以不同几何结构提供：·线性peg，其中环氧乙烷单体在非支化聚合物链中相互结合；·支化peg，具有三至十条从中央核心基团发散的peg链；·星形peg，具有10到100条从中央核心基团发散的peg链；以及·梳状peg，通常有多个peg链接枝到聚合物骨架上。通常包括在peg名称中的数字表示其平均分子量(例如，n＝9的peg的平均分子量为约400道尔顿，并标记为peg400)。大多数peg包括具有分子量分布的分子(即它们是多分散的)。粒径分布可以通过其重均分子量(mw)及其数均分子量(mn)进行统计学表征，所述重均分子量与所述数均分子量之间的比率称为多分散指数(mw/mn)。mw和mn可以通过质谱法测量。peg可溶于水、甲醇、乙醇、乙腈、苯和二氯甲烷，并且不溶于乙醚和己烷。在另一个实施方式中，本发明的生物基质层包括线性peg。使用线性peg具有如下优点：线性peg便宜且具有较窄的分子量分布。此外，与从较低修饰度的星形peg混合物中纯化包括4个肽的四臂星形peg相比，将具有与其结合的两个肽的线性peg链与仅具有一个肽的线性peg链分离可能更容易。然而，更适于制备本发明的生物基质层的是使用星形peg。适当地，所述星形peg的分子量在4kd至40kd的范围内，优选地在4kd至30kd的范围内，更优选地在4kd至20kd的范围内，最优选地在5kd至15kd的范围内。进一步最优选地，所述星形peg是四臂星形peg，其最适当地具有10kd的分子量。在本发明的进一步实施方式中，包括在本发明的生物基质层中的peg可以是星形peg和线性peg的混合物。当线性peg包括在本发明的生物基质层中时，所述线性peg的分子量适当地在1kd至100kd的范围内，优选地在2kd至80kd、3kd至60kd、4kd至40kd的范围内，最优选地在5kd至20kd的范围内。甚至最优选地，包括在根据本发明的生物基质层中的线性peg具有选自5kd、10kd、15kd和20kd的分子量。所述混合物中星形peg与线性peg的比率可以例如为1:1，但是可以根据要生产生物基质层的所需特性调节为任何比率。在进一步优选实施方式中，将用于制备本发明的生物基质层的peg官能化。“官能化”是指以致使官能团或部分附着的方式修饰分子。例如，可以通过引入分子来使分子官能化，所引入的分子使得分子成为强亲核体或共轭不饱和。优选地，分子例如peg被官能化成为硫醇、胺、丙烯酸酯、叠氮化物、炔或醌。更优选地，为了用在本发明生物基质层的制备中，peg被马来酰亚胺官能化、羧酸官能化、氨基官能化、叠氮化物官能化或炔烃官能化。这种类型的官能化是将peg缀合至式(i)的寡肽所必需的。因此，在最优选实施方式中，星形peg，特别是四臂peg和/或线性peg用马来酰亚胺、羧酸或氨基来官能化。已经显示，使用聚合物-肽-缀合物致使形成呈现出自组织性质的水凝胶(wo2014040591a2)。因此，在优选实施方式中，本发明的生物基质层包括寡肽和聚乙二醇(peg)的缀合物，例如四臂星形peg和寡肽或者线性peg和寡肽的缀合物。在优选实施方式中，本发明的生物基质层包括上述式(i)的肽-聚乙二醇-缀合物的缀合物。peg-寡肽缀合物适当地包括与线性或四臂星形peg偶联的一种、两种或更多种寡肽。n优选地是选自5、6、7、8、9、10和11中的整数。更优选地，n是选自5、6、7、8和9中的整数。最优选地，n是5和7。在优选实施方式中，b是赖氨酸。在进一步优选实施方式中，b是精氨酸。在优选实施方式中，x是丙氨酸或丝氨酸。在最优选实施方式中，x是丙氨酸。在进一步最优选实施方式中，x是丝氨酸。在本发明的肽中，根据以下常规列表，每个氨基酸残基均由与所述氨基酸的俗名相对应的一个字母或三个字母名称表示：(bx)n优选地选自ka11、ka9、ka7、ka6、ka5、ks7、ks6、ks5、ra7、ra6、ra5、rs7、rs6和rs5。最优选地，(bx)n选自：ka7、ka6、ka5、ks7、ks6和ks5。相应的肽序列如下表1中所示：表1：(bx)n的优选肽序列(bx)n肽序列序列id号ka5kakakakaka1ka6kakakakakaka2ka7kakakakakakaka3ka9kakakakakakakakaka4ka11kakakakakakakakakakaka5ks5ksksksksks6ks6ksksksksksks7ks7ksksksksksksks8ra5rarararara9ra6rararararara10ra7rarararararara11rs5rsrsrsrsrs12rs6rsrsrsrsrsrs13rs7rsrsrsrsrsrsrs14在本发明的进一步实施方式中，本发明的肽-聚乙二醇-缀合物包括生物功能肽r1。所述生物功能肽具有多种功能：在一个优选方面中，所述生物功能肽用于改善细胞对本发明的生物基质层的粘附，从而提供生物聚合物。在本发明的又一个方面中，所述生物功能肽可以用于促进所述生物聚合物在体内被细胞或蛋白酶的蛋白水解。它进一步再现了可溶性信号传导蛋白例如生长因子等的信号传导功能。在本发明的优选实施方式中，r1含有5至30个氨基酸。在本发明的更优选实施方式中，r1含有5至15个氨基酸。本发明生物基质层的一个特殊特征是可以将多种生物活性肽引入所得的生物材料结构中。例如，生物功能肽可以设计成细胞迁移通过组织和重塑组织(remodeltissue)所用的酶的底物(例如，作为纤溶酶、弹性蛋白酶或基质金属蛋白酶(mmp)例如胶原酶的底物)。所述生物基质层的降解特性可以通过改变生物功能肽的序列来操纵。可以制造可被胶原酶而不是纤溶酶降解，或者被纤溶酶而不是胶原酶降解的生物基质层凝胶。此外，只需改变氨基酸序列从而改变酶促反应的km或kcat或这两者，即可使生物基质层凝胶响应于所述酶而更快或更慢地降解。因此，可以制造拟生态的生物材料，因为它能够通过细胞的正常重塑特性而重塑。粘附部位但是，根据本发明最优选的方案是将r1表示的用于细胞粘附的生物功能肽(即与细胞表面上的促粘附受体结合的肽)引入本发明的生物基质层之内或之上。引入多种所述促粘附肽，例如来自纤连蛋白的rgd(序列id号：15)序列或rgds(序列id号：16)序列是简单直接的。rgd肽(序列id号：15)是纤连蛋白中与细胞表面受体整联蛋白相结合的基序。rgds序列(序列id号：16)起初被发现促进大鼠肾成纤维细胞附着于纤连蛋白。游离的rgds肽(序列id号：16)抑制细胞与纤连蛋白包被底物的附着。rgds序列(序列id号：16)也是传染物(密螺旋体属梅毒、分枝杆菌结核)的靶标。rgds(序列id号：16)也可以阻断完整红细胞的纤维蛋白原诱导的聚集以及纤维蛋白原与红细胞膜的特异性结合。在另一个优选实施方式中，生物功能肽r1的序列选自由随附序列表中公开的序列id号15至353的序列组成的群组中。这些序列包括模拟ecm和信号肽的寡肽序列。更优选地，生物功能肽r1的序列选自由随附序列表中公开的序列id号15、16、17、22、26、27、30、31、32、41、43、44、45、46、49、51、54、57、64、66、67、68、78、80、84、85、90、93、99、108、120、124、131、144、145、154、156、160、171、172、175、177、180、183、185、187、188、189、190、192、200、201、211、219、222、224、230、233、236、237、238、239、241、243、246、257、259、260、262、263、264、265、277、278、279、283、299、302、315、320、321、323、333、342、345和348的序列组成的群组中。这些序列包括粘附和生长因子模拟物。最优选地，生物功能肽r1的序列选自由随附序列表中公开的序列id号17、30、32、46、49、57、63、67、77、93、130、145、155、159、187、218、233、237、240、242、245、259、264、276、282、319、320、341、345和347的序列组成的群组中。这些序列包括对于用在本发明的生物基质层中而言有特别意义的粘附肽的核心序列以及信号肽的序列。在本发明的特别优选实施方式中，r1是rgdsp(序列id号：17)。在本发明的一个实施方式中，生物功能肽r1也可以不存在，得到式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-(bx)n(ib)其中b、x和n如式(i)所定义。当肽-聚乙二醇缀合物是式(ia)的肽-聚乙二醇缀合物以及式(ib)的肽-聚乙二醇缀合物的混合物时，在本发明生物基质层的生产方面获得了非常好的结果。因此，在最优选实施方式中，本发明提供了一种生物基质层，所述生物基质层包括式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物以及式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物。在此混合物中，可以含有多达三种不同的根据式(ia)的缀合物，所述缀合物在位置r1处含有不同的生物功能肽。所述混合物中所述式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例是可调节的，并且所述混合物中所述式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例的调节可用于控制细胞负荷，即生物基质层被细胞的表面覆盖度。所述混合物中式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例适当地在0至100mol％的范围内，适当地在0.1至99.9mol％的范围内。所述式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为0mol％是指式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物不存在，并且仅存在式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物。所述式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为100mol％是指仅存在式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物，并且式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物不存在。在优选实施方式中，所述混合物中式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例在1至99mol％或10至95mol％的范围内，更优选地在10至90mol％、20至70mol％或者25至55mol％的范围内。在更优选实施方式中，所述混合物中式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为25mol％。例如，对于msc，当使用肝素作为ncp时，25mol％的式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物致使生物基质膜上的细胞数显著增加。用100mol％的星形peg-rgdsp可以实现对肝素水凝胶的最佳附着和扩散。随着式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例增加，表面覆盖率逐渐增加。令人惊讶地，在包括硫酸软骨素作为ncp的生物基质层上实现了msc的最高表面覆盖率之一并且使用了50mol％比例的式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物(参见工作实施例)。相应地，在另一个最优选的实施方式中，在具有式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物中，式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为50mol％。适当地，生物功能肽r1通过短肽序列连接至peg和(bx)n构建单元。相应地，式(i)的肽-聚乙二醇-缀合物优选地为式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-cwgg-r1-gg-(bx)n(ii)其中b、x、n和r1如式(i)所定义。同样在式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物中，r1也可以不存在。相应地，式(i)的肽-聚乙二醇-缀合物优选地为式(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物：peg-cwgg-(bx)n(iia)其中b、x、n和r1如式(i)所定义。如针对式(i)、(ia)和(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物所描述的，在最优选实施方式中，本发明提供了一种生物基质层，所述生物基质层包括式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物以及式(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物。在此混合物中，可以含有多达三种不同的根据式(ii)的缀合物，所述缀合物在位置r1处含有不同的生物功能肽。所述混合物中式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例适当地在0至100mol％的范围内，适当地为0.1至99.9mol％。所述式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为0mol％是指式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物不存在，并且仅存在式(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物。所述式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为100mol％是指仅存在式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物，并且式(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物不存在。在优选实施方式中，所述混合物中式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例在1至99mol％或10至95mol％的范围内，更优选地为10至90mol％、20至70mol％或者25至55mol％。更优选地，所述混合物中式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为25mol％。进一步最优选地，在具有式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物中，式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物的比例为50mol％。式(i)、(ia)、(ii)和(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物的制备可以例如简单地通过将相应肽与马来酰亚胺官能化、羧酸官能化或氨基官能化的peg在允许缀合物形成的条件下混合而完成。例如，接头肽的半胱氨酸残基的巯基可以用于通过迈克尔型(michael)加成反应将肽连接至马来酰亚胺官能化的peg。或者，为了用叠氮化物修饰氨基官能化的peg，所得的聚合物将允许通过点击化学来使含炔烃的肽缀合。在本发明的特别优选实施方式中，所述生物基质层包括选自以下的肽-聚乙二醇-缀合物：上文定义的星形peg-rgdsp-ka7和10kd星形peg-ka7或其混合物，其中星形peg是分子量为10kd的四臂星形peg；或者选自以下的肽-聚乙二醇-缀合物：以上定义的星形peg-cwgg-rgdsp-gg-ka7和10kd星形peg-cwgg-ka7或其混合物，其中星形peg是分子量为10kd的四臂星形peg。对应于本发明的特别优选实施方式，所述生物基质层还包括带负电荷的聚合物(ncp)，所述带负电荷的聚合物可以是天然存在的ncp或合成ncp。根据此实施方式，存在寡糖/寡肽/peg-系统，其中寡肽(表示为r1-(bx)n，例如cwgg-r1-gg-(bx)n和cwgg-(bx)n)化学缀合到peg，并且凝胶形成通过混合寡肽-peg-缀合物和ncp进行。寡肽-peg-缀合物和ncp的相互作用也诱导了非共价大分子自组织。peg和ncp的选择可以产生各种凝胶性质，包括流动性质、胶凝条件、胶凝速度、厚度、刚性、孔隙率以及与生物活性蛋白质例如细胞和生长因子等相互作用的肽的可调亲和力。但是，通过改变肽序列基序r1-(bx)n也可以实现凝胶性质的可变性，其中根据本发明的原理，对应的生物基质层在没有r1的情况下原则上也是可能的。以这种方式，寡肽序列的灵活设计可以引发多种多样的凝胶性质，其不仅导致上述流变性质、胶凝条件、胶凝速度、厚度、刚性、孔隙率和蛋白质结合性质，而且也导致其他性质，例如由蛋白水解或其他酶活性或非酶活性例如光照敏感性引起的生物降解。包括在本发明的生物基质层中的ncp通常选自由糖胺多糖(gag)、硫酸化或磷酸化线性聚合物以及硫酸化或磷酸化环状聚合物组成的群组中。优选的是带负电荷的寡糖。根据有利实施方式，所述带负电荷的寡糖是硫酸化或磷酸化寡糖，优选地选自一组寡糖，所述一组寡糖包括肝素、硫酸葡聚糖、α-环糊精硫酸盐、β-环糊精硫酸盐、γ-环糊精硫酸盐、α-环糊精磷酸盐、β-环糊精磷酸盐、γ-环糊精磷酸盐、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。根据另一有利实施方式，所述ncp选自聚苯乙烯硫酸盐(pss)、硫酸化藻酸盐、硫酸化透明质酸、环状葡聚糖硫酸盐、环状葡聚糖磷酸盐和植酸。在优选实施方式中，所述ncp选自由聚苯乙烯硫酸盐(pss)、硫酸化藻酸盐、硫酸化透明质酸、环状葡聚糖硫酸盐、环状葡聚糖磷酸盐和植酸组成的群组中。更优选地，本发明的生物基质层进一步包括ncp，所述ncp是硫酸化糖胺多糖(gag)。gag是由重复二糖单元组成的非支化长链多糖。重复单元(角质素除外)由氨基糖(n-乙酰基葡糖胺或n-乙酰基半乳糖胺)以及糖醛糖(葡糖醛酸或艾杜糖醛酸)或半乳糖组成。gag具有高度极性，并且吸水。gag在分子质量、二糖结构和硫酸化方面具有高度异质性。根据核心二糖结构，gag分为四组：肝素/硫酸乙酰肝素以及硫酸软骨素/硫酸皮肤素、硫酸角质素和透明质酸。在优选实施方式中，本发明的生物基质层包括选自包括以下项、基本上由以下项组成或者由以下项组成的群组中的ncp：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖和透明质酸。在尤其优选的实施方式中，本发明的生物基质层包括选自包括以下项、基本上由以下项组成或者由以下项组成的群组中的ncp：肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖和透明质酸。在本发明的优选实施方式中，ncp是肝素。肝素来源于猪肠粘膜或牛肺组织。肝素优选地具有药用品质。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸乙酰肝素。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸软骨素。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸皮肤素。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸角质素。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸葡聚糖。在进一步优选的实施方式中，ncp是透明质酸或硫酸化透明质酸。在进一步优选的实施方式中，ncp是硫酸化藻酸盐。在进一步优选的实施方式中，ncp是环状葡聚糖硫酸盐。在进一步优选的实施方式中，ncp是环状葡聚糖磷酸盐。在进一步优选的实施方式中，ncp是植酸。肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、聚苯乙烯硫酸盐(pss)、硫酸化藻酸盐、硫酸化透明质酸、环状葡聚糖硫酸盐、环状葡聚糖磷酸盐或植酸适当地具有在4kd至600kd范围内的分子量。优选的是使用药用品质的肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖或透明质酸。本发明的生物基质层在结构上不同于常规水凝胶，并且通过使用包括0.1μm至1000μm范围内的低浓度构建单元的原液形成。因此，peg以在0.1μm至250μm的范围内，优选地在0.1μm至125μm或者0.1μm至75μm的范围内，更优选地在0.1μm至75μm或者0.1μm至50μm的范围内的浓度包括在原液中。最优选地，peg以2.5μm的浓度或25μm的浓度，或者甚至最优选地以在1μm至10μm范围内的浓度被包括在原液中。适当的原液包括5μmpeg。r1如果存在，以在0.1μm至1000μm的范围内，优选地在0.1μm至500μm或者0.1μm至300μm的范围内，更优选地在0.1μm至300μm或者0.1μm至200μm的范围内的浓度包括在原液中。最优选地，r1以10μm的浓度或者以100μm的浓度被包括在内。适当的原液包括5μmr1。(bx)n以在0.4μm至1000μm的范围内，优选地在0.4μm至750μm或者0.4μm至500μm的范围内，更优选地在0.4μm至250μm或者0.4μm至100μm的范围内的浓度包括在原液中。最优选地，(bx)n以10μm或者100μm的浓度被包括在内。适当的原液包括5μm(bx)n。ncp以在0.1μm至250μm的范围内，优选地在0.1μm至125μm或者0.1μm至75μm的范围内，更优选地在0.1μm至75μm或者0.1μm至50μm的范围内的浓度包括在内。最优选地，ncp以0.1μm至25μm范围内的浓度包括在内。适当的原液包括5μmncp。所述原液可以在任何适当的缓冲溶液中制备。根据本发明优选的是使用磷酸盐缓冲盐水(pbs)制备所述原液。肽-聚乙二醇-缀合物和ncp以预定比例的肽-聚乙二醇-缀合物：ncp存在于本发明的生物基质层中，所述预定比例的范围为1:100至100:1，优选地为1:90至90:1、1:80至80:1、1:70至70:1或者1:60至60:1，更优选地为1:50至50:1、1:40至40:1、1:30至30:1、1:20至20:1或者1:10至10:1，最优选地为1:9至9:1、1:8至8:1、1:7至7:1、1:6至6:1、1:5至5:1、1:4至4:1、1:3至3:1、1:2至2:1，特别优选地为1:1或者1:2至2:1。肽-聚乙二醇-缀合物：ncp的比率已经被发现会影响生物基质层的孔隙率。为了调节生物基质层的孔隙率，肽-聚乙二醇(peg)-缀合物为：ncp的比率通常在上述范围内变化，其中ncp的比例越低，生物基质层的孔隙率越高。可以通过降低生物基质层中ncp的比例来生成高度多孔的薄层膜。例如，通过混合50μmncp和50μm肽-聚乙二醇-缀合物(致使混合物中含有25μmncp和25μm肽-聚乙二醇-缀合物)以形成连贯的膜(coherentfilm)，将ncp浓度降低至10μm会生成高度多孔的结构。改变肽-聚乙二醇-缀合物：ncp的比率也可以改变胶凝速度。凝胶速度的提高会致使生物基质层的孔隙率增大。凝胶速度还受在位置r1处包括生物功能肽基序的影响。r1(例如整联蛋白结合基序rgdsp(序列id号16))包括/存在于肽-聚乙二醇-缀合物中会降低凝胶速率，因此生成较少孔的生物基质层。选择ncp的类型会进一步影响多孔结构的形成。例如，当肝素被加速凝胶化的硫酸葡聚糖取代时，得到高度多孔结构的生物基质层。例如，将50μm硫酸葡聚糖和50μm星形-peg-ka7混合会产生高度多孔的生物基质层膜。凝胶化速率例如可以通过使用以下混合物来提高：式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ia)化合物的比例为至少10％；和/或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中式(ii)的化合物的比例为至少10％。通过选择肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的类型，还可以针对特定应用或用途来调整生物基质层。如果需要产生对细胞粘附呈惰性的生物基质层，则在水凝胶中仅使用其中不存在r1的式(ib)或式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物。如果要为细胞提供粘附力，则应混入至少10％的其中存在r1的式(i)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物。对于某些生物医学应用，也可能产生生物基质层，其中肽-聚乙二醇(peg)-缀合物由100％的其中存在r1的式(i)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物组成。生物基质层膜的刚度可以通过多个参数来调节，例如，ncp类型、肽-聚乙二醇-缀合物:ncp比率，以及r1和/或(bx)n位置处肽序列的延长。有意思的是，当使用其中存在r1的肽-聚乙二醇-缀合物时，ncp浓度呈现出对水凝胶膜刚度的强烈影响。例如，增加肝素浓度将得到刚度更高的水凝胶。当使用不存在r1的肽-聚乙二醇-缀合物时，未观察到此效果。此外，r1(其被定义为由5至30个氨基酸组成的肽)的延长也会影响刚度。r1中包含的氨基酸数量越少，生物基质层的刚度越高。将肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比例在100:1到1:100的范围内改变也可以实现刚度的调节；其中硫酸化寡糖的比例越高，生物基质层的刚度越高。刚度也可以通过增加或降低胶凝化速率来调节，其中降低胶凝化速率会导致更大刚度的生物基质层。如上所述，较慢的凝胶化会导致形成更致密的膜，如上所述，因此形成更大刚度的生物基质层。将肝素用另一种ncp(例如硫酸软骨素a和硫酸皮肤素)会降低凝胶化速率，从而增加生物基质层的刚度。生物基质层的刚度可以进一步通过选择肽-聚乙二醇-缀合物中(bx)n肽的氨基酸x来调节，尤其是关于此位置处氨基酸的负电荷；其中x的所选氨基酸的负电荷越高，则生物基质层的刚度越强。生物基质层的刚度可以进一步通过选择肽-聚乙二醇-缀合物中的基序(bx)n的重复数n的数目来调节，其中n越大，生物基质层的刚度越强。薄层基质的刚度可以通过选择(bx)n肽中的氨基酸b来进一步调节。在b位置使用精氨酸会形成刚度较大的生物基质层。如果需要较软的生物基质层，则b优选为赖氨酸。通过选择肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的类型，还可以调节生物基质层的刚度。可以在水凝胶中使用/引入以下类型的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物，以调节生物基质层的刚度：·式(i)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物，其中存在r1，·式(ia)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物，其中存在r1，·式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(i)缀合物的比例为至少10％，·式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中所述混合物中式(ii)缀合物的比例为至少10％，·式(ib)或式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物，其中r1不存在，其中r1的存在通常导致刚度降低。在本发明的另一个实施方式中，优选生物基质层，所述生物基质层包括浓度为0.1μm至1,000μm的范围内，例如0.1μm至250μm，优选地在0.1μm至125μm或者0.1μm至75μm的范围内，更优选地在0.1μm至75μm或者0.1μm至50μm范围内的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物。最优选地，peg以2.5μm的浓度或25μm的浓度，或者甚至最优选地以在1μm至10μm范围内的浓度被包括在内。在另一个优选实施方式中，peg以900μm至1,000μm范围内的浓度包括在内。本发明的生物基质层的一大优势是其孔隙率和刚度可以适应其预期功能，即，既可以模拟ecm的蛋白质和ncp部分，又可以提供用于粘附和生长/分化细胞的ecm。根据本发明的生物基质层与常规水凝胶的不同之处特别在于其厚度。所述生物基质层的厚度通常在3nm至40μm，优选3nm至1μm或者3nm至500nm，更优选3nm至100nm，最优选3nm至50nm或者3nm至10nm的范围内；并且可以通过选择ncp的类型、选择肽-聚乙二醇(peg)-缀合物和ncp的浓度以及通过改变肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比例来进行调节。所述生物基质层的厚度可以进一步通过控制施加到待涂覆区域的原料的体积，例如施加到96孔板的孔上的原料的体积来调节。对于ncp的类型，可以通过使用硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖或透明质酸替代肝素来获得3nm至40μm范围内的薄水凝胶。缓冲溶液中肽-聚乙二醇(peg)-缀合物和ncp的浓度通常选自0.1-250μm的范围内，最优选peg为1-10μm、ncp为0.1-25μm的范围内。所述肽-聚乙二醇(peg)-缀合物和ncp的浓度越高，所得生物基质层的厚度越高。步骤iii)的缓冲溶液中肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比率通常在1:100至100:1之间变化，优选在1:6至6:1范围内变化，最优选在1:2至2:1范围内变化，其中ncp的比例越低，所得生物基质层越薄。具有本文所描述的组成的根据本发明的生物基质层具有若干有利特性。在一个方面中，所述生物基质层对去离子水、dmf、dmso、乙醇、1mhcl和1mnaoh具有高度耐性。本发明的生物基质层呈现出非常好的生物相容性，并且具有明确的化学组成的优势。因此，本发明的生物基质层可广泛应用于生物医学中。本发明生物基质层的另一个优势是，生物基质层的细胞负荷/表面覆盖率可以调节，确切地说，可以通过以下方式增加：·选择用于产生生物基质层的ncp的类型；和/或·使用式(i)、(ia)或者式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物；或者·使用式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(i)化合物的比例为至少10％，和/或·使用式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ii)化合物的比例为至少10％；其中细胞对所述生物基质层的表面覆盖率通过增加式(i)、(ia)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的含量或比例(即通过存在生物功能肽r1)而增加。肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素以及透明质酸有助于增加细胞负荷和细胞对生物基质层的表面覆盖率。当根据本发明的生物基质层包括细胞时，所述细胞通常为哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌或酵母细胞，优选为哺乳动物细胞，最优选为人细胞或人细胞系。在一个特别优选的实施方式中，所述细胞是人干细胞，更优选地为人原代干细胞，或最优选地为人源性ips衍生干细胞。可以包括在生物基质层之中或之上的细胞的示例是人成纤维细胞、间充质基质细胞(msc)、神经元祖细胞(npc)或人脐静脉内皮细胞(huvec)。本发明的另一大优势是，本发明生物基质层的所有构建单元都是可变的，因此形成了用于特定用途生物基质层构建的库的基准。例如，通过从所述库中选择构建单元，可以形成生物基质层，所述生物基质层能够通过粘附在生物基质层的表面上而结合特定的细胞类型或细胞系。本发明的生物基质层进一步适于促进细胞存活、控制细胞增殖，保持干性并引导细胞分化成特定的细胞谱系。因此，在另一个最优选的实施方式中，本发明提供了生物基质层的构建单元的组合库，其包括以下项、基本上由以下项组成或者由以下项组成：·ncp，·peg，·(bx)n肽，其中b、x和n如本文所定义，以及·r1肽，其中r1如本文所定义。所述库适合以在pbs(磷酸盐缓冲盐水)中的原液的形式提供。更优选地，提供了根据前述权利要求中的任一项所述的生物基质层的构建单元组合库，包括在pbs缓冲液中的所述构建单元的单个原液，包括以下项、基本上由以下项组成或者由以下项组成：·2.5μm至7.5μm，优选5.0μm的ncp，选自由肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖和透明质酸组成的群组中，·2.5μm至7.5μm，优选5.0μm的peg，优选4kd至40kd的四臂星形peg；·2.5μm至7.5μm，优选5.0μm的(bx)n肽，选自由序列id号1至14的肽组成的群组中，以及·2.5μm至7.5μm，优选5.0μm的r1肽，选自由序列id号15至353的肽组成的群组中。所述原液的优势在于，通过混合合适量的单个原液可以容易地制备本发明的生物基质层。就此而言，合适量是指发生凝聚和基质层的形成。在另一个优选实施方式中，本发明提供了一种用于生产本发明的特定用途生物基质层的试剂盒，所述试剂盒包括在pbs中的原液，包括2.0μm至7.5μm的·ncp，·peg，·(bx)n肽的库，其中b、x和n如本文所定义，·r1肽的库，其中r1如本文所定义，以及·使用上述试剂生产本发明的特定用途的生物基质层的说明。对于上述库和试剂盒，ncp优选地选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、透明质酸、聚苯乙烯硫酸盐(pss)、硫酸化藻酸盐、硫酸化透明质酸、环状葡聚糖硫酸盐、环状葡聚糖磷酸盐和植酸，最优选选自肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、硫酸葡聚糖、透明质酸，peg是分子量为4kd至40kd，最优选地为10kd的本文所定义的线性peg或星形peg，优选地为四臂星形peg。所述(bx)n肽的库优选地由序列id号1至14的肽组成。所述r1肽的库优选地由序列id号15至353的肽组成。在优选实施方式中，r1肽的库不包括肽rgdsp(序列id号17)。因此，在最优选实施方式中，所述r1肽的库由根据序列id号15、16、18至353的肽组成。所述库和试剂盒还可以用于筛选本发明生物基质层的理想组成，特别适于生物基质层期望目的或用途。期望目的或用途是例如调节或制备特别适于粘附特定细胞或细胞系(例如人细胞或人细胞系、特定人干细胞，优选人原代干细胞，或者最优选地，人源性ips衍生干细胞)的生物基质层。例如，可以使用本发明的库或试剂盒筛选用于粘附人成纤维细胞、间充质基质细胞(msc)、神经元祖细胞(npc)或人脐静脉内皮细胞(huvec)的生物基质层的理想组成。另一个期望目的或用途是调节或制备特别适于涂覆生物医学装置以改善生物医学装置的生物相容性的生物基质层。所述筛选可以例如作为高通量筛选以hts格式执行。例如，所述生物基质层的形成可以在孔板中进行，例如96孔板或384孔板，其中每个孔将装载有选自本发明的库中的构建单元的不同混合物。在本发明的另一个实施方式中，所述生物基质层能够形成3d生物基质层，所述3d生物基质层特别适于提供用于靶向释放治疗试剂的生物基质层，其中治疗试剂通过相应方法被包裹或包封在上述生物基质层内。所使用的每种治疗试剂的群组优选地包括细胞、细胞球(例如间充质球(mesensphere)、神经球(neurosphere))或类器官或形态发生素或活性药物成分。当根据本发明的生物基质层包括作为治疗试剂的细胞时，所述细胞如上文所定义。所述类器官是体外产生的呈现出真实显微解剖学的器官的三维小型化和简化版本。类器官源自来自组织的一个或数个细胞、胚胎干细胞或诱导多能干细胞，这些细胞由于其自我更新和分化能力而能够在三维培养物中自我组织。本发明的3d生物基质层可以提供便利的体外模型，用于在没有外源底物的情况下研究复杂的细胞-细胞以及细胞-基质相互作用，并且可能有益于再生医学策略的发展，这些在使用依赖于单层细胞生长的常规细胞培养方法时是无法实现的。可以在本发明的3d生物基质层中形成并维持不同大小的间充质干细胞(msc)球体或“间充质球”。间充质球的3d培养已经显示没有呈现出细胞坏死或分化的迹象，而分化培养基中的间充质球则呈现出与基于成骨和生脂定型(commitment)的组织学标志物的常规2d培养方法相似的分化。此外，当接种到组织培养板上时，已经在生长培养基的间充质球内培养的细胞恢复了在粘附单层中连续培养的细胞的典型形态，并保留了其多谱系分化潜能的能力。实际上，与单层相比，恢复的msc中明显可见更稳定的基质矿化和脂质液泡含量，表明以3d球体形式培养的细胞的增强分化。因此，用于间充质干细胞的3d培养系统可以规避与常规单层培养相关的局限性，并增强多能细胞的分化潜能(baraniakp.r.，mcdevittt.c.，“间充质干细胞球体在悬浮液中的无支架培养能保留多谱系潜能(scaffold-freecultureofmesenchymalstemcellspheroidsinsuspensionpreservesmultilineagepotential)”，celltissueres,2012年3月，347(3):701-11)。本发明的3d生物基质层可以进一步提供产生神经球的便利环境。神经球是由自由漂浮的神经干细胞簇构成的培养系统。神经球提供了一种在体外研究神经前体细胞的方法。公认的(putative)神经干细胞悬浮在缺乏粘附底物但含有必要生长因子例如表皮生长因子和成纤维细胞生长因子的培养基中。这使得神经干细胞能够形成特征性的三维簇。神经球的典型用途是在神经球方法中。形态发生素是一种物质，它的非均匀分布控制着形态发生或图式形成过程中的组织生长图式，从而确定组织内各种特定细胞类型的位置，其中所述形态发生或图式形成过程是发育生物学的核心过程之一。更具体地，形态发生素是信号传导分子，其直接作用于细胞以根据其局部浓度产生特异性细胞响应。通常，形态发生素是由源细胞产生的，并在初期发育过程中扩散通过胚胎周围的组织，从而建立浓度梯度。这些梯度驱动非特化干细胞分化为不同细胞类型的过程，最终形成身体的所有组织和器官。形态发生的控制是进化发育生物学的核心要素。适用于本发明的生物基质层的哺乳动物形态发生素包括视黄酸、音猬因子(shh)、转化生长因子-β(tgf-β)/骨形态发生蛋白质(bmp)和wnt/β-连环蛋白。发育过程中，视黄酸(维生素a的代谢产物)被用来刺激机体后端的生长。视黄酸与视黄酸受体结合，所述视黄酸受体作为转录因子来调节同源异形基因(hoxgene)的表达。胚胎暴露于外源维a酸，尤其是在第一孕期，会导致先天缺陷。tgf-β族成员参与背腹图式形成和某些器官的形成。tgf-β与ii型tgf-β受体结合会添补i型受体，从而使后者发生转磷酸化。i型受体激活smad蛋白，而smad蛋白又起调节基因转录的转录因子的作用。音猬因子(shh)是形态发生素，对于发育中的胚胎的早期图式形成至关重要。shh与补片(patched)受体结合，所述补片(patched)受体在没有shh的情况下抑制平滑(smoothened)受体。被激活的平滑受体进而使gli1、gli2和gli3移位到细胞核中并且在所述细胞核中激活靶基因例如ptch1和engrailed。当本发明的生物基质层包括作为治疗试剂的活性药物成分时，所述活性药物成分通常选自抗癌化合物、抗凝化合物、抗炎化合物、免疫抑制化合物、治疗性抗体、诊断试剂、激素、生长因子、细胞因子、作为生长因子抑制剂的小分子、作为细胞因子抑制剂的小分子、用于生长因子的适体抑制剂以及用于细胞因子的适体抑制剂。在一个特别优选的实施方式中，所述活性药物成分选自阿霉素、紫杉醇、环孢菌素a、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素、抗vegf抗体以及抗tnf-α抗体。当根据本发明的生物基质层包括作为治疗试剂的形态发生素时，所述形态发生素通常选自tnf-α、tgf-β、ifn-γ、fgf、vegf和egf。水凝胶对于药物(特别是蛋白质治疗剂)的输送特别有用。水凝胶是生物相容性的，且可为蛋白质提供温和的环境，以将蛋白质的变性最小化。所述蛋白质通过天然蛋白质与ncp之间或共价偶联蛋白质-(bx)n肽与ncp之间的静电相互作用而被物理包裹在凝胶中或与凝胶结合。通过生物基质的降解或通过静电相互作用给出的释放动力而释放蛋白质。可降解的r1可以引入到形成水凝胶的peg聚合物中，并且通过凝胶内片段的降解，蛋白质将随着凝胶降解而被释放出来。本发明进一步涉及用于制备根据本发明的生物基质层的方法。在第一方面中，所述用于制备根据本发明的生物基质层的方法包括以下步骤：i)制备式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物以及任选存在的式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物：peg-r1-(bx)n(ia),peg-cwgg-r1-gg-(bx)n(ii)其中-b是赖氨酸或精氨酸，x选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，并且n是选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20中的整数；并且-r1可以不存在，或者是包括5至30个氨基酸的肽；ii)将所述聚乙二醇(peg)-缀合物与ncp混合；iii)将步骤ii)中的混合物添加到适当缓冲溶液或培养基中，其中所述式(ia)或式(ii)的聚乙二醇(peg)-缀合物以在0.1μm至250μm范围内的浓度包括在所述缓冲溶液中，并且所述ncp以0.1μm至250μm范围内的浓度包括在所述缓冲溶液中；以及iv)通过凝胶化来形成所述生物基质层，并且任选地，当所述水凝胶包括细胞或类器官时，还包括以下额外步骤：v)将所述细胞或类器官接种到通过上述步骤iv)中获得的生物基质层上；以及vi)孵育所述生物基质层和所述接种的细胞或类器官以促进细胞粘附于所述生物基质层。应认识到，上文针对根据本发明的生物基质层描述的优势和有利实施方式同样适用于制备所述生物基质层的方法，使得其可参照上文。在另一个实施方式中，所述肽-聚乙二醇(peg)-缀合物是式(ib)的缀合物：peg-(bx)n(ib)其中b、x和n如本文所定义。在另一个实施方式中，所述缀合物是式(iia)的缀合物：peg-cwgg-(bx)n(iia)其中b、x和n如本文所定义。如上文针对本发明的生物基质层所述，所述肽-聚乙二醇-缀合物也可以是具备本文所描述的适当比例的式(ia)的肽-聚乙二醇-缀合物和式(ib)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物，或者式(ii)的肽-聚乙二醇-缀合物和式(iia)的肽-聚乙二醇-缀合物的混合物。在这些混合物中，可以分别含有多达三种不同的根据式(i)、(ia)、(ii)或(iia)的缀合物，所述缀合物在位置r1处含有不同的生物功能肽。步骤ii)：将所述聚乙二醇(peg)-缀合物与ncp混合以及步骤iii)：将步骤ii)的混合物添加到适当缓冲溶液或培养基中是非常简单的过程，并且优选地在水溶液、缓冲液或细胞培养基中进行。适当的缓冲液是例如pbs(磷酸盐缓冲盐水)。在最优选的实施方式中，本发明提供了制备生物基质层的方法，所述方法包括以下步骤：i)制备式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物以及任选存在的式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物：peg-r1-(bx)n(ia),peg-cwgg-r1-gg-(bx)n(ii)其中-peg是10kd的四臂星形peg；-(bx)n是选自序列id号：1至14的肽，并且-r1可以不存在或者是选自序列id号：15至353的生物功能肽；ii)将所述肽-聚乙二醇(peg)-缀合物和ncp以最终浓度的100倍溶解在所述缓冲液中；iii)将步骤ii)中的溶液稀释并且混合在适当缓冲溶液中，其中式(ia)或式(ii)的聚乙二醇(peg)-缀合物和所述ncp各自以在0.1μm至250μm范围内的浓度包括在所述缓冲溶液中；以及iv)通过凝胶化来形成所述生物基质层，并且任选地，当所述水凝胶包括细胞或类器官时，还包括以下额外步骤：v)将所述细胞或类器官接种到通过上述步骤iv)中获得的生物基质层上；以及vi)孵育所述生物基质层和所述接种的细胞或类器官以促进细胞粘附于所述生物基质层。在一个替代实施方式中，所述方法可做改变，以使得在第一步中制备不含生物功能肽r1的基质，并且在第二步中，通过添加包括生物功能肽的肽来进行后改性，其中所述被添加的肽选自r1-(bx)n、cw-r1-gg-(bx)n和cwgg-r1-gg-(bx)n。所得的生物基质层与通过本发明的原始方法获得的生物基质层相当。生物基质层的形成(即凝胶化)可以在0℃至50℃范围内的温度下进行。优选地，凝胶化在10℃至45℃、20℃至40℃或者30℃至35℃范围内的温度下进行。最优选地，凝胶化在室温至37℃范围内的温度下进行。如上所述，本发明的生物基质层的若干特性，例如厚度、孔隙率、刚度和细胞负荷，可以通过选择不同的构建单元来产生生物基质层来进行调节。相应地，本发明的确提供了用于调节本发明的生物基质层的厚度、孔隙率、刚度和细胞负荷的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种用于调节生物基质层的厚度的方法，所述厚度优选地在3nm至40μm的范围内，所述方法包括：·选择用于产生生物基质层的ncp的类型；和/或·选择肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的浓度；和/或·将步骤iii)的缓冲溶液中的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比例在1:1至1:25的范围内改变；其中ncp的比例越低，所得的生物基质层越薄；和/或·控制施加到待涂覆区域的原料的体积，其中被施加到特定区域的所述原料越多，生物基质层的厚度越大。例如，可以通过使用用于制备生物基质层的硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸肝素、硫酸皮肤素或透明质酸来减小生物基质层的厚度。在另一个实施方式中，本发明提供了一种通过以下方法来调节生物基质层的孔隙率的方法：·将步骤iii)的缓冲溶液或培养基中的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比率在1:100至100:1之间的范围内改变；其中，硫酸化寡糖的比例越低，生物基质层的孔隙率越高；和/或·增加或降低胶凝化速率，其中增加胶凝化速率导致生物基质层提高的孔隙率。凝胶化速率可以例如通过以下方式来增加：·选择硫酸化寡糖的类型，例如硫酸葡聚糖；和/或·使用式(i)、(ia)或者式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物；或者·使用式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ia)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ia)化合物在所述混合物中的比例为至少10％，和/或·使用式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中式(iia)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ii)化合物在所述混合物中的比例为至少10％。在另一个实施方式中，本发明提供了一种调节生物基质层的刚度的方法，所述方法包括：·选择用于产生生物基质层的硫酸化寡糖的类型；和/或·选择(bx)n肽-聚乙二醇-缀合物内位置x处的氨基酸，尤其是针对其负电荷选择；其中x的所选氨基酸的负电荷越高，生物基质层的刚度越强；和/或·选择所述肽-聚乙二醇-缀合物内的基序(bx)n的重复数n；其中n越大，生物基质层的刚度越强；和/或·将步骤iii)的缓冲溶液或培养基中的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物:ncp的比例在100∶1至1∶100之间的范围内改变；其中ncp的比例越高，生物基质层的孔隙率越高；和/或·增加或降低胶凝化速率，其中降低胶凝化速率导致生物基质层更强的刚度。在另一个实施方式中，本发明提供了一种调节生物基质层的刚度的方法，所述方法包括：·使用硫酸软骨素或硫酸皮肤素产生生物基质层；和/或·使用式(i)、(ia)或者式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物；或者·使用式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ia)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ia)化合物的比例为至少10％，和/或·使用式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ii)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ii)化合物的比例为至少10％。在另一个实施方式中，本发明提供了一种调节生物基质层的细胞负荷/表面覆盖率的方法，所述方法包括：·选择用于产生生物基质层的硫酸化寡糖的类型；和/或·使用式(i)、(ia)或者式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物；或者·使用式(ia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(ib)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ia)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ia)化合物的比例为至少10％，和/或·使用式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物与式(iia)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的混合物，其中存在r1的式(ii)化合物的比例在0至100％之间改变，其中出于细胞粘附的目的，所述式(ii)化合物的比例为至少10％。其中细胞对所述生物基质层的表面覆盖率通过增加式(ia)或式(ii)的肽-聚乙二醇(peg)-缀合物的含量或比例来增加。所述生物基质层的细胞负荷/表面覆盖率可以通过使用肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素或透明质酸生产生物基质层来增加。在另一个方面中，本发明提供了一种制备包括细胞或类器官的生物基质层的方法。在这种情况下，所述方法进一步包括以下额外步骤：v)将所述细胞或类器官接种到通过上述步骤iv)中获得的生物基质层上；以及vi)孵育所述生物基质层和所述接种的细胞或类器官以促进细胞粘附于所述生物基质层。替代地，所述细胞或类器官不添加到已经形成的生物基质层中，而是在制备根据本发明的生物基质层的过程中已经添加。适当地，细胞随后即已经包含在所述培养基中，例如步骤iii)的细胞培养基中。在另一个方面中，本发明提供了一种制备包括细胞或类器官的生物基质层的方法，其中所述方法视情况包括以下进一步步骤：vii)培养所述含细胞或类器官的生物基质层。所述含细胞或类器官的生物基质层的培养通常在培养基中的液体培养物中进行，其支持生长和发育或者维持粘附或包封的细胞或类器官的生存力。培养通常在0℃至50℃范围内，优选地在10℃至45℃、20℃至40℃或者30℃至35℃范围内的温度下进行。最优选地，培养在室温至37℃范围内的温度下进行，这对于维持粘附或包封的细胞的生存力和/或对于其生长和进一步发育是最佳的。当将细胞提供到生物基质上时，将1-106个细胞/cm2，优选10至106个细胞/cm2，更优选102至105个细胞/cm2，最优选103至105个细胞/cm2接种到本发明的生物基质层上。当将细胞包封入生物基质内时，使用1-1010个细胞/ml，优选10至109个细胞/ml，更优选102至108个细胞/ml，最优选103至107个细胞/ml来进行细胞包封。典型培养基(细胞在其中生长并提供细胞用于接种到本发明的生物基质层之上或之中)是dmem(杜尔贝科改良伊格尔培养基，gibco)，优选地含有10％fbs(胎牛血清)的dmem。在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于生产含有细胞的多层生物基质的方法，其中使用自组装方法通过逐步移液将不同类型的细胞物理隔离。所述方法包括以下步骤：i)形成第一生物基质层膜；ii)将第一类型的细胞接种到第一生物基质层膜上，iii)对接种的细胞进行孵育以形成第一细胞层，iv)在所述第一细胞层之上形成第二生物基质层膜，v)孵育，例如孵育过夜，vi)将第二类型的细胞接种到第二生物基质层膜上以形成夹层结构，vii)培养所述夹层结构，例如，培养一天。液-液相分离机制使得能够将第一和第二生物基质层膜的构建单元简单地直接移液到细胞培养基中。夹层的形成不涉及化学反应，并且对细胞产生最小的物理应力。如本文的工作实施例所示，每种细胞类型在保留其特征表型的同时扩增。由此可以证明生物基质层在夹层细胞培养方法中的成功应用。不同细胞在不同层中的隔离对于在体内协调其生物学功能非常重要。使用简单移液步骤的逐层方法允许构建各种模型，不仅在更接近天然的共培养环境中而且还可以与显微镜成像兼容。在本发明的另一方面，提供了一种制备生物基质层的方法，其中所述生物基质层包括形态发生素或活性药物成分。可以在上述方法的步骤ii)或iii)中加入形态发生素或活性药物成分。所述活性药物成分通常以0.01μg/l至2.0g/l，优选在0.1μg/l至1.5g/l、1.0μg/l至1.0g/l或者10μg/l至0.5g/l范围内，更优选在0.1mg/l至0.1mg/l范围内，最优选在1.0mg/l至0.01g/l范围内的最终浓度包含在步骤iii)的混合物中。本发明进一步提供了可通过根据本发明的方法获得的生物基质层。应认识到，上文针对根据本发明的生物基质层和方法描述的优势和有利实施方式同样适用于可通过本发明方法获得的生物基质层，使得其可参照上文。在又一个方面中，本发明提供了根据本发明的生物基质层在生物医学应用中的用途，例如神经假体(neuroprostheses)、生物传感器、神经移植物、细胞培养、组织或细胞存储、药物递送和生物医学装置的涂层。本发明的非共价生物基质层是例如用于筛选单层和多层细胞培养模型的组织特异性细胞外基质模拟的理想工具。本发明通过16个附图和19个工作实施例更详细地描述。实施例1：肽合成本文所提及的所有肽均是通过在自动固相肽合成仪(respepsl，intavis，德国科隆)中利用固相上的标准化芴甲氧基羰基化学(fmoc化学)以2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸盐活化(hbtu活化)产生。为了获得良好的肽质量，每个氨基酸以五倍过量偶联两次，其中所有非反应性氨基均被乙酸酐保护。为了将肽从树脂割离，将树脂用三氟乙酸(tfa)三异丙基硅烷(tis)/水/二硫苏糖醇(dtt)的混合物处理一个半小时，其中这些组分以90(v/v):2.5(v/v):2.5(v/v):2.5(m/v)的比率存在。将肽溶解在含有2mg/ml三(2-羧乙基)膦(tcep)的水中。通过反相高压液相色谱(uplc)在制备型hplc装置(prostartm，agilenttechnologies，美国圣克拉拉)上进行肽纯化，所述装置配有制备型c18柱(axiatm1001a，粒度10μm，250×30mm，phenomenextorranceusa)。通过以20ml/min使用5％至100％溶剂b的梯度从色谱柱上洗脱所述肽，其中溶剂a是0.1％三氟乙酸(tfa)的水溶剂，并且溶剂b是0.1％tfa和5％水的乙腈溶剂。通过设有分析型c18柱(aquitytmuplcbehc18，粒度1.7μm，50×2.1mm，waters,milford,mass.,usa)的分析型反相超高压液相色谱(带有紫外检测器的uplcaquitytm，waters,milfordmass.,usa)，使用等梯度和电喷雾-电离-质谱(esi-ms)(aquitytmtq检测器，waters,milford,mass.,usa)来确认纯度。将肽干燥冷冻成白色粉末(christalphatm2-4ldplus+vacuubrandrz6)，并在进行进一步处理之前，在4℃下于干燥条件下保存不超过一周。实施例2：肽-peg-缀合物的合成通过10kda马来酰亚胺官能化的四臂聚乙二醇(星形peg，北京键凯科技股份有限公司，中国北京)和半胱氨酸封端的肽之间的迈克尔型加成反应，进行生物基质组装中使用的肽-星形peg缀合物的合成。两种组分溶解在pbs(ph7.4)中，并以80mg/ml的总浓度以1:5(星形peg:肽)的摩尔比混合。将反应混合物快速密封并在室温(24℃)下在搅拌板上以750rpm搅拌2小时。将粗制品在具有8kda截留值的透析管(spectrumlaboratories,inc.，ranchodominguez,ca,usa)中相对于10l水在不断换水的条件下进行透析2天以去除未偶联的肽和盐。之后，通过反相uplc(acquity系统，waters,milfordma,usa)，使用用于蛋白质分离的分析型反相c18色谱柱(phenomenex，torrance,ca,usa)和等梯度来分析产物。将在水中的透析产物冻干。实施例3：生物基质层的制备从millipore(merckkgaa(德国达姆施塔特))采购来自猪肠粘膜的肝素钠盐。从sigma-aldrichco.llc.(美国密苏里州圣路易斯)采购来自牛气管的硫酸软骨素a钠盐、来自明串珠菌属种(leuconostocapp.)的硫酸葡聚糖钠盐(5kda)、来自牛肾的硫酸乙酰肝素钠盐以及来自猪肠粘膜的硫酸皮肤素。将肽-星形peg缀合物和ncp溶解在pbs(ph7.4)或细胞培养基中，并过滤(0.22μm)。然后将两种组分等体积地混合至使用96孔板的最终200μl以及使用μ-血管形成玻片(ibidigmbh，德国martinsried)的最终60μl。在24℃或37℃、95％湿度和5％co2下形成薄层。实施例4：胶凝时间分析在μ-血管形成玻片中制备生物基质层。混合各组分后，将玻片直接放入安装在显微镜(axioobserverz1，蔡司，oberkochen，德国)上的37℃的腔内。在不同时间点之后拍摄所形成生物基质层的明视场照片。实施例5：三维生物基质层结构分析将生物基质层用pbs或全细胞培养基洗涤三次，并使用带有转盘单元csu-x1m5000dualcam(yokagawa,tokyo,japan)的荧光转盘共焦显微镜(axioobserverz1(蔡司，oberkochen，德国))来分析薄层的结构。使用imagej1.48v23进行图像分析。然后，通过计算强度分布图的fwhm(半峰全宽)并且测量图24左右肩之间的这些fwhm的距离来确定厚度。实施例6：使用原子力显微镜(afm)进行刚度分析对于这些afm研究，在24孔板中以1.2ml的体积制备生物基质层。一旦形成凝胶，在实验前对上清液进行置换。将直径为10μm和20μm的球形二氧化硅颗粒胶粘到长度为200μm并且力常数为约0.08n/m的无尖端三角形pyrex-nitride悬臂pnp-tr-tl上(nanoworldag，瑞士)。使用安装在光学显微镜(axioobserverz1)上的nanowizardii(jpkinstrumentsag，德国柏林)在pbs(ph7.4)中进行所有力的测量。在8×8网格中绘制在10×10μm样品表面积上的力曲线。压痕的深度已优化至400–500nm，其中杨氏模量趋向于恒定值，而下面的底物不影响计算。这些值取自独立制备并在不同两天以每个样品测量三个网格进行测量的生物基质层的平均值。使用jpkspm数据处理软件(jpkinstrumentsag)将获得的力拟合到赫兹(hertz)模型上，以在考虑球形压头的情况下计算杨氏模量。通过探测0.2％的琼脂糖凝胶和基质胶(matrigel25)来获得测量值的对照。实施例7：常规细胞培养使用原代人间充质基质细胞(msc)、huvec和hela细胞以及成胶质细胞瘤u-251mg细胞。每种细胞类型在适当培养基中生长：hdfn：培养基106，含2％低血清生长补充物；msc：dmemglutamax低葡萄糖(1g/l)，含10％fbs，npc：神经基础培养基(neurobasalmedium)，含2％b27补充物，1％glutamax和1％pen/strep–用于扩增，含10ng/mlegf和fgf2(peprotech，rockyhill,nj,usa)(直到此处的所有培养基均得自thermofisherscientific)，huvec：内皮细胞生长培养基和2％补充混合物(promocellgmbh，德国海德堡)。除npc外，所有细胞类型均在来自greinerbio-oneinternationalag((kremsmünster,austria)的无涂层t-25瓶中生长。npc通过在涂覆有聚-d-赖氨酸/层粘连蛋白(pdl：sigma-aldrichco.llc.；层粘连蛋白：rochediagnostics，rotkreuz,switzerland)的培养瓶上扩增。npc来自成年小鼠海马体内的齿状回。实施例8：生物基质层上的细胞培养通过将ka7-星形peg与ka7-rgdsp-星形peg按照相应摩尔比混合来获得不同的rgdsp浓度。保存在室温下过夜以进行生物基质层的形成。将由60μl的50mg/ml纤连蛋白或5μg/ml层粘连蛋白μ-血管形成玻片制成的蛋白涂层用作对照。除去所形成生物基质的上清液，并将细胞加入全细胞培养基中的生物基质层和对照表面。在培养的第一天之后更换全细胞培养基，然后每隔一天更换。实施例9：逐层共培养通过混合5μmka7-rgdsp-星形peg和0.7mg/ml硫酸软骨素a(每体积重量与50μm14kda肝素相同)来制备生物基质第一层。将hdfn接种并过夜孵育后，形成第二薄层。将14kda肝素和ka7-rgdsp-星形peg缀合物溶解在全hdfn细胞培养基中，并通过0.22μm离心管过滤器过滤。混合(通过涡旋)这些溶液，以达到3.5mm14kda肝素和2.5mmka7-rgdsp-星形peg缀合物的最终浓度。为了形成第二层，将5μl混合物注入到hdfn层上的细胞培养基中。在另一个过夜孵育步骤后，添加msc，并在全msc细胞培养基中进一步培养。实施例10：对干性标志物的海马神经前体细胞进行染色将细胞用4％pfa固定10分钟，然后用0.1％tritonx-100透化10分钟，然后用10％驴血清封闭1小时。随后，用以1:500稀释的兔抗sox2(merckkgaa，德国达姆施塔特)和小鼠抗nestin抗体(becton,dickinsonandcompany，(bd)，franklinlakes,nj,usa)将细胞孵育2小时。将二抗，即抗小鼠alexafluor488和抗兔dylight549(dianovagmbh，hamburg,germany)以1：500施用1小时。最后，用hoechst33342(1:4000)对细胞核进行染色。样品用配备转盘单元csu-x1m5000dualcam(yokagawa)的倒置共焦显微镜axioobserverz1(plan-apochromat10×/0.45m27)(蔡司)进行成像。为了测量细胞大小和数量，使用了imagej1.48v。实施例11：海马神经前体细胞的分化实验通过移出egf和逐步减少fgf2来引入分化。首先，用完全培养基和5ng/mlfgf2将细胞培养2天。然后在无生长因子的情况下再培养4天，然后用4％pfa固定10分钟。将细胞用0.1％tritonx-100透化10分钟，然后用10％驴血清封闭1小时。随后，用以1:500稀释的小鼠抗map2ab(sigma-aldrichco.llc.)和兔抗gfap(agilenttechnologies,santaclara,usa)将细胞孵育2小时。将二抗，即抗小鼠alexafluor488和抗兔dylight549以1:500施用1小时(dianovagmbh)。最后，用hoechst33342(1:4000)对细胞核进行染色。用倒置共焦显微镜axioobserverz1(plan-apochromat20×/0.8)(蔡司)对细胞成像，并使用imagej细胞计数器插件手动对细胞进行分析。实施例12：针对细胞扩散的免疫细胞化学在进行免疫染色之前，将样品在室温(24℃)下用4％pfa固定15分钟，然后用0.25％牛血清白蛋白、1％tergitol溶液和0.1％肝素的pbs(ph7.4)封闭1小时。接下来，将鬼笔环肽施用于封闭缓冲液中1小时。然后施用0.1μg/mldapi的pbs溶液5分钟，然后用缓冲液洗涤3次5分钟。样品用配备转盘单元csu-x1m5000dualcam(yokagawa)的倒置共焦显微镜axioobserverz1(plan-apochromat10×/0.45m27)(蔡司)进行成像。出于图像分析目的，使用imagej1.48v。实施例13：细胞增殖的染色根据制造商(thermofisherscientific)的说明，使用eduimagingkit(555nm激发)来评估细胞增殖。简而言之，将细胞与10μmedu在37℃下孵育2小时，然后用4％pfa固定并用0.5％tritonx-100的pbs溶液(ph7.4)进行透化。最后，用反应混合物检测edu，并用hoechst33342对edu复染色。用配备转盘单元csu-x1m5000dualcam(yokagawa)的倒置共焦显微镜axioobserverz1(plan-apochromat10×/0.45m27)(蔡司)来对染色进行显像。组织工程师需要一个多功能的平台来试验各种组合物，以模仿不同的生物环境。在实践中，有前景的方法通常涉及简单的设计和可行的方法。此外，潜在的生物医学应用也要求使用安全的构建单元。本文提出的多功能物理性生物基质层系统是由非特异性静电驱动液-液相分离(凝聚)，然后通过特异性肽/ncp相互作用进行凝胶化来促成的。自组装系统仅需一个移液步骤即可形成3d基质。此外，可以轻易地构建更复杂的结构，例如多细胞层。它还使用了安全的构建单元：尽管许多硫酸化寡糖是fda批准的化合物，但合成肽与最广泛使用的生物聚合物peg之间的缀合也将生物污染和免疫原性的潜在风险最小化。因此，提供了易于使用的3d生物基质系统，以定制限定的生物基质组合物并且补充来自动物提取的大蛋白的常规2d表面涂层。可以将不同的ncp结合到生物基质层中，从而使得能够以天然形式使用来自ecm的所有ncp。肽和ncp浓度的不同会影响化学组成、机械性质和形态。因此，通过使用ncp和肽-星形peg缀合物的不同构建单元，可以调整生物基质以适应不同细胞类型的要求。确定用于培养原代细胞例如msc和npc的限定3d基质膜的最佳组成，提供其粘附、增殖和分化的环境。实施例14：表明肽-peg缀合物与不同ncp和不同r1肽的凝聚的光散射测量在perkinelmerls45荧光分光光度计上，在500nm下测量含有peg-ka7和各个ncp的溶液的光散射能力1800秒，并采样500个数据点。将每种ncp加入到peg-ka7溶液中，使得每种组分的最终浓度达到5μm。最初使用pbs缓冲液和peg-ka7观测基线，标有三角形。观测到稳定基线后，在180秒时添加ncp溶液。在添加ncp时，光的散射立即增加，表明凝聚导致混浊(图10)。光散射随着时间推移逐渐降低，表明凝聚层的沉积。所述测量结果表明肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素的糖胺多糖的糖胺多糖-肽相互作用。还使用peg-肽缀合物与含有不同的r1肽的肝素进行光散射测量(图11)。在perkinelmerls45荧光分光光度计上在500nm下测量含有peg-r1-ka7和肝素的混合物的溶液的光散射能力1200秒。将肝素添加到peg-r1-ka7溶液中，直到每个组分的最终浓度达到5μm。最初使用pbs缓冲液或者5μmpeg-ka7溶液观测基线，标有三角形。观测到稳定基线后，在150秒时添加肝素溶液。光的散射立即增加，表明由凝聚引起的混浊。所有测量值均表明被试peg-r1-ka7缀合物与代表ncp的肝素的相互作用。实施例15：在包括硫酸乙酰肝素和ka7-rgdsp-星形peg的生物基质层上的原代小鼠神经元祖细胞(npc)分化的分析通过将5μm硫酸乙酰肝素(类肝素)与peg-rgsp-ka7混合来形成生物基质层。通过使用含有两端半胱氨酸的rgdsp肽和四臂-星形peg，通过硫代马来酰亚胺迈克尔型加成来制备常规peg水凝胶涂层。(图12a)相衬图像显示了神经前体在分化方案第5天时的分化生长。(图12b)荧光图像通过在两个表面上培养6天后对dna(hoechst)、神经元细胞(微管相关蛋白2ab(map2ab))和星形细胞(胶质原纤维酸性蛋白(gfap))染色，突出显示细胞核。比例尺为100μm。图像分析的结果显示为(图12c)细胞数、(图12d)map2ab阳性细胞的比率以及(图12e)gfap阳性细胞相对于总细胞计数的比率。数据代表平均值±标准平均误差(sem)，来自与衍生于独立分离的2个原代细胞系并行进行的两个独立实验三次。在通过t-检验以t(19)＝5.73在高显著性水平下，类肝素生物基质涂层的细胞数更高。与peg-rgdsp凝胶相比，在类肝素生物基质上检测到map2ab阳性神经元的比例增加(t(19)＝2.74)，而gfap阳性星形细胞较少(t(19)＝2.15)。实施例16：在含有10％fbs和无血清培养基的标准培养基中扩增的原代人间充质基质细胞(msc)的分析。已在标准含血清培养基(10％fbs的dmemglutamax，invitrogen)中培养原代人间充质基质细胞(msc)3天，并且当生物基质层或塑料生长时将细胞的倍增时间与限定无血清培养基(stempro，invitrogen)进行比较。根据以下式计算细胞的倍增时间：td＝(tday3-tday1)×log(2)/log(nday3/nday1)，其中t代表细胞计数的时间点，n代表计数的细胞数。所述生物基质层由ncp硫酸葡聚糖和peg-肽缀合物的不同混合物制成。通过将peg-rgdsp-ka7(序列id号17)与peg-ka7以1:1的比率混合来制备一个生物基质层。通过混合peg-rgdsp-ka7(序列id号17)和2.5μmpeg-yrsrkysswyvalkrk-ka7(序列id号348)来制成第二生物基质层。msc以7,000个细胞/cm2接种。培养24小时后(第1天)，使用4％pfa固定第一组样品。培养约72小时后(第3天)，固定第二组样品。细胞用hoechst33342(1:4000，invitrogen)和cellmaskgreen(1:5000，invitrogen)染色。使用bioteklionheartfx自动显微镜(10倍物镜)和gen5软件(3.03版)采集图像并分析细胞数。为了计算倍增时间，使用第1天和第3天之间的确切间隔时间。结果(图13)显示，当使用含血清的培养基时，在所有表面上呈现均一的细胞生长和相似的倍增时间。在无血清培养条件下，塑料表面不提供适于msc生长的适当环境，如细胞集落的形成所示，并且由于在三天培养之内的细胞较少，因此无法量化倍增的时间。总之，给出的具有肽混合物二者的生物基质层提供了使得能够用无血清培养基实现msc扩增的限定环境。实施例17：培养5代后通过流式细胞术分析人诱导多能干细胞(ipsc)的干性标志物表达。已将诱导多能干细胞(ipsc)系crtd-1接种在由5μm肝素与2.5μmpeg-pqvtrgdvftmp-ka7(序列id号241)与2.5μmpeg-wqpprari-ka7(序列id号336)的混合物制成的生物基质层上。使用由9μg/ml(corning))溶液制备的涂层进行比较。使用mters(stemcelltechnologies)作为培养基。汇合70-80％后，ipsc已通过使用分离用accutase(invitrogen)以1:4至1:20的分离比率被分离到新表面上。使用包含针对tra1-60、ssea4、sox2和oct4的一抗的psc4-标记物免疫细胞化学试剂盒(分子探针，thermofisher)对被固定的细胞进行染色，以使用lsrii流式细胞仪(bd)进行流式细胞术分析。根据制造商的指示以1:100稀释度施用抗体。结果如图14中所示。实施例18：在培养5天后，通过免疫细胞化学法对源自人诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(npc)进行干性标志物表达的分析。在标准扩增条件下培养源自人诱导多能干细胞的神经前体细胞(npc)。通过将dmem和神经基础培养基(invitrogen)以1:1的比例混合并添加1％b27、0.05％n2、2％谷氨酰胺和2％pen/strep(全部为invitrogen产品)来制备扩增培养基。此外，加入chir99021(最终浓度为3μm，axonmedchem)、抗坏血酸(最终浓度为200μm，sigmaaldrich)和pumorphamine(最终浓度0.5μm，santacruz)。培养5天后，将细胞用4％pfa固定并用hoechst33342(1:4000，invitrogen)、sox1(1:300，r&d)和pax6(1:300，biolegend)染色。从dianova采购带有af488和cy3荧光标记的二抗，并将其以1:500稀释度使用。使用bioteklionheartfx自动显微镜(10倍物镜)采集图像，并使用gen5软件(3.03版)分析细胞计数(hoechst信号)和sox1和pax6的荧光信号强度。结果表明，与matrigel包被的表面相比，生物基质层上的干性标志物sox1和pax6呈阳性的细胞数量显著较高。结果如图15中所示。实施例19：分化为神经元10天后，源自人诱导多能干细胞(ipsc)的神经前体细胞(npc)的荧光图像，如用抗tuj1抗体进行的免疫细胞化学过滤所示。npc首先在由5μm硫酸皮肤素与包括表2给出的肽库中的一个或两个不同肽序列的5μmpeg-r1-ka7的混合物制成的生物基质层上扩增。扩增2天后，更换培养基至图式形成培养基6天，然后在成熟培养基中4天。细胞用4％pfa固定，并对抗tuj1抗体染色，如荧光图像所示。所示的5张图像示出促进神经元生长的功能性r1序列。比例尺为100μm。r1肽库用于鉴定促进源于人诱导多能干细胞的神经前体细胞(npc)的神经元发育的功能性肽序列。所有生物基质表面均由5μm硫酸乙酰肝素和5μmpeg-r1-ka7的原液制备。首先，以25,000个细胞/cm2接种npc，并在扩增条件下进行培养。通过将chir99021(最终浓度3μm，axonmedchem)、抗坏血酸(最终浓度200μm，sigmaaldrich)和pumorphamine(最终浓度0.5μm，santacruz)以1:1比例添加到的基础培养基(dmem和神经基础培养基(invitrogen)，添加1％b27、0.05％n2、2％谷氨酰胺和2％pen/strep(全部为invitrogen产品)来制备扩增培养基。扩增2天后，将培养基换成图式形成培养基(补充有抗坏血酸(最终浓度200μm)、pumorphamine(最终浓度0.5μm)、gdnf(1ng/ml，peprotech)和bdnf(2ng/ml，peprotech)的基础培养基)，之后隔一天更换一次培养基。6天后，将培养基更换为成熟培养基(补充有抗坏血酸(200μm)、tgf-β3(1ng/ml，peprotech)、dbcamp(100μm，santacruz)、dapt(5μm，biomol)、gdnf(1ng/ml)和bdnf(2ng/ml)的基础培养基)，在2天后更换培养基。细胞用4％pfa固定并用hoechst33342(1:4000，invitrogen)、小鼠抗β3微管蛋白/tuj1一抗(1:400，randdsystems)以及具有af488荧光标记(1:500，dianova)的抗小鼠二抗染色。使用bioteklionheartfx自动显微镜(10倍物镜)和gen5软件(3.03版)采集图像。结果表明在包括具有id号81、190、237、317的肽序列以及序列id号17和314以1:1比例的混合物的生物基质层上神经元细胞的发育。结果如图16中所示。序列表<110>德累斯顿工业大学<120>非共价组装的生物基质层<130>tud116wo<150>ep17176355.0<151>2017-06-16<160>353<170>patentinversion3.5<210>1<211>10<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>1lysalalysalalysalalysalalysala1510<210>2<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>2lysalalysalalysalalysalalysalalysala1510<210>3<211>14<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>3lysalalysalalysalalysalalysalalysalalysala1510<210>4<211>18<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>4lysalalysalalysalalysalalysalalysalalysalalysala151015lysala<210>5<211>22<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>5lysalalysalalysalalysalalysalalysalalysalalysala151015lysalalysalalysala20<210>6<211>10<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>6lysserlysserlysserlysserlysser1510<210>7<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>7lysserlysserlysserlysserlysserlysser1510<210>8<211>14<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>8lysserlysserlysserlysserlysserlysserlysser1510<210>9<211>10<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>9argalaargalaargalaargalaargala1510<210>10<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>10argalaargalaargalaargalaargalaargala1510<210>11<211>14<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>11argalaargalaargalaargalaargalaargalaargala1510<210>12<211>10<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>12argserargserargserargserargser1510<210>13<211>12<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>13argserargserargserargserargserargser1510<210>14<211>14<212>prt<213>artificialsequence<220><223>syntheticpeptide<400>14argserargserargserargserargserargserargs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