具有复制子颗粒和油佐剂的疫苗的制作方法

本发明涉及使用α病毒-复制子rna颗粒和油佐剂针对动物病原体的接种。涉及疫苗和试剂盒(kitofparts)，其包含所述复制子颗粒和所述油佐剂。还涉及制备和使用所述疫苗和所述试剂盒的组分的方法和用途。

背景技术：

多年来，已在疫苗中使用多种载体策略，以努力针对动物病原体产生保护作用。一种这样的载体策略包括使用α病毒衍生的复制子rna颗粒(rp)[vanderveen等，animhealthresrev.13(1):1-9(2012)doi:10.1017/s1466252312000011；kamrud等，jgenvirol.91(pt7):1723-1727(2010)]，其是由几种不同α病毒开发而成，包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)[pushko等，virology239:389-401(1997)]、辛德毕斯(sindbis)病毒[bredenbeek等，journalofvirology67:6439-6446(1993)]和塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)[liljestrom和garoff,biotechnology(ny)9:1356-361(1991)]。编码的病原体抗原在其感染人或动物靶细胞后由复制子颗粒表达。结果是诱导针对表达的抗原的保护性抗体。当与一些传统疫苗制剂比较时，rp具有有吸引力的安全性和功效性质[vanderveen等，animhealthresrev.13(1):1-9(2012)]。rp平台是几种usda许可的疫苗的基础，包括：猪流行性腹泻疫苗，rna颗粒(产品代码19u5.p1)、猪流感疫苗，rna(产品代码19a5.d0)、禽流感疫苗，rna(产品代码19o5.d0)和处方产品，rna颗粒(产品代码9pp0.00)。

α病毒衍生的复制子rna颗粒缺乏α病毒结构蛋白基因，但是保留了胞质rna自我扩增必需的复制元件，并且在高活性26sα病毒亚基因组启动子的驱动下表达插入的异源核酸。因此，rp是单周期感染性颗粒，由于缺乏结构蛋白基因使得其是复制缺陷的。[lundstrom,vaccines6:2392-2415(2014)]。因此，反而必须在适宜的宿主细胞中提供包装和生产复制子颗粒所必需的结构蛋白，以产生rp[参见vajdy等，immunol.andcellbiol.82:617-627(2004)]。通常通过复制子rna和编码结构蛋白的一种或多种“辅助”rna的瞬时共转染来提供结构蛋白。或者，可以由包装细胞系产生rp，包装细胞系由一个或多个dna表达盒组成型或瞬时表达病毒结构蛋白。这样，产生的复制子颗粒保留了载体的复制缺陷性质，因为结构蛋白不包括在所得到的rp基因组中[polo等，dev.biol.,104:181–185(2000)]。当用于免疫目标人类或动物时，这些复制缺陷的α病毒rna复制子颗粒在体内诱导保护性免疫应答。例如，在全身性免疫小鼠和大动物后，基于vee的α病毒载体激发较强的粘膜和全身性免疫应答[davis等，iubmblife53:209-211(2002)]。

佐剂是能够对目标人类或动物的免疫系统提供非特异性刺激的已知化合物。佐剂的标准用途是在基于灭活或亚单位抗原的疫苗中。存在多种佐剂类型和组分，例如：铝盐(氢氧化铝或磷酸铝)、脂质体、葡聚糖、海藻酸盐(alginate)、细菌组分(如细胞壁组分)、矿物油或非矿物油、合成佐剂(如：非离子嵌段聚合物)、聚胺(如硫酸葡聚糖)、carbopol^tm、吡喃和皂苷(如：quila^tm或q-vac^tm)。可以将皂苷和疫苗组分组合在iscom^tm中。

此外，诸如胞壁二肽、二甲基甘氨酸、特夫素(tuftsin)的肽通常作为佐剂。类似地，组合产品如isa^tm组合物(seppic,france)。

关于佐剂及其用途和作用的手册是：“vaccineadjuvants”(methodsinmolecularmedicine,vol.42,d.o’haganed.,2000,humanapress,nj,isbn:0896037355)。

不应将本文引用的任何参考文献解释为承认该参考文献可作为本申请的“现有技术”。

技术实现要素：

本发明提供了一种疫苗，其包含编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒，其中所述疫苗还包含油佐剂。

在本发明疫苗的一个实施方式中，油佐剂包含至少一种选自下述的油：矿物油和非矿物油。

在本发明疫苗的一个实施方式中，油佐剂包含矿物油；优选地，矿物油是液体石蜡油。

在本发明疫苗的一个实施方式中，油佐剂包含非矿物油；优选地，非矿物油选自合成油、半合成油、动物油和植物油。更优选地，非矿物油选自角鲨烷、角鲨烯、生育酚和植物油。在一个实施方式中，生育酚是α生育酚；更优选地，α生育酚选自维生素e和维生素e-乙酸酯。在一个实施方式中，植物油是油酸酯，更优选地油酸乙酯。

更优选地，非矿物油是角鲨烷。

在本发明疫苗的一个优选实施方式中，油佐剂包含一种以上油。

在包含一种以上油的油佐剂的一个实施方式中，佐剂包含矿物油和一种或多种非矿物油。更优选地，油佐剂包含液体石蜡油作为矿物油和一种或多种选自下述的非矿物油：角鲨烷、角鲨烯、维生素e、维生素e-乙酸酯、油酸酯和油酸乙酯。更优选地，油佐剂包含液体石蜡油和维生素e-乙酸酯。最优选地，油佐剂是xsolve^tm。

在包含一种以上油的油佐剂的一个替代实施方式中，佐剂包含一种以上非矿物油。优选地，油佐剂包含一种以上选自下述的非矿物油：角鲨烷、角鲨烯、维生素e、维生素e-乙酸酯、油酸酯和油酸乙酯。更优选地，油佐剂包含角鲨烷和维生素e乙酸酯。最优选地，油佐剂是svea^tm。

在本发明疫苗的一个实施方式中，矿物油在油佐剂中的量是油佐剂的1-70％v/v。优选地，油佐剂包含的矿物油的量为油佐剂的5-60％v/v。

在本发明疫苗的一个实施方式中，非矿物油的总量是油佐剂的0.1-30％w/v。优选地，油佐剂包含的非矿物油的总量为油佐剂的0.5-25％v/v。

在一个实施方式中，当非矿物油包含角鲨烷时，油佐剂包含的角鲨烷为油佐剂的0.5-30％w/v；更优选地，油佐剂包含1-25％w/v、2-15％w/v的角鲨烷，或者甚至包含占油佐剂3-10％w/v的角鲨烷。

替代地或另外地，在一个实施方式中，当非矿物油包含维生素e乙酸酯时，油佐剂包含的维生素e乙酸酯为油佐剂的0.1-30％w/v；更优选地，油佐剂包含0.5-20％w/v、1-16％w/v维生素e乙酸酯，或者甚至包含占油佐剂2-10％w/v的维生素e-乙酸酯。

在本发明疫苗的一个实施方式中，将油佐剂配制成油相和水相的乳剂。优选地，将油佐剂配制成水包油(o/w)乳剂。

在一个实施方式中，水相包含药学上可接受质量的水。

在一个实施方式中，将油佐剂的乳剂配制成微乳，其中内相的液滴小于1微米。优选地，微乳是o/w乳剂，更优选地，使用高能量均质化来制备o/w微乳，甚至更优选地，通过微流化法来制备。

在本发明疫苗的一个实施方式中，油佐剂的乳剂包含乳化剂，优选地乳化剂包含聚山梨醇酯，更优选地乳化剂包含聚山梨醇酯80。

在一个实施方式中，本发明的疫苗包含油佐剂的乳剂，优选地疫苗包含配制成o/w乳剂的油佐剂。

在本发明疫苗的一个实施方式中，将疫苗配制成水包油(o/w)乳剂。

在本发明疫苗的一个实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是委内瑞拉马脑炎(vee)α病毒rna复制子颗粒。在一个更特定的实施方式中，veeα病毒rna复制子颗粒是tc-83veeα病毒rna复制子颗粒。在其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是辛德毕斯α病毒rna复制子颗粒。在另外其他实施方式中，α病毒rna复制子颗粒是塞姆利基森林病毒α病毒rna复制子颗粒。

在本发明疫苗的一个实施方式中，对于来源于动物病原体的编码抗原，动物病原体选自病毒、细菌、寄生虫、原生动物、真菌、立克次体和朊病毒。更优选地，来源于动物病原体的编码抗原是来源于病毒或细菌的抗原。最优选地，抗原来自病毒。

在本发明疫苗的一个实施方式中，rp编码来源于动物病原体的抗原，因此动物是与兽医科学相关的动物。优选地，动物选自鱼类、禽类和哺乳动物。更优选地，动物是野生动物、家畜或伴侣动物。家畜动物是鱼类、禽类、猪或反刍动物；优选地，猪(porcine)是猪(pig)；优选地，禽类是鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑或鸵鸟；优选地，反刍动物是奶牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼或鹿；优选地，鱼类是硬骨鳍鱼，更优选地是鲑鱼科或慈鲷科的鱼(即，慈鲷科成员)。鲑鱼科的鱼优选地选自大西洋鲑、硬头鲑、奇努克鲑、银鲑、粉红鲑、狗鲑和红鲑鱼，虹鳟、小溪鲑、湖鳟和褐鳟，以及鲑鱼(char)。慈鲷科的鱼优选地是罗非鱼。伴侣动物优选地选自猫、犬和马。更优选地，动物是罗非鱼、鸡或猪。

在本发明疫苗的一个实施方式中，对编码来源于本发明动物病原体的抗原基因的核苷酸序列优化，以便在疫苗靶动物物种的细胞中表达。在一个实施方式中，核苷酸序列优化是密码子优化。在一个实施方式中，核苷酸序列优化是rna转录物二级结构的优化。

在一个优选的实施方式中，编码来源于本发明动物病原体的抗原基因的核苷酸序列优化考虑了密码子使用和rna转录物的二级结构。优选地，根据us7,561,972、us7,561,973、us7,805,252和us8,126,653中的一个或多个中所描述的程序进行核苷酸序列的优化。

在本发明疫苗的一个特别优选的实施方式中，油佐剂包含矿物油和非矿物油，将疫苗配制成o/w乳剂，α病毒rna复制子颗粒是veeα病毒rna复制子颗粒，动物病原体抗原是病毒抗原以及病毒是猪病原体。

在本发明疫苗的一个优选的实施方式中，来源于动物病原体的编码抗原是流感病毒的血凝素(ha)-或神经氨酸酶(na)蛋白，或此类ha或na蛋白的抗原性片段。ha和/或na蛋白优选地来源于甲型流感病毒，更优选地来源于猪甲型流感病毒或来自pedv。

本发明还提供了多价疫苗，其包含本发明的α病毒rna复制子颗粒，其中疫苗包含一种以上编码抗原的rp，或者疫苗包含一种或多种rp，其各自均编码一种或一种以上本发明的抗原。

本发明的疫苗包含免疫有效量的本发明的α病毒rna复制子颗粒。在一个实施方式中，疫苗包含约1x10^3至约1x10^11个rp。在更特定的实施方式中，疫苗包含约1x10^4至约1x10^10个rp。在甚至更特定的实施方式中，疫苗包含约1x10^5至约1x10^9个rp。

本发明的疫苗包含免疫有效量的本发明的油佐剂。在一个实施方式中，疫苗包含占疫苗约10％-90％v/v的量的油佐剂。更优选地，疫苗包含占疫苗约20％-80％v/v、30-70％v/v或甚至40-60％v/v之间的量的油佐剂。最优选的，疫苗包含占疫苗约50％v/v的量的油佐剂。

在特定实施方式中，本发明的疫苗以每动物剂量0.05ml至5ml的体积施用。在更特定的实施方式中，每只动物的施用剂量是0.1ml至2ml。在甚至更特定的实施方式中，施用剂量是0.2ml至1.5ml。在甚至更特定的实施方式中，施用剂量是0.3至1.0ml。在甚至更特定的实施方式中，每只动物的施用剂量是0.4ml至0.8ml。

在本发明疫苗的一个实施方式中，疫苗包含其他佐剂。优选地，其他佐剂选自下述：细菌细胞壁成分、细胞因子和包含未甲基化的cpg的免疫刺激性核酸。在一个实施方式中，免疫刺激性核酸是选自下述的一种或多种：wo2012/089.800(x4家族)、wo2012/160.183(x43家族)和wo2012/160.184(x23家族)。

在本发明疫苗的一个实施方式中，疫苗包含动物病原体的其他抗原。在一个优选的实施方式中，其他抗原选自下述：活减毒微生物、灭活微生物和微生物的亚基。

在一个进一步的方面中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含至少两个容器，其中至少一个容器包含编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒，和至少一个容器包含油佐剂。至少两个容器各自包含免疫有效量的α病毒rna复制子颗粒或油佐剂。

在本发明试剂盒的优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在优选实施方式中，包含rp的至少一个容器包含冻干物形式的rp。

在一个替代实施方式中，包含rp的至少一个容器包含在水溶液中的rp；水溶液优选地包含缓冲剂；水溶液优选地保持冷却或冷冻。在一个实施方式中，水溶液是由将rp冻干物与适宜水性稀释剂混合产生的重构的rp溶液。

在其中至少一个容器包含冻干物形式的rp的实施方式中，本发明的试剂盒可以包含其他容器，所述容器含有用于重构冻干的rp的适宜稀释剂。在一个优选的实施方式中，稀释剂是水溶液，优选地包含药学上可接受质量的缓冲剂和/或稳定剂和水。

在一个优选的实施方式中，包含油佐剂的容器包含以油和水相的乳剂形式配制的油佐剂；优选地乳剂是水包油乳剂。

在试剂盒的实施方式中，试剂盒包含试剂盒和/或其组成部分的使用说明书。在优选的实施方式中，使用说明书在试剂盒的一个或多个组成部分上或与其一起提供；或以参考电子形式说明书的方式提供，如可以是从试剂盒生产厂商或经销商的互联网网站上查看或下载的信息。

在一个实施方式中，试剂盒包含至少两个容器的盒子，并且使用说明书显示在盒子上或盒子内的信息载体(例如，卡片或说明书)上。

在试剂盒的一个实施方式中，试剂盒还可以在例如涉及本发明免疫方法的使用的互联网网站上提供其组成部分(与商业销售相关)。

在试剂盒的一个实施方式中，一个或多个容器可以包含本文所述的其他佐剂；同样地或替代地，一个或多个容器可以包含本文所述的动物病原体的其他抗原。

可以向目标动物施用均如本文所定义的编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子和油佐剂。此类施用将在所述动物中诱导针对由所述动物病原体导致的感染或疾病的有效免疫保护。例如，可以根据ema-cvmp指南进行施用，以用于免疫兽药产品的相关用途。

因此，在进一步的方面中，本发明提供了免疫动物的方法，包括向动物施用免疫有效量的编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒和油佐剂。

在本发明免疫动物的方法的一个优选实施方式中，该方法包括向动物施用本发明的疫苗。

在本发明免疫动物的方法的一个优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在本发明免疫动物的方法的一个优选实施方式中，来源于动物病原体的编码抗原是来源于来自下述病原体的抗原：鱼类、慈鲷科成员、罗非鱼、哺乳动物、禽类和鸡。

在本发明免疫动物的方法的一个实施方式中，α病毒rna复制子颗粒和油佐剂在目标动物体中或目标动物体上以同时使用或并行使用的方式施用。

在本发明免疫动物的方法的一个优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒和油佐剂在目标动物体中或目标动物体上以同时使用的方式(即，作为单一组合物)施用。

在一个优选实施方式中，单一组合物是本发明的疫苗。

在一个优选实施方式中，在即将向目标动物施用前制备单一组合物，通过将均如本发明所述的包含rp的组合物与包含油佐剂的组合物混合；更优选地，通过将本发明试剂盒容器中的内容物混合；甚至更优选地，通过将包含rp的水溶液与包含油佐剂o/w乳剂的组合物混合。在一个替代地甚至更优选的实施方式中，通过将均如本发明在本文中所定义的rp冻干物与油佐剂的o/w乳剂重构制备单一组合物。有效地，制备单一组合物产生本发明的疫苗。

优选地，“在即将向目标动物施用前”是向目标动物施用前24小时内，更优选地向目标动物施用前16小时内、12小时内、8小时内、4小时内或者甚至2小时内，以此优先顺序排列。

在本发明免疫动物方法的一个替代优选的实施方式中，α病毒rna复制子颗粒和油佐剂在目标动物体中或目标动物体上以并行使用的方式施用，即包含在分开的组合物中，其在位置和/或时间上分开施用。

在一个优选的实施方式中，并行使用包括将包含在本发明试剂盒中的α病毒rna复制子颗粒和油佐剂在目标动物体中或目标动物体上施用，但是在位置和/或时间上是分开的。

在本发明并行使用的优选实施方式中，在彼此有限量的时间内，通过相同或通过不同的施用途径，向目标动物体中或目标动物体上的单独部位施用单独的组合物；优选地，“有限量的时间”是彼此在2周内，更优选地彼此在1周内，甚至更优选地彼此在1天内、在16小时内、在12小时内、在8小时内、在4小时内、在2小时内、在1小时内、在30分钟内或者甚至在10分钟内，以此优先顺序排列。最优选地，并行使用的施用基本上是同时的。

在本发明并行使用的一个优选实施方式中，在彼此有限量的时间内，在目标动物体中或目标动物体上，通过相同或通过不同的施用途径，在单独部位施用单独的组合物。对于本发明，施用的单独部位在动物体上或动物体中彼此之间分开至少1cm；优选地彼此之间分开至少2cm、至少5cm、至少10cm或者甚至至少25cm，以此优先顺序排列。

在本发明并行使用的一个优选实施方式中，在彼此有限量的时间内，在目标动物体中或目标动物体上，通过相同或通过不同的施用途径，在目标动物体中或目标动物体上的基本相同的位置，但在时间上彼此充分分开来施用单独的组合物，以防止组合物在施用部位混合。对于本发明，为防止混合而充分分开的时间是彼此之间不在2小时内，优选地彼此之间不在6小时内、不在12小时内、不在1天内、不在2天内或者甚至不在1周内，以此优先顺序排列。

在免疫本发明动物的方法的实施方式中，在目标动物体中或目标动物体上的施用是通过胃肠外施用进行的。在一个替代实施方式中，施用是通过粘膜施用的方法。在又一个替代实施方式中，通过局部施用的方法施用疫苗。

优选的施用方法选自皮内、肌内、腹膜内、皮下、浸入和喷雾。皮内施用方法优选通过无针方式施用，更优选地通过使用装置(液体的皮肤内应用)。

在施用本发明疫苗的一个实施方式中，疫苗作为初免疫苗和/或作为加强疫苗施用。在具体实施方式中，本发明的疫苗是一次(一次注射)接种施用的，不需要后续加强施用。在某些实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，可以以相同途径施用初免疫苗和加强疫苗。在替代的实施方式中，在施用初免疫苗和加强疫苗两者的情况下，初免疫苗的施用可以通过一种途径进行和加强疫苗可以通过另一种途径施用。

在施用本发明疫苗的某些实施方式中，疫苗是向猪施用的，并且初免疫苗和加强疫苗均通过皮内注射施用。在一个替代的实施方式中，初免疫苗通过皮内注射施用和加强疫苗通过另一种途径施用。

在一个进一步的实施方式中，本发明提供了一种生产本发明疫苗的方法，所述方法包括将编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒与油佐剂混合的步骤。以免疫有效量将α病毒rna复制子颗粒与油佐剂混合。

在用于生产本发明疫苗的方法的优选实施方式中，疫苗、α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在用于生产本发明疫苗的方法的一个实施方式中，α病毒rna复制子颗粒包含在水溶液中。

在用于生产本发明疫苗的方法的优选实施方式中，进行混合，使得α病毒rna复制子颗粒，分别地包含α病毒rna复制子颗粒的水溶液与油佐剂以1：10至10：1的体积比混合；更优选地，以1：5至5：1之间、1：4至4：1之间、1：3至3：1之间或者甚至1：2至2：1之间的体积比混合，以此优先顺序排列。最优选地，α病毒rna复制子颗粒，分别地包含α病毒rna复制子颗粒的水溶液与油佐剂以约1：1的体积比混合。

在用于生产本发明疫苗的方法的一个实施方式中，包括将本发明试剂盒的容器的内容物混合。

在用于生产本发明疫苗的方法的一个实施方式中，α病毒rna复制子颗粒，分别地包含复制子颗粒的水溶液与根据本发明定义的油佐剂混合，所述油佐剂包含在含有病原体抗原的另一种o/w乳剂中。优选地，另一o/w乳剂是包含灭活病毒和/或细菌病原体的疫苗。在一个更优选的实施方式中，将编码来自siv或来自pedv的抗原的rp与o/w乳剂疫苗混合，所述疫苗包含猪圆环病毒(pcv)和/或猪肺炎支原体，如pcvm。

在一个进一步的实施方式中，本发明提供了编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒，其用于保护动物免受由动物病原体引起的感染或疾病的用途，其中α病毒rna复制子颗粒和油佐剂在目标动物体中或目标动物体上以同时使用或并行使用的方式施用。免疫有效量的α病毒rna复制子颗粒和油佐剂两者包含在保护动物的用途中。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的优选实施方式中，用途包括本发明疫苗的用途。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的一个实施方式中，保护在不同年龄和类型的目标动物中是有效的。

在一个实施方式中，用途是用于保护幼小动物。优选地，幼小动物是至多3周龄的猪，或至多1周龄的鸡，或至多14月龄的鲑鱼。

在一个进一步的实施方式中，用途是用于保护青少年动物。优选地，青少年动物是3周龄至8月龄的猪，或1周龄至22周龄的鸡，或14月龄至24月龄的鲑鱼。

在一个进一步的实施方式中，用途是用于保护成年动物。优选地，成年动物是8月龄以上的猪，或22周龄以上的鸡，或24月龄以上的鲑鱼。

对于罗非鱼，用于本发明保护用途的优选时期，通常不是用年龄表示，而是用整个体重范围表示：当罗非鱼重量在0.5g至5g之间时，优选通过浸浴处理进行免疫接种。当罗非鱼重量在10g至100g之间；更优选地当罗非鱼重量在20g至25g之间时，优选通过胃肠外注射进行免疫接种。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的一个实施方式中，针对动物病原体的抗体，或者对于动物病原体而言，分别地针对来自动物病原体的抗原，目标动物可以是血清阳性的或血清阴性的。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的一个实施方式中，目标动物是mda(母源抗体)阳性的动物，从而mda可与旨在保护的动物病原体反应。更优选地，mda阳性的动物是禽类、反刍动物或猪。另外更优选地，mda阳性的动物是猪。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的一个实施方式中，目标动物是妊娠动物。更优选地，妊娠动物是反刍动物或猪。另外更优选地，妊娠动物是猪。

在α病毒rna复制子用于本发明保护用途的一个实施方式中，保护是保护生产动物。优选地，生产动物是用于增肥而饲养的猪，或肉鸡或蛋鸡，或用于生产奶或肉而饲养的反刍动物，或鲑鱼，或罗非鱼。

在一个进一步的实施方式中，保护是保护补充种群(restocking)的动物。优选地，用于补充种群的动物是产生动物的亲本(parental)或祖亲本(grand-parental)品系。

在一个进一步的实施方式中，本发明提供了编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒用于制备保护动物免受由动物病原体引起的感染或疾病的疫苗的用途，其包括同时使用或并行使用所述α病毒rna复制子颗粒与油佐剂。α病毒rna复制子颗粒和油佐剂均以免疫有效量使用。

在用于制备本发明疫苗的用途的优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在一个进一步的实施方式中，本发明提供了编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒用于制备如本发明所定义的试剂盒的组分的用途，其中通过同时使用或并行使用所述试剂盒的组分，所述试剂盒用于保护动物免受由所述动物病原体引起的感染或疾病。α病毒rna复制子颗粒和油佐剂均以免疫有效量使用。

在用于制备本发明试剂盒组分的用途的优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体、油佐剂和试剂盒中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

在一个进一步的实施方式中，本发明提供了编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒用于保护动物免受由动物病原体引起的感染或疾病的用途，其中所述用途包括同时使用或并行使用所述α病毒rna复制子颗粒与油佐剂。α病毒rna复制子颗粒和油佐剂均以免疫有效量使用。

在本发明用于保护动物的用途的优选实施方式中，α病毒rna复制子颗粒、编码抗原，动物病原体和油佐剂中的一个或多个或全部如本文所述的任何一个或多个实施方式中所定义的。

通过参考下述附图和具体实施方式，将更好地理解本发明的这些和其他方面。

附图说明

图1和图2：实施例2中的结果：

图1a-1b：肺病变

图1c-1d：鼻脱落

图1e-1f：ni效价

图2a-2f：hi效价结果(图从左至右编号，先上面一行，然后是下面一行)

图3：在实施例3中接种多价na-rp的猪中，针对n1-经典抗原的血清抗体应答：

图示为如实施例3中所述的对疫苗组合物的n1经典株具有特异性的血清神经氨酸酶抑制(ni)抗体应答。在第一次免疫接种(3周龄)前、第二次免疫接种(7周龄)前和攻击(10周龄)前收集血清样品。

图4：如在实施例3中测定的，4联na-rp疫苗针对攻击感染的功效，涉及使用h1n1病毒感染后5天的宏观肺病变评分：

显示了施用实施例3所述的免疫组合物且使用h1-γ-n1-经典病毒攻击后的猪的肺病变评分。

图5和6：实施例8中的ni效价结果：

图5显示了在随着时间的推移测量的三个时间点针对n1经典na抗原的ni效价，包括标准偏差。这代表了针对其他三种na类型测得的ni效价特征(profile)。

图6显示了在第二次免疫接种后7天时组合的4种na类型的组平均ni效价。

具体实施方式

本发明提供了疫苗，其包含免疫有效量的编码一种或多种来源于动物病原体的抗原的一种或多种α病毒rna复制子颗粒和油佐剂。α病毒rna复制子颗粒实际上类似于活病毒，其能够感染目标人类或动物的宿主细胞并表达其包含的基因。通常通过细胞感染性滴定对rp进行定量的事实也证明了这一点。因此，与活(减毒)病毒疫苗类似，在药学上可接受载体中的这种rp通常是有效疫苗的唯一组分。已开发了几种基于无佐剂rp的疫苗并将其商业化。

佐剂主要仅与灭活或亚单位疫苗抗原组合使用。而且，油佐剂对其他疫苗组分可能具有很强的攻击性，因此通常不将油佐剂与活疫苗组合使用。此外，已知α病毒rnarp疫苗(特别是基于veeα病毒的那些)已知继获得性免疫应答之后可以从目标的先天性免疫系统自身诱导出强大的抗病毒应答。从而，有效阻止了对额外免疫刺激的任何需求。

然而，令人吃惊地发现，油佐剂可以显著增强编码来源于动物病原体的抗原的α病毒rna复制子颗粒的免疫原性作用。这与基于铝的佐剂(如氢氧化铝)是不同的。当将rp和油佐剂组合成单一组合物(即，同时使用)，或当将其作为单独的组合物(即，并行使用)施用时，均可以获得增强的功效。油佐剂增强功效的程度也是出乎意料的，因为与无(油)佐剂的疫苗相比，使用rp和油佐剂的免疫接种可以将rp的最小有效剂量降低几个数量级。此外，使用油佐剂能够增加rp免疫接种的免疫应答持续时间。而且，当单独的rp组分根本不引起免疫时，油佐剂与rp的组合能够提供优异的免疫应答。

为了更充分地理解本发明，提供了以下定义。

“疫苗”是具有医学作用的公知组合物，其包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。水溶液和/或油佐剂可以充当疫苗的“载体”。本发明疫苗的“免疫活性组分”是来源于动物病原体的编码抗原，其通过rp递送和表达。疫苗刺激接种的目标动物的免疫系统，其诱导保护性免疫应答。应答可以来源于动物的先天性和/或来源于获得性免疫系统，并且可以是细胞型和/或体液型。

疫苗可以通过降低接种动物后续感染或侵染的严重程度“针对感染或疾病”提供“保护”，例如通过减少病原体的数量，或缩短病原体在动物体内或动物上复制的持续时间，和减少由感染或侵染引起损伤的数量、强度或严重程度。而且，或相应地，疫苗有效减少或减轻可能由此类感染、侵染或复制引起的，或者由目标对感染、侵染或复制的应答引起的疾病的(临床)症状。此类疾病和临床体征的参考书是“默克兽医手册”(第10版，2010，c.m.kahn编著，isbn:091191093x)。将这种疫苗通俗地称为：“针对”特定病原体的疫苗。

如在本文中所使用的，术语“包含/包括(comprising及其变体comprise、comprises、comprised)”指所有要素，并且以本发明可想到的任何可能的组合指代，其被覆盖或包括在使用该术语的文本部分、段落、权利要求等等中，即使未明确叙述此类要素或组合；并且不指向排除任何此类要素或组合。因此，任何此类文本部分、段落、权利要求等也可以涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含/包括”(或其变体)被诸如“由……组成(consistof、consistingof)”、或“基本上由……组成”的术语所替代。

如在本文中所使用的，术语“复制子”指缺少一个或多个元件(例如，结构蛋白的编码序列)的经修饰的rna病毒基因组，如果这些元件存在，其将能够使亲本病毒在细胞培养物或动物宿主中成功繁殖。在适宜细胞环境中，复制子将自身扩增并可以产生一种或多种亚基因组rna种类(species)。

如在本文中所使用的，术语“α病毒rna复制子颗粒”(简称为“rp”)是一种包装在病毒结构蛋白(例如，衣壳和糖蛋白)中的α病毒衍生的复制子，所述病毒结构蛋白也来源于α病毒，例如如在pushko等[virology239(2):389-401(1997)]中所描述的。rp感染适宜的靶细胞，然后表达一种或多种插入的异源基因，但无法在细胞培养物或动物宿主中繁殖(无辅助质粒或类似组分的情况下)，因为复制子不编码α病毒结构组分(例如，衣壳和病毒糖蛋白)。

为了便于描述，使用单数的术语绝不旨在是限制性的。因此，例如，除非另有说明，否则提及“α病毒rna复制子颗粒”包括提及多个此类α病毒rna复制子颗粒。

rp“编码”抗原指包含在rp中的针对该蛋白抗原的核酸的转录和/或翻译，导致蛋白抗原的表达。通常，编码蛋白的此类核酸是开放阅读框(orf)，表明不存在会过早终止蛋白翻译的不期望的终止密码子。核酸可以是编码完整蛋白的全基因，或者可以是编码蛋白的一部分的基因片段，例如仅编码蛋白的成熟或分泌形式，即无“先导序列”、“锚定序列”或“信号序列”。核苷酸序列可以是天然或合成来源的。

可以通过公知的分子生物学技术(包括克隆、转染、重组、选择和扩增)构建和操纵表达本发明抗原的异源核酸序列。在标准教科书中非常详细地说明了这些和其他技术，如sambrook&russell:“molecularcloning:alaboratorymanual”(2001,coldspringharbourlaboratorypress；isbn:0879695773)；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(j.wileyandsonsinc.,ny,2003,isbn:047150338x)；c.dieffenbach&g.dveksler：“pcrprimers:alaboratorymanual”(cshlpress,isbn0879696540)；以及j.bartlett和d.stirling的“pcrprotocols”(humanapress,isbn:0896036421)。

对于本发明，“蛋白”是氨基酸的分子链。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白或原蛋白、或者蛋白的一部分。其中：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义中。

对于本发明，“抗原”指能够在适当情况下在目标动物中诱导保护性免疫应答的蛋白。

针对给定蛋白抗原和天然编码其的病原体或该病原体的毒株，术语“来源于(originatefrom；originatesfrom；originatingfrom)”可以互换使用。如在本文中所使用的，这些术语表示由该病原体或该病原体的毒株编码的给定蛋白抗原的未经修饰和/或修饰的氨基酸序列。针对来源于病原体的蛋白抗原的本发明核酸构建体中的编码序列可能已经过遗传操纵，以导致相对于其所来源的病原体或病原体株(包括天然减毒株)中蛋白抗原的相应编码序列，所表达的蛋白抗原具有氨基酸序列修饰、截短和/或延伸。

“动物病原体”指在兽医相关的动物(如野生动物、家畜或伴侣动物)中能够引起感染和/或疾病的任何生物实体。

对于本发明，动物病原体可以是或不是接受本发明疫苗的目标动物的天然病原体。

“油”在这里以其通常含义使用，并且是指具有相对较高的烃含量的非极性化学物质，其通常是相对粘稠的液体，具有比水轻的密度，并且是疏水性和亲脂性的。油可以是矿物来源，或“非矿物”来源的，如合成的、半合成的、动物或植物来源的。一些油是可代谢的。

术语“矿物”表示相应的油是来源于矿物来源，通常是来自石油。

“半合成油”是来源于非矿物的油，如动物油或植物油，但是通过化学或物理方法对其结构和/或组成进行了改性。

术语“佐剂”在这里以其通常含义使用，该组合物能够以非特异性方式在目标动物中刺激免疫应答。

“液体石蜡油”是一种类型的矿物油，也称为白(矿物)油或轻质液体石蜡油，cas编号：8042-47-5。其通常也可以以药用级质量获得。实例为：6vr(penreco)、52(exxonmobile)和(sonneborn)。

“维生素e乙酸酯”指cas号为58-95-7的化学化合物。一些替代名称是：生育酚乙酸酯或α生育酚乙酸酯。维生素e乙酸酯是维生素e(生育酚)的乙酸酯，其可以衍生自植物性材料，如种子、坚果、果实或叶子，或衍生自肥肉，但是也可以合成生产。因此，维生素e乙酸酯的定义包括天然、合成或半合成形式，或其混合物。维生素e乙酸酯可以以不同纯度购买获得。

“角鲨烷”指cas号为111-01-3的化学化合物。一些替代名称是：氢化鲨鱼肝油、六甲基二十四烷或全氢角鲨烯。请勿将其与角鲨烯(cas号111-02-4)混淆，角鲨烯是一种多不饱和c30油，可以作为胆固醇途径的化合物代谢。

角鲨烷的前体最初是从鲨鱼肝脏中获得的，但是出于对环境的关注，已转向其他天然来源，如橄榄油或化学合成。因此，角鲨烷的定义包括天然、合成或半合成形式，或其混合物。角鲨烷可以以各种纯度购买获得，例如：来自植物来源，来自worlee(角鲨烷，植物)或croda(pripure角鲨烷)或合成的，例如来自kuraray(角鲨烷-pe)。对于本发明，优选高纯度角鲨烷：优选纯度高于75％，更优选纯度高于80、90或甚至高于95％，以此优先顺序排列。

“乳剂”是至少两种不混溶液体的混合物，其中一种分散在另一种中。通常，分散相液滴非常小，在微米或更小范围内。对于本发明，乳剂包含油相和水相。

以任何规模制备乳剂的程序和设备是本领域所熟知的，并且例如在手册中所描述的，如“雷明顿：药学科学与实践”(2000,lippincot,usa,isbn:683306472)；和“兽医疫苗学”(p.pastoret等编著，1997,elsevier,amsterdam,isbn0444819681)。

当用于本发明的油佐剂是乳剂时，乳剂可以是油包水(w/o)乳剂，其中油是连续的外相。或者，乳剂可以是“水包油”(o/w)乳剂，其中油是分散的内相。

通过选择适宜种类和浓度的一种或多种乳化剂，可以形成并稳定地保持这种乳剂。

乳化剂位于水和油之间的中间相处，并稳定内部分散相的液滴。很多不同的乳化剂是公知的，并且适于药物用途，如在疫苗中。用于本发明油佐剂的优选乳化剂是聚山梨醇酯80，也称为聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，且可以作为吐温80购买获得。吐温80在本发明油佐剂中的用量占油佐剂的0.1-10％w/v。

对于本发明的油佐剂，当以o/w乳剂形式时，由外水相和分散的内油相组成。这有助于在本发明中将o/w乳剂形式的油佐剂与编码来源于动物病原体的抗原的rp混合。例如，通过将包含rp的水性组合物与油佐剂o/w乳剂混合。简单地手工振荡约1分钟就足以适当地将两种水性组合物混合。

或者，并且非常有利地，可以将o/w乳剂形式的油佐剂直接用于重构冻干形式的rp。这意味着可以以高度稳定的形式如冻干物提供rp，并且可以通过在向目标动物施用前的某一方便时间现场混合制备本发明的疫苗。

如在本文中所使用的，术语“约(about)”与“大约(approximately)”可以互换使用，表示在所示值百分之五十以内的值，即每毫升含有“约”1x10⁸个α病毒rna复制子颗粒的组合物含有每毫升5x10⁷至1.5x10⁸个α病毒rna复制子颗粒。

用于本发明疫苗的o/w乳剂油佐剂的实例是：xsolve^tm。xsolve是两种o/w乳剂佐剂组分的组合：diluvacforte^tm，其是基于维生素e乙酸酯的(参见ep382.271)，和microsol^tm，其是基于液体石蜡油的(参见wo2009/144.088)。

在这些乳剂中，矿物油和非矿物油油滴的体积平均尺寸可以是不同的。优选地，矿物油液滴具有亚微米尺寸。

方便地，将油佐剂乳剂与本发明的rp分开制备。因此，可以使用与保持存在于油佐剂中的rp的质量不相容的用于乳化油佐剂的方法和设备。一个实例是用于通过高压均质化获得亚微米乳剂的高剪切乳化法，如使用microfluidiser处理器(microfluidics,ma,usa)。

用于本发明疫苗的o/w乳剂油佐剂的进一步的实例是：svea^tm，其包含角鲨烷和维生素e乙酸酯，并且如wo2018/115.435中所描述的。

对于本发明，微生物或病原体的名称，比如例如委内瑞拉马脑炎病毒(vee)和禽流感病毒等，指当前适用的那些微生物各自的系统分类。但是，这些名称可能会随时间而改变，因为新的观点可能导致将其重新分类为一个新的或不同的分类群。但是，由于这不会改变微生物本身，也不会改变其抗原库，仅改变其科学名称或分类，因此这种重新分类的微生物仍在本发明的范围内。

提及分类学上的科包括在该科中的种、亚型、变体、生物型、血清型或基因型的任何微生物。

对于本发明，“猪”指猪科动物，优选地指猪属动物，例如：野生猪或家养猪、野猪、鹿豚或疣猪。还包括以性别、年龄或尺寸等任意名称表示的猪，如：母猪、公猪、阉猪、小母猪、断奶仔猪或猪仔。

如在本文中所使用的，术语“禽类”指与农业相关的禽类，如：鸡、火鸡、鸭、鹅、石鸡、孔雀、鹌鹑、鸽子、野鸡、珍珠鸡或鸵鸟。优选地，禽类是鸡、火鸡、鸭或鹅。更优选地，禽类是鸡或火鸡。最优选地，禽类是鸡。

禽类可以是任何类型，如蛋鸡、种鸡、肉鸡、组合品种或任何此类品种的亲本品系。优选地，禽类的类型是肉鸡。

如在本文中所使用的，术语“罗非鱼”可以包括来自慈稠科的近百种骨鳍鱼。罗非鱼主要是淡水鱼，栖息在小溪、池塘、河流和湖泊中，很少生活在微咸水中。

用于本发明的“试剂盒”通常是具有预定量的特定成分的容器的包装组合，试剂盒可以包括或涉及执行本发明的制备和免疫接种的说明书。

本发明的疫苗，免疫方法以及用于保护动物的化合物和用途的目标是需要免疫接种的动物，以使得动物免受由作为编码抗原来源的特定病原体引起的感染或疾病的侵害。待接种/保护/免疫目标的年龄、体重、性别、免疫学状态和其他参数不是关键的，但显然有利的是接种健康、未感染的目标并尽早接种。

如在本文中所使用的，“系统发生簇(phylogeneticcluster)”是一组流感病毒神经氨酸酶，它们已在植根于相似(同源)祖先的系统发生树或进化树中分组在一起(在同一分支上)。对于在美国发现的iav-s神经氨酸酶(na)，有两个主要的n1系统发生簇n1-经典和n1-大流行，以及两个主要的n2系统发生簇n2-1998和n2-2002。n1经典系统发生簇包含与h1n1经典猪流感病毒的na组合在一起的na。n1大流行系统发生簇包含与来自h1n1大流行流感病毒的na组合在一起的na。n2-1998系统发生簇包含与人h3n2流感病毒的na(其在1998年跳入猪中)组合在一起的na，而n2-2002系统发生簇包含与人h3n2流感病毒的na(其在2002年跳入猪中)组合在一起的na。[参见，anderson等，influenzaandotherrespiratoryviruses7(suppl.4):42-51(2013)]。

术语“非iav-s”用于修饰术语，如病原体和/或抗原(或免疫原)，以表示相应病原体和/或抗原(或免疫原)既不是iav-s病原体也不是iav-s抗原(或免疫原)，以及非iav-s蛋白抗原(或免疫原)不是来源于iav-s。

如在本文中所使用的，多价疫苗是一种包含两种或多种不同抗原的疫苗，其中差异可以是很多生物学水平的任何差异，如属、种、血清型等。在这种类型的一个特定实施方式中，多价疫苗针对两种或多种不同动物病原体，或针对相同病原体的免疫学上不同的变体刺激目标动物的免疫系统。

如在本文中所使用的，术语“药学上可接受的”作为形容词用于表示所修饰的名词是适用于药品的。例如，当将其用于描述药物疫苗中的赋形剂时，其表征了该赋形剂是与组合物中的其他成分具有相容性，并且对目标受体动物(例如，猪)无不利的有害作用。

可以使用任何可行的方法和途径来将疫苗(分别是本发明试剂盒的组分)“施用”至动物目标。通常地，最佳施用方式将由所应用的疫苗/化合物的类型、目标的特征以及旨在预防的疾病决定。根据疫苗/化合物的配制方法，可以采用不同的施用技术。例如，o/w乳剂形式的本发明疫苗/化合物，可以通过肠或粘膜途径施用，即通过滴眼剂、滴鼻剂、口服、肠内、口鼻滴剂、喷雾剂施用。其他可能的方式是通过大量施用的方法，如通过饮用水、粗喷雾、雾化、饲喂等。

“胃肠外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。

“粘膜施用”包括眼、鼻、口服、眼鼻、气管内、肠、肛门和阴道途径施用。

“局部施用”包括皮肤和经皮施用途径。

优选地，将疫苗(分别是本发明试剂盒的组分)的施用方法、时间和体积整合至目标动物可能需要的其他免疫接种的现有免疫接种时间表中，以减轻对目标动物的压力和减少人工成本。这些其他免疫本身可以通过相关联的使用方法施用，以与其注册的应用相容的方式进行。

如在本文中所使用的，针对特定蛋白(例如，蛋白抗原)的术语“抗原性片段”指该蛋白具有抗原性的片段(包括从全长蛋白中仅缺失一个氨基酸的大片段)，即能够与免疫系统的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或t细胞抗原受体)发生特异性的相互作用。例如，iav-s神经氨酸酶(na)的抗原性片段是具有抗原性的na蛋白的片段。优选地，本发明的抗原性片段对抗体和/或t细胞受体识别具有免疫优势。在特定实施方式中，针对给定蛋白抗原的抗原性片段是保留全长蛋白抗原性的至少25％的该蛋白的片段。在优选的实施方式中，抗原性片段保留了全长蛋白抗原性的至少50％。在更优选的实施方式中，抗原性片段保留了全长蛋白抗原性的至少75％。抗原性片段可以小至12个氨基酸，或者在另一个极端，其是全长蛋白中仅缺失一个氨基酸的大片段。在特定实施方式中，抗原性片段包含25至150个氨基酸残基。在其他实施方式中，抗原性片段包含50至250个氨基酸残基。

如在本文中所使用的，当两条序列的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是100％“相同的”或具有100％“同一性”。因此，当两条氨基酸序列50％的氨基酸残基相同时，一条氨基酸序列与另一条氨基酸序列是50％“相同的”。序列比较是在给定蛋白(例如，所比较的蛋白或多肽的一部分)包含的氨基酸残基的连续嵌段上进行的。在一个特定的实施方式中，考虑了可能改变两条氨基酸序列之间对应性的选定的缺失或插入。

如在本文中所使用的，可以使用c,macvector(macvector,inc.cary,nc27519)、vectornti(informax,inc.md)、oxfordmoleculargroupplc(1996)和clustalw算法，利用默认比对参数和针对同一性的默认参数确定核苷酸和氨基酸序列的同一性百分比。还可以使用相同或相似的默认参数，将这些可购买获得的程序用于确定序列相似性。或者，可以使用默认过滤条件下的高级blast检索，例如使用默认参数的gcg(geneticscomputergroup，gcg软件包程序手册，第7版，madison,wisconsin)累积程序。

当α病毒rna复制子颗粒分开存放但意欲在施用前与其他疫苗组分混合时，可以将α病毒rna复制子颗粒存放在类似于其他组分的稳定水溶液中，例如缓冲液，或高蔗糖溶液。

本发明的疫苗可以通过任何标准“免疫动物的方法”容易地施用。本领域技术人员将意识到的是，考虑目标动物和待施用疫苗的特征来选择施用途径。优选地，针对每种类型的目标动物和施用途径适当地配制疫苗组合物。

对于本发明，“微生物的亚基”可以是生物或合成分子，如蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质或核酸分子。

进一步优化本发明的疫苗、试剂盒、方法或用途是技术人员完全可以实现的。通常，这涉及对接种/免疫功效的微调，以进一步改善其提供的免疫保护。这可以通过调整所施用材料的剂量、体积、佐剂或抗原含量，或者通过采用不同途径、方法或方案施用来完成。所有这些均在本发明的范围内。

还应理解的是，本发明不限于本文公开的特定构造、工艺步骤和材料，因为此类构造、工艺步骤和材料可以有所变化。还应理解的是，本文所采用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而并非旨在限制本发明，因为本发明的范围将仅由所附权利要求及其等同物限制。

序列表

下列非限制性实施例用于提供对本发明的进一步理解，但绝不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。

实施例

实施例1

油佐剂改善猪对编码猪流感病毒血凝素(hemagglutinin)的α病毒rna复制子颗粒的抗体应答的程度和持续时间

材料和方法

根据此前的描述[参见us9,441,247b2；其内容通过引用并入本文]构建设计用于表达血凝素(ha)基因的vee复制子载体，具有下述修饰：对ha基因插入进行序列优化(atum,ca,usa)。使用限制性内切酶asci和paci消化来源于tc-83的复制子载体“pvek”[在u.s.9,441,247b2中公开和描述]。使用限制性内切酶asci和paci同样地消化dna质粒，所述dna质粒含有具有5’侧翼序列(5’-ggcgcgccgcacc-3’)[seqidno：1]和3’侧翼序列(5’-ttaattaa-3’)[seqidno：2]的n1或n2基因的密码子优化的开放阅读框序列。然后，将合成的基因盒连接至经消化的pvek载体，并将所得到的克隆重新命名为“pvhv-n1-大流行”、“pvhv-n1-经典”、“pvhv-n2-2002”和“pvhv-n2-1998”。选择“pvhv”载体命名法指来源于pvek的复制子载体，其含有在pvek的多个克隆位点中通过asci和paci位点克隆的转基因表达盒。

根据此前描述的方法[u.s.9,441,247b2和u.s.8,460,913b2；其内容通过引用并入本文]制备tc-83rna复制子颗粒。简言之，在使用megascript^tmt7rna聚合酶和帽类似物(promega,madison,wi)进行体外转录之前，用noti限制性内切酶将pvhv复制子载体dna和辅助dna质粒线性化。重要的是，如此前所述[kamrud等，jgenvirol.91(pt7):1723-1727(2010)]，在制备中使用的辅助rna缺乏vee亚基因组启动子序列。将复制子和辅助组分的纯化rna合并并与vero细胞悬液混合，在4mm比色杯中电穿孔，然后再将其放入optipro^tmsfm细胞培养基(thermofisher,waltham,ma)中。孵育过夜后，纯化α病毒rna复制子颗粒，使用含5％w/v蔗糖和1％v/v猪血清的磷酸盐缓冲液配制，通过0.22微米膜滤器进行灭菌，并分装成小份保存。在vero细胞单层上使用感染-免疫荧光测定法确定功能性rp的效价(titer)。根据由包装的复制子编码的抗原鉴定rp的批次。

将针对猪流感病毒的抗体为阴性的10只猪仔随机分组，每组5只猪。制备表达h3n2猪流感病毒株的血凝素抗原的rp疫苗，效价为5x10^5个rp/剂。即将接种疫苗之前，仅rp组的疫苗用无菌pbs稀释剂以1：1(v/v)稀释，而rp+佐剂组的疫苗用xsolve佐剂以1：1(v/v)稀释。然后，使用2.0ml适当的材料对猪进行肌内接种。在研究第0天和第21天进行接种程序，每次均使用新鲜制备的疫苗。使用h3n2猪流感病毒抗原对试验期间收集的血清进行血凝抑制(hi)活性测定。结果报告为具有抑制活性的最高稀释度；小于1：10的效价报告为1：9；>640的效价报告为1：641。几何平均效价如表1中所示。

表1：几何平均血凝抑制(hi)效价

在相对较低剂量5x10^5个rp下，无佐剂疫苗诱导强度较低、短暂和瞬时的hi效价。而相比之下，在加强接种后，佐剂疫苗诱导较高hi效价，并且这些hi效价一直保持升高，直到84天试验结束时。

该发现首次明确地表明，xsolve能够对以极低剂量(5x10^5个rp)的猪rp免疫产生如此巨大的影响。使用不含佐剂rp疫苗的先前研究必须每剂量使用高得多的量的rp组分，例如：fmdrp为1x10^9个和sivrp为5x10^7个。

实施例2

油佐剂改善猪对编码猪流感病毒抗原的多价α病毒rna复制子颗粒的抗体应答的程度和持续时间

如表2中所示，将来自猪流感阴性猪群的断奶猪仔随机分为治疗组。使用8种表达不同猪流感病毒株的ha或na的单独rna颗粒抗原混合用于猪流感的多价α病毒rna复制子颗粒疫苗，每种抗原混合至约1x10^7个rp/剂。包括2种h3抗原、4种h1抗原、1种n1抗原和1种n2抗原，并进行配对血清学测定(hi或ni)以评估对每种抗原的抗体应答。研究以重复设计方式进行，一半动物使用h1n1病毒攻击，另一半使用h1n2病毒攻击。

表2：实施例2的实验方案

发现使用xsolve油佐剂显著增加针对全部8种疫苗组分的血清学应答的程度。尽管这两种疫苗制剂均对肺病变产生了保护作用(图1a-1b)，但是，当通过h1n1和n1n2流感病毒的鼻脱落(nasalshedding)测量时，发现添加xsolve改善了疫苗的功效(图1c-1d)。图1-1f显示了相应的ni效价评分。在图2a-2f中显示了佐剂对hi效价的影响。

该研究表明，无佐剂多价sivrp诱导针对所有级分(fraction)的抗体，但是添加油佐剂显著增强了对所有级分的免疫应答。鼻脱落减少和肺评分更紧密地聚集代表了重要的临床优势，例如涉及在兽群或人群中感染水平传播的限制。

实施例3

在第一次接种时具有n1抗体的断奶猪仔中含有佐剂的4联na-rp疫苗针对h1n1感染的功效

开展免疫接种-攻击研究，以确定两个剂量水平含有佐剂的4联na-rp疫苗的功效和免疫原性。佐剂疫苗包含4种rp构建体，其每一种均单独地编码当代u.s.iav-s分离株的单个、不同的na基因。这些na基因共同代表了两个n1系统发生(phylogenetic)簇(n1-经典和n1-大流行)，以及两个n2簇(n2-1998和n2-2002)(见表3)。在第一次接种时，在n1-经典抗原的抗体阳性的断奶猪仔中以1ml/剂通过两次肌内(im)接种施用佐剂疫苗。检测了含有佐剂的4联na-rp疫苗针对异源n1(h1n1病毒)攻击感染的功效。

材料和方法

na-rp抗原的构建：

复制缺陷型α病毒rna复制子颗粒(rp)编码神经氨酸酶(neuraminidase)(na)基因，并且基本上如本文实施例1中所述制备。

表3：实施例3的na-rp构建体中编码的n1和n2基因

n＝每组10只猪

病毒

攻击病毒是从usda国家兽医服务实验室获得的。a/猪/伊利诺伊/a01554351/2015(h1n1)具有h1-γ簇的ha基因和n1-经典簇的na基因。在mdck细胞培养物中繁殖病毒。感染融合细胞约48小时，直至在超过70％的细胞单层中出现明显的细胞病变作用为止。收获时，从容器中除去上清液，并且在冷冻保存病毒之前通过离心澄清。

动物

根据血清学筛查从高健康猪群种选择断奶猪仔以确认缺乏预先存在的针对疫苗和攻击毒株的hi或ni(神经氨酸酶抑制)抗体。动物是雄性和雌性混合的，并且在第一次接种时约3周龄。

接种和攻击

表4中概述了治疗组。以10^6个拷贝每种rp/剂配制4联na-rp疫苗，根据基于免疫荧光的效价测定对功能性rp进行定量。在由1％猪血清和5％蔗糖组成的稳定剂中配制na-rp抗原。安慰剂疫苗由不含抗原的相同稳定剂组成。将疫苗与xsolve油佐剂混合(1:1v/v，1ml剂量)，然后立即通过im途径向3周龄和7周龄的猪施用。在接种后，通过ifa检测对剩余疫苗物质反滴定(back-titrated)确定剂量水平。在第一次接种当天，第二次接种当天和攻击感染当天收集血清样品。

在第一次接种前1天对所有猪称重，向在n1-经典抗体阳性组的猪皮下注射2ml/kg剂量的n1-经典超免疫血清(对n1-经典抗原的抗-ni抗体效价为1:2560)。

表4：如实施例3中的使用h1n1攻击毒株的治疗组

(n＝每组10只猪)

在第二次免疫后3周时，向猪施用攻击感染。将攻击物质h1n1(h1-γ-n1-经典)配制为目标剂量10^6.5tcid50/猪(体积为6ml)。通过气管内途径施用攻击物质。通过对剩余攻击物质反滴定确认攻击病毒剂量。在攻击后-1、1、3和5天对所有猪取鼻拭子样品。

在攻击后5天进行尸检。在有执照兽医的监督下，以5dpc过量的巴比妥酸盐将猪安乐死。收集并观察肺，以记录受宏观病变影响的每个肺叶的表面积，从而得出全面的肺病变评分百分比。从所有猪中收集支气管肺泡灌洗液和鼻拭子样品以测量病毒滴度。收集肺切片用于微观病变的组织病理学分析。

免疫应答分析：

通过ni检测确定在猪血清样品中的iav-s特异性抗体。将血清在56℃下热灭活30-60分钟。使用经过微小改进的sandbulte&eichelberger方法(methodsmolbiol1161:337-45,2014)进行ni检测。简而言之，将血清的2倍系列稀释液与表达的蛋白抗原在胎球蛋白包被的96孔板上等体积混合，并在37℃下孵育过夜。在室温下添加花生凝集素辣根过氧化物酶缀合物2小时以结合剥离唾液酸的胎球蛋白分子。通过tmb显色底物获得信号，并在650nm处读取结果。从所有孔扣除不含na抗原的阴性对照的平均光密度(od)。然后将测试样品的od值在0-100％范围内标准化，其中将阳性对照孔(含有na抗原，但无血清)的平均od定义为100％。将ni抗体效价定义为抑制≥50％的神经氨酸酶活性的样品的最高稀释度。

肺部病理学检查

在肺前叶和后叶的网格图上记录了在所有肺叶外部观察到的肉眼可见病变(界限清楚的紫色至李子色实变(consolidation))。根据受病变影响的网格的数量计算每头猪的综合评分(肺部病变百分比)。

病毒脱落

使用感染培养基[dulbeco最低限度基本培养基(dmem)，补充了0.3％牛血清白蛋白，组分v；2mml-谷氨酰胺；25μg/ml庆大霉素；2μg/ml胰酶ix]将鼻拭子样品和bal液进行10倍系列稀释，并将100μl每种稀释液加入96孔板中的融合mdck细胞中(四复孔)。将板在37℃、5％co2条件下孵育，并在72小时后通过对每孔的上清液进行血凝素检测观察是否存在感染性病毒。通过法计算iav-s滴度，并以log10tcid50/ml表示。

结果

接种多价na-rp的猪的免疫应答如图3中所示。值得注意的是：

-在接受其第一次接种前一天被动转移了n1-经典超免疫血清的猪在接种时n1-经典抗体的效价为40-80。

-使用具有xsolve佐剂的4联na-rp疫苗接种2次后，血清阴性和n1-抗体血清阳性的猪均显示出其n1-经典抗体效价的显著增加。这表明，即使在针对rp编码抗原的抗体呈阳性的目标动物中，使用油佐剂进行rp接种也是有效的。

-在接种n1经典阴性/安慰剂疫苗的组中，猪的ni效价仍保持血清阴性。

图4中显示了在肺部病变方面，4联na-rp疫苗针对攻击性感染的功效。值得注意的是，无论在其第一次接种时是接种具有或不具有n1-经典抗体的猪，4联na-rp接种在减少肺部病变方面均是非常有效的。与两个接种安慰剂的组相比，在这两组中的肺部病变百分比均显著减少。

实施例4

相对于铝佐剂或水，油佐剂改善猪对编码猪流行性腹泻病毒抗原的α病毒rna复制子颗粒的抗体应答的程度

将约3周龄的9只猪仔随机分组，每组3只动物。制备表达猪流行性腹泻病毒(pedv)刺突糖蛋白的α病毒rna复制子颗粒疫苗，并将其冻干在20剂量的小瓶中。在研究第0天，给猪肌内注射1.0ml的α病毒rna复制子颗粒疫苗，该疫苗已用水、氢氧化铝佐剂或xsolve佐剂再水化。在研究第21天，使用新的疫苗小瓶重复这一过程。通过免疫荧光测定确定再水化后每剂α病毒rna复制子颗粒的最终效价，对于所有组均为约7x10^6个rp/剂。测定试验期间收集的血清的pedv中和抗体，见表5。

表5：不同佐剂对产生中和抗体的影响

给予无佐剂疫苗的猪在接种两剂疫苗后具有较少或无法检测到的中和抗体。所有给予氢氧化铝佐剂疫苗的猪均产生了中和抗体，该抗体刚好高于检测限。而相比之下，接种两剂疫苗后，xsolve佐剂疫苗诱导出较高水平的中和抗体，全部三只猪产生的最低抗体效价均高于在其他检测组中观察到的峰效价。因此，使用氢氧化铝作为佐剂是无效的，油佐剂极大地优于氢氧化铝佐剂。

实施例5

油佐剂改善在鸡中编码流感病毒抗原的α病毒rna复制子颗粒的接种功效

将一日龄鸡随机分组，每组10只鸡。以1x10^8个rp/剂的效价制备表达h3n2猪流感病毒株血凝素抗原的α病毒rna复制子颗粒疫苗。将用于仅接受rp组的疫苗用无菌pbs稀释剂按照1：1(v/v)稀释，同时将α病毒rna复制子颗粒加佐剂组的疫苗用xsolve佐剂按照1：1(v/v)稀释，然后立即接种。在接种后研究日第0、7和14天，测定鸡血清的血凝素抑制(hi)效价。

表6：油佐剂对hi效价的影响

与无佐剂和安慰剂疫苗相比，添加xsolve佐剂的α病毒rna复制子颗粒疫苗在单次接种后引起了禽类的hi效价的明显增加。

实施例6

油佐剂改善在鸡中表达ibdv抗原的α病毒rna复制子颗粒疫苗的功效

该接种-攻击实验检测了油佐剂对rp接种-功效的影响，该rp表达来自感染性法氏囊病病毒(ibdv)faragher52/70毒株的vp2-4-3多蛋白抗原。测试动物是针对ibdv的抗体为阴性的spf(无特定病原体)级鸡。组规模为5或10只鸡。在出生当天(孵化日)通过皮下途径接种；一组(n＝5)用磷酸盐缓冲液(pbs)假接种。一个接种组接受在水性缓冲剂中的rp疫苗，另一个疫苗组接受与xsolve佐剂1：1混合的rp疫苗。在接种后28天，通过滴眼途径使用强毒ibdv毒株cs89对所有组进行攻击性感染。通过在攻击后10天进行尸检监测接种功效，根据针对ibdv感染公知的标准，对法氏囊组织的大体病变和组织病理学变化进行评分。

表7：油佐剂对针对严重ibdv攻击的rp接种-功效的影响

显然地，向rp疫苗中添加油佐剂对针对严重攻击性感染的接种功效产生了显著的积极影响：将鸡的免疫应答从零提高到完全保护。

实施例7

油佐剂还在鱼中改善α病毒rna复制子颗粒疫苗的功效

通过如本文所述的标准方法制备表达真鲷虹彩病毒(redseabreamiridovirus)(rsiv)主要衣壳蛋白的α病毒rna复制子颗粒疫苗。用0.05ml疫苗肌内接种罗非鱼，然后在接种后不同时间进行攻击。在研究中，每次处理和每个攻击时间使用30条鱼。将α病毒rna复制子颗粒疫苗与pbs或与svea(双重非矿物油佐剂)按照1：1(v/v)混合，随后立即接种。每次处理的rp效价为1x10^7个rp/剂。对照鱼接种安慰剂疫苗。

表8a：油佐剂对罗非鱼存活百分比的影响

表8b：油佐剂对罗非鱼相对存活百分比的影响

在“3周低剂量”和“6周高剂量”攻击时，佐剂大大提高了接种rp疫苗的鱼的相对存活率。其他两种攻击处理产生了相同结果。因此，与无佐剂rp疫苗相比，含有佐剂的α病毒rnarp疫苗明显更有效，并且即使仅单次接种也能提供有效的疫苗接种。

实施例8

同时和并行使用rp和油佐剂的功效

如实施例3中所述，使用α病毒rna复制子颗粒的4联猪流感病毒na疫苗，在猪中进行了一项实验。将其用于说明疫苗组分(rp和油佐剂)不同类型使用方法的功效。

材料和方法

在约4周龄和7周龄时接种猪。如实施例3中所述，4联na疫苗是双基因n1和双基因n2rp构建体的混合物，每种均以约2x10^6个rp/剂施用。每组均包含4只猪。表9中列出了检测方案的安排。第2组接受同时使用的narp与xsolve佐剂的混合物。

第3组和第4组检测了并行使用rp和油佐剂的作用：在约10分钟内施用两者，并在颈部同侧(分隔>5cm)或在颈部对侧。

纳入一个对照组(第5组)，使用编码猪流感hah1抗原的rp。以约1x10^7个rp/剂施用。

在第一次接种当天，第二次接种当天和第二次接种后7天时收集血清。在针对4种na类型的每一种的单独的同源ni测定中检测这些血清。

测得的所得到的ni效价如图5和图6中所示，其中图5中显示了随着时间的推移测量的三个时间点的针对n1经典na抗原的ni效价，包括标准偏差。图6表示在第二次接种后7天时组合的4种na类型的组平均ni效价。

表9：实施例8的实验方案

结果和结论

从实施例8中测量的结果，可以观察到以下几种作用：

-在所测量的三个时间点，4种na类型的ni效价模式几乎是相同的，因此针对nani经典的图5中显示的结果表明了针对其他3种na类型的效价模式。

-而且，如图6中所示，在7dpv2时，4种na类型的ni效价应答模式基本相同。

-正如所预期的，hah1rp对照(第5组)的ni效价结果未诱导ni效价；这设定了针对特定应答的效价阈值。

-除了一些实验上的变异以外，接受rp和油佐剂的第2-4组中的大部分ni效价均显著高于仅接受rp的组(第1组)。这说明油佐剂可强烈促进rp免疫。

-以同时使用的方式接受rp和油佐剂的组(第2组)，证实了已在此前的实施例中观察到的油佐剂的较强影响。

-并行使用rp和油佐剂的免疫作用(第3-4组)非常接近同时使用：强烈刺激rp免疫应答。施用部位不同没有明显影响。

本发明不限于本文所述具体实施方式的范围。实际上，除了本文描述的那些以外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这样的修改均旨在落入所附权利要求的范围内。

还应理解的是，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并提供用于描述。