LKB1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及lkb1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

腹主动脉瘤(abdominalaorticaneurysm，简称aaa)是指腹主动脉局部呈瘤样扩张，管腔直径超过正常值50％的一种病理状态，它是具有潜在致死危险的疾病，一旦瘤体破裂，死亡率超过80％。在美国，腹主动脉瘤的年发病率约为20-40人/10万人，每年约有15000人死于腹主动脉瘤，占疾病死因的第13位，在我国腹主动脉瘤的发病率也呈逐年上升的趋势，65岁以上男性超声检出腹主动脉瘤的发病率高达5％。腹主动脉瘤管腔瘤样扩张常伴随腹主动脉管壁慢性炎症浸润、平滑肌细胞层变薄、弹力纤维结构破坏和细胞外基质合成/降解失衡。腹主动脉瘤的发病机制尚未清楚，目前认为与平滑肌细胞表型转化、炎症反应、氧化应激和家族遗传等诸多因素相关，临床上一直未找到防治腹主动脉瘤的有效药物。因此，进一步阐明腹主动脉瘤的发生机制并寻找有效的干预措施是当前心血管病领域中一个亟需解决的重大课题。

血管平滑肌细胞位于血管中膜，是血管中层的唯一细胞成分，可以保持血管的弹性和结构，但它与aaa疾病的发生密切相关。基质金属蛋白酶(matrixmetalproteinase,mmps)是一种具有许多共同生化活性的可降解细胞外基质的酶。心血管疾病的某些危险因素，如血管紧张素ii(angii)，作用于平滑肌细胞的表面，可以激活细胞内信号传导通路，最终导致相关基因的表达，包括基质金属蛋白酶。mmps活化后，对细胞外基质(ecm)的降解作用增强，相应地血管壁弹性蛋白减少，导致血管壁对血流和血压的抵抗力减弱，容易诱发aaa。基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,mmp-2)作为mmps中重要一员，是平滑肌细胞中最主要的mmp，参与了aaa的生理病理过程。

lkb1基因定位于人染色体19p13.3带，编码的lkb1蛋白为一种由433个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。lkb1基因广泛存在于人体的多种组织中，被认为是一个抑癌基因，并且作为多个系统中细胞极化和能量代谢中的一个中心调节因子，在体内发挥重要作用。近年研究发现，lkb1在内皮细胞中可以调节内皮功能和血压，并且在巨噬细胞中的lkb1可以抑制炎性反应，但是其在平滑肌细胞中的作用还不清楚。

条件性基因敲除是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因的实验技术。条件性基因敲除一般采用cre/loxp重组系统，cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个loxp位点之间的特异性重组，使loxp位点间的基因序列被删除或重组。cre重组酶介导两个loxp位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分为三种情况：1)如果两个loxp位点位于一条dna链上，且方向相同，cre重组酶能有效切除两个loxp位点间的序列；2)如果两个loxp位点位于一条dna链上，但方向相反，cre重组酶能导致两个loxp位点间的序列倒位；3)如果两个loxp位点分别位于两条不同的dna链或染色体上，cre重组酶能介导两条dna链的交换或染色体易位。条件性基因敲除对于在特定的组织细胞和/或特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供lkb1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

lkb1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用，所述lkb1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明优选的，所述lkb1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用，包括以下两个方面：

(1)将lkb1基因作为作用靶标应用于抗腹主动脉瘤药物的制备；

(2)将lkb1基因作为作用靶标应用于抗腹主动脉瘤药物的筛选。

根据本发明优选的，所述lkb1基因作为作用靶标应用于抗腹主动脉瘤药物的制备是指：将lkb1基因作为药物或制剂的作用靶标，来研制针对腹主动脉瘤的药物或制剂，从而提高平滑肌细胞lkb1基因的表达水平。

根据本发明优选的，所述lkb1基因作为作用靶标应用于抗腹主动脉瘤药物的筛选是指：将lkb1基因作为药物或制剂的作用靶标，对药物或者制剂进行筛选，以找到可以促进平滑肌细胞lkb1基因表达的药物或制剂作为抗腹主动脉瘤的备选药物或制剂。

根据本发明优选的，所述抗腹主动脉瘤药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白质或慢病毒。

进一步优选的，所述核酸分子包括但不限于：反义寡合苷酸、双链rna或者短发夹rna。

进一步优选的，所述慢病毒，其有效成分含有如seqidno.1所示的核苷酸序列，是经过病毒包装而成，通过表达lkb1基因来降低腹主动脉瘤的发生。

本发明的技术特点和有益效果：

本发明通过构建平滑肌特异性敲除lkb1的基因敲除小鼠，公开了lkb1基因在调节平滑肌中基质金属蛋白酶2表达中的重要作用；同时利用皮下泵入angii来构建小鼠腹主动脉瘤模型，发现lkb1基因敲除小鼠能够显著增大腹主动脉瘤发病率，从而为制备或筛选促进平滑肌细胞lkb1基因表达的药物或制剂作为抗腹主动脉瘤的备选药物或制剂提供了理论依据。

本发明以lkb1基因为作用靶标，制备或筛选抗腹主动脉瘤的药物。药物筛选主要是针对未知药物，将药物作用于靶标基因，根据该药物是否可以促进靶标基因的表达筛选得到抗腹主动脉瘤的药物；药物制备主要是以靶标基因为基础，有针对性地制备或构建抗腹主动脉瘤的药物以促进靶标基因的表达；筛选或制备的药物在腹主动脉瘤的治疗中具有重要意义。本发明制备了lkb1基因的慢病毒(lenti-lkb1)，通过小鼠尾静脉注射lkb1基因的慢病毒(lenti-lkb1)，能够显著减小小鼠腹主动脉瘤发病率。

附图说明

图1为条件性敲除lkb1基因的策略流程图；

图2为lkb1^smko小鼠主动脉平滑肌细胞中lkb1蛋白的表达情况；

图中，control代表对照鼠，lkb1^smko代表lkb1基因敲除鼠，β-actin是一种重要的细胞骨架蛋白，为内参蛋白；

图3为lkb1^smko小鼠主动脉平滑肌细胞中mmp-2蛋白的表达情况；

图中，control代表对照鼠，lkb1^smko代表lkb1基因敲除鼠；β-actin是一种重要的细胞骨架蛋白，为内参蛋白；

图4为小鼠腹主动脉瘤的成瘤情况；

图5为小鼠尾静脉注射慢病毒lenti-lkb1后腹主动脉瘤的成瘤情况；

图6为小鼠尾静脉注射慢病毒lenti-lkb1后主动脉平滑肌细胞中lkb1蛋白和mmp-2蛋白的表达情况；图中，β-actin是一种重要的细胞骨架蛋白，为内参蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的保护范围。

实施例中涉及药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及实验操作，若无特殊说明，均按照本领域常规操作进行。

实施例1小鼠腹主动脉瘤模型的构建

将lkb1^flox/flox小鼠与平滑肌特异表达cre重组酶的小鼠sm22-creer^t2交配，得到lkb1^flox/flox/cre⁺小鼠，连续五天向lkb1^flox/flox/cre⁺小鼠腹腔注射1毫克他莫西芬药物(sigma公司)，诱导cre重组酶进入细胞核，从而将lkb1^flox/flox/cre⁺小鼠中loxp位点之间的序列重组掉，即将lkb1^flox/flox/cre⁺小鼠平滑肌内的lkb1基因敲除掉，抑制了lkb1基因的功能，从而得到平滑肌特异性敲除lkb1基因的小鼠，该小鼠用lkb1^smko表示。图1为条件性敲除lkb1基因的策略。

腹腔注射他莫西芬药物后第16天，将lkb1^smko小鼠的主动脉取出，同时取对照鼠(注射同样剂量他莫西芬药物的lkb1^flox/flox/cre^-小鼠)的主动脉，分别剥去主动脉外膜，加蛋白裂解液研磨样品，各取40微克蛋白上样做westernblot验证，用lkb1蛋白的抗体检测，结果如图2所示，发现lkb1^smko小鼠的主动脉中大部分lkb1基因被去除，无法表达lkb1蛋白，从而为后续的研究提供了很好的动物模型。

基质金属蛋白酶(matrixmetalproteinase,mmps)是一种可降解细胞外基质的酶，mmps的表达活化容易诱发腹主动脉瘤，其中基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2，mmp-2)是mmps中的重要一员，也是平滑肌细胞中最主要的mmp。腹腔注射他莫西芬药物后第16天，将lkb1^smko小鼠的主动脉取出，同时取对照鼠(注射同样剂量他莫西芬药物的lkb1^flox/flox/cre^-小鼠)的主动脉，分别剥去主动脉外膜，加蛋白裂解液研磨样品，各取40微克蛋白上样做westernblot验证，用mmp-2抗体检测mmp-2的表达情况，结果如图3所示，发现lkb1基因敲除后，lkb1^smko小鼠的主动脉中mmp-2大量表达，增大了腹主动脉瘤的发病率。

将lkb1^smko小鼠回交至ldlr^-/-背景8代以上，使之非常接近ldlr^-/-背景，以减少个体之间的差异，从而得到较为稳定的同时敲除lkb1基因和ldlr基因的双敲小鼠，双敲小鼠用ldlr^-/-/lkb1^smko表示，同窝不带cre重组酶基因的ldlr^-/-/lkb1^flox/flox小鼠作为对照。

对10周龄的对照小鼠ldlr^-/-/lkb1^flox/flox和双敲小鼠ldlr^-/-/lkb1^smko背部皮下植入alzet微量泵，分别按照1000ng/kg/min的速度泵入angii，连续泵入28天，即可得到小鼠腹主动脉瘤模型。

实施例2平滑肌lkb1基因在小鼠腹主动脉瘤中的作用

将实施例1得到的双敲小鼠ldlr^-/-/lkb1^smko和对照小鼠不带cre重组酶基因的ldlr^-/-/lkb1^flox/flox分为四组，每组至少6只，在10周龄时进行处理，四组的小鼠及处理情况如下：

第一组：对照小鼠ldlr^-/-/lkb1^flox/flox，泵入生理盐水；

第二组：对照小鼠ldlr^-/-/lkb1^flox/flox，泵入angii；

第三组：双敲小鼠ldlr^-/-/lkb1^smko，泵入生理盐水；

第四组：双敲小鼠ldlr^-/-/lkb1^smko，泵入angii；

泵入的操作流程为：在小鼠背部皮下植入alzet微量泵，分别按照1000ng/kg/min的速度泵入angii，或者分别泵入等量生理盐水，连续泵入28天。

28天后安乐死小鼠，取小鼠主动脉，小鼠腹主动脉瘤的成瘤情况如图4所示，发现敲除lkb1基因后能够显著增大腹主动脉瘤发病率。

实施例3针对lkb1基因的慢病毒的制备

1、pfugw-lkb1载体的构建：

1)将pfugw质粒(addgene购买，#14883)经内切酶hindiii和kpni双酶切，双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收；

2)以人平滑肌细胞cdna为模板，经pcr扩增，纯化，制得lkb1基因片段；

pcr扩增的特异引物核苷酸序列如下：

正向引物：5’-aagcttatggaggtggtggacccgcagc-3’；

反向引物：5’-ggtacctcactgctgcttgcaggccgac-3’；

lkb1基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；

3)将步骤2)制得的lkb1基因片段经内切酶hindiii和kpni双酶切，制得lkb1基因双酶切产物；

4)将步骤3)lkb1基因双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含1302bp大小的dna片段，纯化，得到纯化后的lkb1基因双酶切产物；

5)将步骤1)回收后的pfugw双酶切产物和步骤4)纯化后的lkb1基因双酶切产物进行连接，制得连接产物；

6)将步骤5)制得的连接产物转化大肠杆菌，经抗性筛选和测序验证后，提取阳性质粒pfugw-lkb1。

2、lkb1基因的慢病毒(lenti-lkb1)的包装制备

将上述得到的阳性质粒pfugw-lkb1和辅助质粒pspax2(addgene购买，#12260)、pmd2.g(addgene购买，#12259)，按照4：3：1的质量比，通过转染试剂ultra-pei，共转入293t细胞，转染后3天收集病毒，经超离心纯化，同时测定病毒滴度，制得表达lkb1的慢病毒lenti-lkb1。

实施例4lkb1基因的慢病毒对腹主动脉瘤的作用

将ldlr^-/-小鼠分为两组，每组至少6只，在10周龄时进行处理，分别尾静脉注射慢病毒lenti-lkb1及对照无关慢病毒lenti-lacz(山东维真生物科技有限公司)，两组的小鼠及处理情况如下：

实验组：ldlr^-/-小鼠，注射lenti-lkb1；

对照组：ldlr^-/-小鼠，注射lenti-lacz；

两组小鼠均在背部皮下植入alzet微量泵，分别按照1000ng/kg/min的速度泵入angii，连续泵入28天。28天后安乐死小鼠，取小鼠主动脉，小鼠腹主动脉瘤的成瘤情况如图5所示，小鼠尾静脉注射慢病毒lenti-lkb1后能够显著减小腹主动脉瘤发病率。

取上述小鼠主动脉，分别剥去主动脉外膜，加蛋白裂解液研磨样品，各取40微克蛋白上样做westernblot验证，分别用lkb1蛋白的抗体和mmp-2的抗体检测lkb1蛋白和mmp-2的表达情况，结果如图6所示，发现小鼠尾静脉注射慢病毒lenti-lkb1可以过表达lkb1蛋白，减少mmp-2的表达量，从而降低小鼠腹主动脉瘤的发病率。

以上结果证实了lkb1基因在抑制mmp-2表达中的关键作用，平滑肌敲除lkb1基因能够增大患腹主动脉瘤的几率，而通过给ldlr^-/-小鼠尾静脉注射lkb1基因慢病毒的方法加以治疗，能够减小腹主动脉瘤的患病率。

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<110>山东大学

<120>lkb1基因在制备抗腹主动脉瘤药物中的应用

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