一种增强蛋清ACE抑制肽稳定性的方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法。

背景技术：

生物活性肽具有抗氧化、抗高血压、免疫调节和降血糖等生物功能，其中血管紧张素转化酶(angiotensinconverting-ienzyme，ace)抑制肽是一类重要的功能活性肽，通过抑制ace活性而起到显著的降血压作用。然而大量实验证实活性肽不稳定，在体内容易被蛋白酶和肽酶降解，以某种方式克服胃肠降解实现ace抑制肽以活性形式能够被小肠有效的吸收和足够剂量运输到靶器官的部位是目前需要解决的瓶颈的问题。

蛋清ace抑制肽rvpsl在经模拟胃肠道体系其结构和活性都有所降低，为克服蛋清肽容易受胃肠道蛋白酶和肽酶的降解，对ace抑制肽的稳态化修饰成为解决该瓶颈的一个思路。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法。该方法过程快捷，且所制备的氧化石墨烯-活性肽复合材料具有良好的生物兼容性，而且克服了蛋清活性肽在胃肠道不稳定的缺点，能够以完整活性形式与靶点作用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法，包括以下步骤：

(1)将氧化石墨烯加入水中，超声处理，得到氧化石墨烯分散液；

(2)将偶联剂加入到步骤(1)得到的氧化石墨烯分散液(棕黄色)中，并搅拌至偶联剂全部溶解后加入活性肽进行酰胺反应得到反应液；

(3)将反应后的反应液离心后冷冻干燥，得到氧化石墨烯-活性肽复合材料。

进一步的，所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的质量浓度为0.1mg/ml-1mg/ml。

进一步的，所述超声处理的功率为30khz-40khz，处理时间为1-3h。

进一步的，所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。

进一步的，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的质量与氧化石墨烯分散液的体积比为1∶2∶1g/ml，反应时间为5-7h。

进一步的，步骤(3)中所述离心条件为4000r/min-6000r/min，5-15min，并重复2-3次。

进一步的，所述活性肽序列为rvpsl。

一种氧化石墨烯-活性肽复合材料，所述氧化石墨烯-活性肽复合材料由上述的方法制备得到。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述的增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法中，将活性肽和氧化石墨烯分散液通过加入偶联剂进行酰胺反应进行键合，制备方法便捷，成本低，应用范围广；

2、本发明所述的增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法制备得到的氧化石墨烯-活性肽复合材料在胃肠道中能够克服胃肠降解，使得蛋清ace抑制肽以活性形式进而能够被小肠有效的吸收和足够剂量的方式运输到靶器官的部位，具有良好的潜力和应用前景。

附图说明

图1为氧化石墨烯和本发明所述氧化石墨烯-活性肽复合材的红外光谱图；

图2为氧化石墨烯的扫描电镜图；

图3为本发明所述氧化石墨烯-活性肽复合材的扫描电镜图；

图4为氧化石墨烯和本发明所述氧化石墨烯-活性肽复合材的x-射线衍射图；

图5为氧化石墨烯和本发明所述氧化石墨烯-活性肽复合材的x-射线光电子能谱图。

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。

本实施例提供了一种增强蛋清ace抑制肽稳定性的方法，包括以下步骤：

(1)取50mg氧化石墨烯粉末于烧杯中，溶于100ml的去离子水，搅拌均匀后超声分散处理2h，将所得溶液以8000r/min的速度离心15min，取上清液，即得到氧化石墨烯分散液(棕黄色)。

通过紫外分光光度法测定上述得到的氧化石墨烯分散液的结构，取3ml分散液于比色皿中，空白对照组为3ml去离子水，检测范围为全波长，得到氧化石墨烯分散液的紫外光谱图。紫外光谱图表明，氧化石墨烯表面含有羟基等含氧官能团。

(2)取10ml上述氧化石墨烯分散液于试管中，搅拌均匀后加入5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mgn-羟基琥珀酰亚胺的质量与氧化石墨烯分散液的体积比为1∶2∶1g/ml，搅拌1min后加入活性肽置于磁力搅拌器上反应6h，进行酰胺反应得到反应液；

(3)将反应后的反应液以5000r/min的速度离心10min，并重复3次，离心后冷冻干燥，得到氧化石墨烯-活性肽复合材料。

所述的活性肽序列为rvpsl。

通过红外光谱(ft-ir)、扫描电镜(sem)、x-射线衍射(xrd)、x-射线光电子能谱(xps)对氧化石墨烯-活性肽粉末进行表征，其中红外光谱的扫描波长为700-4000cm^-1；扫描电镜测试中，氧化石墨烯和氧化石墨烯-活性肽复合材料的放大倍数为10.0k，尺寸为5μm；x-射线衍射检测中，扫描范围为5-60°，扫描速度为2度/min，步长为0.02；x-射线光电子能谱检测中，选用al-kα激发源，通过能量为29.35ev，结合能测量精度为±0.3ev，以污染碳中的c1s结合能284.80ev作为内标。

如图1所示的红外光谱图表明，活性肽经氧化石墨烯修饰后，新出现三个属于活性肽的吸收峰，证明活性肽键合到氧化石墨烯表面上；如图2和图3所示的扫描电镜图表明，活性肽经氧化石墨烯修饰后，其表面变得光滑，结构更加紧密；如图3所示的x-射线衍射图表明，活性肽经氧化石墨烯修饰后，2θ值为10.74°的峰值大大降低，说明活性肽和氧化石墨烯上的含氧官能团结合，导致氧化石墨烯被还原。如图4所示的x-射线光电子能谱图表明，活性肽经氧化石墨烯修饰后，在399.4ev处出现了新的n1s峰，且在c1s的分峰中，286.5ev和288.2ev所对应的c-o/c-n、n-c＝o基团来自于活性肽。

通过紫外分光光度法对氧化石墨烯-活性肽复合材料的活性进行测定，取30μl马尿酰-组胺酰-亮氨酸(hhl)底物溶液，加入10μl抑制剂混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热3～5min，然后加入20μlace液充分混合，37℃保温30min后，加入1.5ml乙酸乙酯萃取15s后以5000r/min的速度离心10min，取1.0ml酯层烘干后溶于50μl去离子水。该溶液用uv-vis进行分析。

利用下列公式计算浓度为0.5mg/ml氧化石墨烯-活性肽的抑制率：

ace抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是含有样品和ace溶液的吸光值；b为不含样品但含有ace溶液的吸光值。

ace活性的定义：ace活性的一个单位(u)定义为在37℃下每分钟从催化hhl形成1mol的ha所需的酶量。

结果表明，氧化石墨烯-活性肽复合材料可有效抑制ace活性，其浓度为0.05mg/ml时ace抑制率为39.7％，和修饰前的活性肽相比，其ace抑制率提高了3％。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。