维生素B2修饰的铁基纳米酶及其制备方法和应用与流程

本申请涉及生物纳米材料技术领域，尤其涉及一种维生素b2修饰的铁基纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术：

铁基纳米酶(ionzyme)是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶。目前实验发现，铁基纳米酶同时具有过氧化氢酶(cat)活性和超氧化物歧化酶(sod)活性，且具有制备简单，成本低廉，稳定易保存等一系列优点。

口腔溃疡俗称“口疮”，是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，多见于唇内侧、舌头、舌腹、颊黏膜、前庭沟、软腭等部位，这些部位的黏膜缺乏角质化层或角化较差。舌头溃疡指发生于舌头、舌腹部位的口腔溃疡。口腔溃疡发作时疼痛剧烈，局部灼痛明显，严重者还会影响饮食、说话，对日常生活造成极大不便；可并发口臭、慢性咽炎、便秘、头痛、头晕、恶心、乏力、烦躁、发热、淋巴结肿大等全身症状，严重影响人们的正常生活和工作。

维生素b2(化学式：c17h20n4o6)又叫核黄素，微溶于水，具有一定的热稳定性。为体内黄酶类辅基的组成部分，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。同时，维生素b2也是临床上常用于治疗口腔溃疡的药物之一。

目前已有研究发现，口腔溃疡处有异常多的活性氧自由基(ros)产生，造成氧化应激，这在客观上能够防止溃疡面细菌滋生，引起感染，但也同样会造成溃疡面愈合迟缓。而铁基纳米酶所具备的过氧化氢酶活性和超氧化物歧化酶活性能够很好地清除溃疡处过量的ros，促进溃疡面的愈合。

然而，在现有技术中，还未出现过以维生素b2修饰铁基纳米酶的相关报道。而将铁基纳米酶和维生素b2相结合，可以显示出哪些活性，对铁基纳米酶的活性是否有影响，现有技术中还未给出相关结论。

技术实现要素：

为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种维生素b2修饰的铁基纳米酶，其中，所述维生素b2修饰铁基纳米酶为维生素b2修饰的纳米级四氧化三铁颗粒。

优选的，所述维生素b2修饰铁基纳米酶的晶型为四氧化三铁晶型，粒形为不规则球形，颗粒粒径为150-300nm，处于纳米范围，优选的，颗粒粒径约为200nm。

另一方面，本发明还提供了一种维生素b2修饰的铁基纳米酶的制备方法，包括在利用铁源制备纳米四氧化三铁颗粒的过程中加入维生素b2的步骤；其中铁源与维生素b2的摩尔比为1:0.005-30。

进一步地，所述铁源与维生素b2的摩尔比为1:0.01-20，更优选1:0.02-18，更优选1:0.05-15，更优选1:0.1-13，更优选1:0.15-10，更优选1:0.5-5，更优选1:1-4，更优选1:2-3。

进一步地，所述利用铁源制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒的步骤；优选的，所述利用水热法或溶剂热法制备纳米四氧化三铁颗粒包括利用铁源、水或非水溶剂以及碱性溶液作为反应物的步骤；更优选的，所述制备方法包括如下步骤：将铁源、水或非水溶剂、碱性溶液和维生素b2混合得反应液，将反应液经过水热法或溶剂热法制备成为维生素b2修饰的铁基纳米酶。

进一步地，上述制备方法包括如下步骤：

s1，将铁源与水或非水溶剂按比例溶解，得反应液a；

s2，向反应液a中加入碱性溶液，搅拌使其溶解，得反应液b；

s3，向反应液b中加入维生素b2，搅拌使其溶解，得反应液c；

s4，将反应液c加热制备得到维生素b2修饰的铁基纳米酶。

优选的，所述步骤s4包括将反应液加热、烘干的步骤，所述加热的温度为100-500℃，优选200-400℃；加热时间为1-48h，优选12-24h。

任选的，加热完毕后进行醇洗。

进一步地，所述铁源选自二价铁和/或三价铁，优选氯化铁、硫酸亚铁、硝酸铁、溴化铁中的一种或多种；

所述非水溶剂为醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、烃类溶剂、酯类溶剂中的一种或多种；优选的，所述非水溶剂为醇类溶剂；更优选的，所述醇类溶剂为乙二醇、丙三醇、乙醇、聚乙二醇中的一种或多种；

所述碱性溶液选自醋酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、nh4⁺中的一种或多种的溶液，优选，醋酸钠、柠檬酸钠和/或碳酸氢钠的溶液。

所述铁源与水或非水溶剂的摩尔比为1:1-1000；所述碱性溶液的终浓度为0.01-1mol/l。

本申请通过水热法或溶剂热法合成获得维生素b2修饰的铁基纳米酶。水热法或溶剂热法是在流体参与的高压容器中进行，高温时密封容器中的溶媒(水或溶剂)膨胀充满整个容器，从而产生高压；利用强烈对流将溶解的分子或离子运输到反应釜低温区形成过饱和溶液，继而结晶。溶剂热法合成的纳米颗粒具有晶粒发展完整、粒度分布均匀、颗粒分散性好且粒度可控制等优点。

另一方面，本发明还提供了上述维生素b2修饰的铁基纳米酶在制备治疗和/或预防溃疡的药物的应用。

进一步地，所述溃疡为口腔溃疡或皮肤溃疡，优选，口腔溃疡。

另一方面，本发明还提供了一种促进口腔溃疡愈合的组合物，包含上述维生素b2修饰的铁基纳米酶。

另一方面，本发明还提供了上述维生素b2修饰的铁基纳米酶的应用，其中，所述应用选自以下i-ii任一应用：

i、作为催化酶的应用，优选地，所述催化酶为过氧化氢酶和/或超氧化物歧化酶；ii、清除活性氧自由基的应用。

另一方面，本发明还提供了上述维生素b2修饰的铁基纳米酶在制备治疗口腔溃疡药物或试剂中的应用；优选，所述药物或试剂还包括以下用途：提高溃疡的口腔上皮角质细胞(hok)存活率；清除细胞内活性氧自由基(ros)；降低溃疡处干扰素-γ(ifn-γ)和白细胞介素-6(il-6)含量。

进一步的，上述维生素b2修饰的铁基纳米酶在应用时可以制备成为液体制剂、固体制剂、半固体制剂或气体制剂，优选的，所述液体制剂包括溶液剂、注射剂、洗剂、搽剂等，所述固体制剂包括散剂、丸剂、片剂、膜剂、颗粒制剂等，所述半固体制剂包括软膏剂、凝胶剂、栓剂、糊剂等，所述气体制包括气雾剂、喷雾剂等。

进一步的，上述维生素b2修饰的铁基纳米酶在应用时可以制备成为缓释制剂、控释制剂或纳米制剂。

进一步的，上述维生素b2修饰的铁基纳米酶在应用时的浓度不低于0.01mg/ml，优选，不低于0.05mg/ml，更优选，不低于0.1mg/ml；优选0.01-100mg/ml，更优选0.05-50mg/ml，更优选0.1-20mg/ml，更优选0.2-10mg/ml，更优选0.25mg/ml、0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml、0.65mg/ml、0.7mg/ml、0.75mg/ml、0.8mg/ml、0.85mg/ml、0.9mg/ml、0.95mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml。

发明人发现，由上述制备方法得到的维生素b2修饰的铁基纳米酶，具有高于未经修饰的铁基纳米酶的过氧化氢酶活性和超氧化物歧化酶活性，同时还有效地提高了溃疡的hok细胞和balb/3t3细胞的细胞存活率，清除溃疡处细胞内过量的ros，降低溃疡处干扰素-γ(ifn-γ)和白细胞介素-6(il-6)含量。相比于单独使用的铁基纳米酶或维生素b2，维生素b2修饰的铁基纳米酶显示出了更加高效的促进口腔溃疡愈合的作用，可适用于制备高效治疗口腔溃疡的药物。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的维生素b2修饰铁基纳米酶在水中分散性好，制备简易，易于磁分离，性质稳定，生物相容性好，在常规使用时对人体无害，环境友好，生态友好，易于控制，价格便宜，通过发挥自身的超氧化物歧化酶活性及过氧化氢酶活性，能有效的清除口腔溃疡处过量的ros，为溃疡面细胞再生提供一个良好的环境，有助于口腔溃疡的愈合，促进口腔溃疡愈合效果显著，是高效能低成本的口腔溃疡治疗剂。

2、本发明提供的维生素b2修饰铁基纳米酶的制备方法，可快速高效地制备上述维生素b2修饰铁基纳米酶，操作简单，无毒无污染。

3、本发明提供的维生素b2修饰铁基纳米酶，具有高于未经修饰的铁基纳米酶的过氧化氢酶活性和超氧化物歧化酶活性，同时与单独使用的维生素b2和铁基纳米酶相比，显示出了更好的对balb/3t3细胞和hok细胞在双氧水环境下的保护作用、细胞水平的ros清除能力以及降低溃疡处ifn-γ和il-6的能力，对口腔溃疡具有优于维生素b2和铁基纳米酶的治疗效果，可以用于制备高效促口腔溃疡愈合的组合物、治疗和/或预防溃疡的药物等。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶的扫描电镜图；

图2为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶的透射电镜图；

图3为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶元素分析图谱；

图4为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶x射线光电子能谱分析图谱；

图5为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶x射线衍射图谱；

图6为加入量为0.5g维生素b2修饰铁基纳米酶过氧化氢酶活性示意图；

图7为加入量为0.5g维生素b2修饰铁基纳米酶超氧化物歧化酶活性示意图；

图8为加入量为0.5g维生素b2修饰修饰铁基纳米酶对balb/3t3细胞和hok细胞在双氧水环境下的保护作用示意图；

图9为加入量为0.5g维生素b2修饰铁基纳米酶对细胞水平ros清除作用示意图；

图10为加入量为0.5g维生素b2修饰铁基纳米酶对口腔溃疡治疗效果的示意图；

图11为加入量为0.5g维生素b2修饰铁基纳米酶对口腔溃疡处干扰素-γ(ifn-γ)和白介素-6(il-6)的调节作用示意图。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

实施例1维生素b2修饰铁基纳米酶的制备方法

将1.35g六水合氯化铁(0.005mol)溶于40ml的乙二醇中，磁力搅拌器搅拌30分钟，将六水合氯化铁充分溶解，制得氯化铁溶液。向上述氯化铁溶液中加入3.6g的无水醋酸钠，磁力搅拌器搅拌30分钟，使无水醋酸钠充分溶解，制得混合溶液。向上述混合溶液中加入0.5g的维生素b2(0.0013mol)，搅拌30分钟，使维生素b2充分混匀，制得反应液。随后将全部反应液倒入反应釜中，将反应釜放入烘箱中，然后将烘箱升温至200℃，保温、加热12h，醇洗三遍，烘干，最终获得维生素b2修饰铁基纳米酶0.3g，产率33.9％。

在本说明书中，还提供了其他使用上述方法制备获得维生素b2修饰铁基纳米酶的示例，其中区别仅在于加入维生素b2的量不同，分别为1.0g(0.0026mol)、1.5g(0.0039mol)、2.5g(0.0065mol)、0.4g(0.0010mol)和0.2g(0.0005mol)，其中，各示例获得的维生素b2修饰铁基纳米酶的质量均在0.3g左右，各示例的产率分别为：21.6％，15.9％，10.4％，38.2％，51.2％。

以下将以实施例1中加入量为0.5g维生素b2所获得的维生素b2修饰铁基纳米酶为例，对采用上述方法制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶进行结构表征以及生物活性检测。为便于叙述，对下文以及各附图中的维生素b2修饰铁基纳米酶可以简称为vb2-ionzyme，图中所述0.5gvb2-ionzyme即所述实施例1中加入量为0.5g维生素b2所获得的维生素b2修饰铁基纳米酶。

实施例2维生素b2修饰铁基纳米酶的结构表征

维生素b2修饰铁基纳米酶的结构表征如图1-5所示，其中，图1-5分别为实施例1中加入量为0.5g维生素b2所获得的vb2-ionzyme的扫描电镜图、高分辨率透射电镜图、元素分析图、x射线光电子能谱分析图谱以及x射线衍射图谱。

由图1和图2可得，采用上述方法制备获得的维生素b2修饰铁基纳米酶为不规则球形，颗粒粒径大约为200nm左右，颗粒粒径处于纳米级范围，说明获得的维生素b2修饰铁基纳米酶为纳米结构。

由图3可得，图中除fe元素和o元素的峰外，还出现了c元素和n元素的峰，说明经过维生素b2修饰后的四氧化三铁纳米酶上出现了c元素和n元素。

由图4可得，图中除fe2p能级轨道的峰和o1s能级轨道的峰外，还出现了c1s和n1s能级轨道的峰，说明四氧化三铁纳米酶上修饰有维生素b2。

由图5可得，维生素b2修饰铁基纳米酶的晶型与未经修饰的铁基纳米酶的晶型相同，均为四氧化三铁晶型。

综上所述，通过扫描电镜、高分辨率透射电镜、元素分析、x射线光电子能谱分析以及x射线衍射进行结构表征，确认制备获得的终产物为维生素b2修饰铁基纳米酶，说明使用本发明提供的方法可以制备出维生素b2修饰铁基纳米酶。

实施例3维生素b2修饰铁基纳米酶的过氧化氢酶活性检测

维生素b2修饰铁基纳米酶的过氧化氢酶活性的检测方法，包括如下步骤：

在ph＝7.0的醋酸钠溶液体系中，分别加入不同浓度的h2o2溶液，再分别加入等浓度的维生素b2修饰铁基纳米酶溶液，或等浓度的未经修饰的铁基纳米酶溶液，实时监测体系内所产生的溶解氧，并进行拟合得出h2o2浓度-溶解氧生成速率曲线。所得结果见图6。

如图6所示，在中性条件下，vb2-ionzyme与ionzyme均可以分解双氧水，具有过氧化氢酶的活性，但vb2-ionzyme的在各浓度下的分解速率远高于ionzyme，说明vb2-ionzyme具有高于ionzyme的过氧化氢活性，或者说维生素b2的修饰显著提升了铁基纳米酶的过氧化氢酶活性。

实施例4维生素b2修饰铁基纳米酶超氧化物歧化酶活性检测

vb2-ionzyme的超氧化物歧化酶活性的检测，是通过检测其在560nm下的吸光度，并计算抑制百分率得到的。其中，sod活性的计算公式为：

sod活性(u/mg)＝[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×v反总]÷v样×样本稀释倍数＝11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×样本稀释倍数。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(o^2-)，o^2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm处有吸收；sod可清除o^2-，从而抑制了甲臜的形成；在560nm处的吸光度越高，说明sod活性越低，反之活性越高。所得结果见图7。

如图7所示，vb2-ionzyme清除的o^2-的量明显高于ionzyme，说明vb2-ionzyme能有效清除超氧阴离子，且相较于未修饰的铁基纳米酶，其超氧化物歧化酶活性有显著提升。

实施例5维生素b2修饰铁基纳米酶对balb/3t3细胞和hok细胞在双氧水环境下的保护作用

检测vb2-ionzyme对balb/3t3细胞和hok细胞在双氧水环境下的保护作用的实验方法，具体包括如下步骤：

(1)将balb/3t3细胞和hok细胞以8000个/孔铺于96孔板中；

(2)培养12h后去除陈旧培养基，加入含不同浓度vb2、ionzyme、vb2-ionzyme的新培养基；

(3)作用15min后加入终浓度200μm的双氧水，共孵育24h；

(4)洗去培养基，pbs洗涤，加入终浓度0.5mg/mlmtt溶液作用4h；

(5)加入100μldmso，充分溶解后在490nm波长处测量吸光度值，根据吸光度值计算细胞存活率。

采用上述方法所得结果见图8。

如图8所示，与空白对照(仅有200μm的双氧水)相比，浓度为12.5μg/ml和25μg/ml的vb2-ionzyme在双氧水环境下的hok细胞存活率有提高，浓度为50μg/ml和100μg/ml的vb2-ionzyme在双氧水环境下的hok细胞和balb/3t3细胞的存活率显著提高。同时相较于单独使用的vb2和ionzyme，vb2-ionzyme能显著提高双氧水环境下balb/3t3细胞和hok细胞的存活率，说明vb2-ionzyme在双氧水环境下对balb/3t3细胞和hok细胞具有优于vb2和ionzyme的保护作用。

实施例6维生素b2修饰铁基纳米酶在细胞水平ros清除能力的检测

检测vb2-ionzyme在细胞水平ros清除能力的方法，具体包括如下步骤：

(1)将balb/3t3细胞和hok细胞以8000个/孔铺于96孔板中；

(2)培养12h后去除陈旧培养基，加入含不同浓度vb2、ionzyme、vb2-ionzyme的新培养基；

(3)作用15min后加入终浓度200μm的双氧水，共孵育24h；

(4)洗去培养基，pbs洗涤，加入dcfh-da探针孵育30min；

(5)pbs洗涤，加入新pbs，在激发波长488nm，发射波长525nm处测量荧光强度。

采用上述方法所得结果见图9。

如图9所示，相较于单独使用的vb2和ionzyme，vb2-ionzyme处理的双氧水环境中的hok细胞和balb/3t3细胞内的ros水平显著降低，说明vb2-ionzyme可以有效清除双氧水环境中的hok细胞和balb/3t3细胞内的ros，且清除效果优于单独使用的vb2和ionzyme。

实施例7维生素b2修饰铁基纳米酶对口腔溃疡的治疗效果评价

vb2-ionzyme对口腔溃疡的治疗效果的检测方法，包括建立口腔溃疡模型的步骤，具体包括：

(1)用蘸有冰醋酸的直径约4mm的滤纸沾于小鼠舌部30s，生理盐水清洗干净；

(2)24h后溃疡面形成，对照组溃疡面给予生理盐水，用药组溃疡面给予灭菌后的2mg/mlvb2、10mg/mlionzyme以及10mg/mlvb2-ionzyme，持续用药6天；

(3)用药期间每两天对溃疡面进行观察并拍照；

(4)第六次用药结束后处死小鼠，剪下小鼠溃疡面舌部用于h&e染色以及elisa法检测舌部il-6和ifn-γ含量。

采用上述方法所得结果见图10-11。

如图10所示，与对照组、vb2治疗组以及ionzyme治疗组相比，经vb2-ionzyme治疗后的小鼠舌部上皮组织再生速度明显加快，炎性细胞浸润较少，恢复良好。

如图11所示，与对照组、vb2治疗组以及ionzyme治疗组相比，经vb2-ionzyme治疗后的小鼠舌部溃疡处的ifn-γ和il-6含量都有显著降低，进一步表明了经vb2-ionzyme治疗后的小鼠舌部溃疡恢复状况较好，而其余治疗组则无此效果。

综上所述，采用本发明提供的制备方法可以获得颗粒粒径为纳米级的维生素b2修饰的铁基纳米酶；本发明提供的维生素b2修饰的铁基纳米酶，具有高于未经修饰的铁基纳米酶的过氧化氢酶活性以及超氧化物歧化酶活性，同时与单独使用的维生素b2和铁基纳米酶相比，维生素b2修饰的铁基纳米酶显示出了更好的对balb/3t3细胞和hok细胞在双氧水环境下的保护作用、细胞水平的ros清除能力以及降低溃疡处ifn-γ和il-6的能力，说明维生素b2修饰的铁基纳米酶对于口腔溃疡具有优于维生素b2和铁基纳米酶的治疗效果，可以用于制备高效促口腔溃疡愈合的组合物、治疗口腔溃疡的药物。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。