一种蜂蛹提取物及在保护顺铂诱导肾损伤中的应用的制作方法

本发明涉及蜂蛹及应用技术领域，具体的涉及一种蜂蛹提取物及在保护顺铂诱导肾损伤中的应用。

背景技术：

顺铂(顺式-二氯二氨合铂ⅱ，cisplatin，cddp)是目前临床上常用的抗癌药物之一。顺铂具有抗癌作用强，毒副作用大，与多种抗肿瘤药有协同作用，缺乏交叉耐药性等特点。注射过顺铂后，顺铂会随着血液循环到达全身器官组织，主要出现于肝、肾、卵巢、皮肤、子宫等。顺铂引起的肾毒性主要涉及细胞毒作用、氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等多种机制。临床上，顺铂的疗效与其剂量成正比，顺铂剂量越大，其治疗效果越好，但是其毒副作用也越大。已有研究表明，抗氧化剂及具有自由基清除活性的物质对顺铂所致的氧化应激有保护作用。因此，研究一种能与顺铂结合使用、降低其毒副作用、更好发挥其作用的物质具有重要意义。

目前市场上并无专门针对顺铂肾毒副作用的特效治疗药物，使用较为普遍的治疗药物是氨磷汀(aft)，是一种被国际机构认可的广谱细胞保护剂。aft是一种化学合成的药物，在治疗顺铂肾损伤的同时也具有一定的毒副作用，其毒副作用主要表现为造成患者低血压。蜂蛹是一种具有良好的抗氧化作用的蜜蜂的蛹,蜂蛹的食用及药用历史悠久，早在公元前1200年前的古籍《尔雅》,以及公元前3世纪的《礼记》中就已经有其食用的记载。在长沙马王堆出土的古医方帛书《五十二病例》就有用蜂胎和蜂子治病的配方。在许多研究中表明，蜂蛹具有抗氧化、降血糖、抗衰老、抗疲劳、抗炎等多种功能；现有技术中对于蜂蛹的利用主要针对蜂蛹干粉制备、食用的加工方式、泡酒和保健酒的制作；

综上所述，目前现有技术中还没有能与顺铂结合使用、降低其毒副作用、更好发挥其作用的物质；同时目前在蜂蛹的利用没有对对蜂蛹药用或保护作用进行过深入的技术创新。因此，研究和利用蜂蛹提取物对顺铂诱导的肾损伤的保护作用，具有非常重要现实意义，是对食用资源非常好的技术上的重要创新。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种蜂蛹提取物的制备方法，同时将蜂蛹提取物应用于顺铂诱导肾损伤中，具有治疗顺铂引起的肾损伤的作用。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种蜂蛹提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、用注射器吸取蜂蛹组织液体，用玻璃匀浆器匀浆后，电压150v，超声破碎细胞30min，超声波功率150w，12000rpm/min离心10min，取上清；

步骤二、按石油醚：蜂蛹＝1：2的比例在涡旋振荡器上混匀3-5min，12000rpm/min离心5min，重复此步骤，直至完全脱脂；

步骤三、在真空冷冻干燥机中制成冻干粉，用离心管分装，封口膜封紧，置-80℃冰箱冷冻保存。

进一步的，所述步骤一和步骤二都在冰上进行操作。

本发明的另一目的在于，提供一种蜂蛹提取物在保护顺铂诱导肾损伤药物制备中的应用。

本发明的另一目的在于，提供一种蜂蛹提取物在制备对顺铂诱导小鼠肾损伤起保护作用的药物中的应用。

本发明的另一目的在于，提供一种治疗顺铂引起的肾损伤的药物，包括所述的蜂蛹提取物。

本发明的有益效果：本发明首先制备得到蜂蛹提取物，并将其物应用于治疗顺铂诱导肾损伤，具有治疗顺铂引起的肾损伤的作用；实验发现蜂蛹提取物具有极高的自由基清除活力，能提高机体内超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活力，通过抑制顺铂诱导形成超氧自由基的分子机制，而从具有减轻其肾毒性的作用；同时，蜂蛹提取物具有极高营养价值，能够改善动物体质，增强抵抗力，并且蜂蛹提取物因来源于生物体内的活性成分，具有药食两用的功能，无毒副作用，可通过摄食获取，有望进一步开发为安全可靠的治疗药物。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例所述蜂蛹提取物的制备方法的流程图；

图2为本发明实施例所述蜂蛹提取物清除dpph自由基的活性(a)和对超氧阴离子的清除作用(b)曲线图；

图3为本发明实施例所述血清sod和gsh-px活性，mda、cr和bun含量的变化结果(a蜂蛹提取物对小鼠血清中sod的影响；b蜂蛹提取物对小鼠血清中gsh-px的影响；c蜂蛹提取物对小鼠血清中mda的影响；d蜂蛹提取物对小鼠血清中cr的影响；e蜂蛹提取物对小鼠血清中bun的影响；f蜂蛹提取物对小鼠肾脏sod活性的影响；g蜂蛹提取物对小鼠肾脏gsh-px活性的影响)；

图4为本发明实施例所述身体指标变化示意图(图3a为小鼠尿液cr，b为尿液bun；c表示小鼠的体重变化)；

图5为本发明实施例所述肾脏组织切片he染色显微图(d为对照组，e为顺铂组，f为蜂蛹组；细胞疏松(黑色三角形)，炎性细胞浸润(黑色箭头)，细胞碎片(空心箭头))；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种蜂蛹提取物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、用注射器吸取蜂蛹组织液体，用玻璃匀浆器匀浆后，电压150v，超声破碎细胞30min，12000rpm/min离心10min，取上清；

步骤二、按石油醚：蜂蛹＝1：2的比例在涡旋振荡器上混匀3-5min，12000rpm/min离心5min，重复此步骤，直至完全脱脂；

步骤三、在真空冷冻干燥机中制成冻干粉，用离心管分装，封口膜封紧，置-80℃冰箱冷冻保存。

所述步骤一和步骤二都在冰上进行操作。

本次实验研究采用的蜂蛹提取物来自野生胡蜂幼虫。

实施例2

蜂蛹提取物在保护顺铂诱导肾损伤中的应用

顺铂诱导的肾损伤小鼠模型制备

选取18只健康雄性小鼠，随机分为空白对照组、顺铂(cddp)组和蜂蛹组，每组各6只；

对照组和cddp组分别给予0.3ml0.9％生理盐水，每天一次，共15天；

蜂蛹组按200mg/kg的剂量灌胃蜂蛹提取物(蜂蛹提取物用0.9％生理盐水配置)，每天一次，连续15天；

于灌胃的第11天开始，cddp组和蜂蛹组分别按2mg/kg注射顺铂溶液(顺铂用0.9％生理盐水配置)，每天一次，连续5天，对照组注射0.9％生理盐水。期间，小鼠饲喂基础饲料，自由摄食，自由饮水。在灌胃前，每天称量小鼠体重。

蜂蛹提取物对dpph自由基的清除作用

dpph自由基是一种稳定的氮中心的自由基，在517nm波长处有强吸收，在溶液中呈现深紫色，被中和后会变为无色或浅黄色。利用这一特性，可得到初始自由基的量，计算得到其清除率。dpph自由基的清除能力可有效的评价抗氧化剂的抗氧化活性。

准确称取dpph25mg，用无水乙醇定容至500ml。取不同浓度的样品溶液0.1ml，加入1.4mldpph乙醇溶液，充分混匀后，立即置于暗处反应30min，用紫外分光光度计于517nm测定其吸光度(a)，以无水乙醇调零。按照下式计算各样品对dpph的清除率(sa)：清除率sa％＝[1-(ai-aj)/a0]×100％。式中：ai为加入样品的吸光度，aj为以等量的无水乙醇代替dpph时的吸光度，a0为以等量蒸馏水代替样品溶液作空白对照时的吸光度。

蜂蛹提取物清除dpph自由基的活性结果见。在0-200mg/ml的浓度范围内，蜂蛹提取物对dpph自由基的清除率随着剂量的增大而增大，即呈剂量依赖性。当蜂蛹提取物浓度达到200mg/ml时，清除率达到57％左右。剂量与清除率在特定的浓度范围内，二者回归方程的线性相关性很好(图2)

对超氧阴离子自由的基清除作用

将1ml不同浓度的实验样品加入到1.8ml50nmoltris-hcl缓冲液(ph8.2)中，并在环境温度(25℃)下温育10min后，立即将0.1ml含有10mmol邻苯三酚的10nmolhcl加入到上述试管中并摇动，在24℃下在320nm检测5min吸光度值(δas)，用tris-hcl缓冲液代替测试样品作为空白对照(δab)。超氧自由基清除能力(％)＝(δab-δas)/δab×100％。

蜂蛹蛋白提取物对氧自由基清除效果明显，0-5mg/ml时蜂蛹蛋白对氧自由基的清除作用随蜂蛹蛋白剂量增加而增加，在蜂蛹蛋白剂量5mg/ml时达到90％左右，5mg/ml以后清除率逐渐平缓，最大清除率接近97％(图2b)。

血液生化指标检测及组织学检查

末次(第15天)用药24h后，用剪刀剪断小鼠尾巴采血，放入肝素管中，静止30min后，3000rpm/min离心10min分离血清，4℃低温保存。测定小鼠血清中含有超氧化物歧化酶(sod)，谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)，丙二醛(mda)，肌酐(cr)，血清尿素氮(bun)水平的数值；断颈处死小鼠，立即解剖，取相同部位肝脏、肾脏，固定于2.5％戊二醛溶液中。取已固定的小鼠肝脏、肾脏，脱水，透明后，石蜡包埋切片，脱蜡复水，苏木精，依红(he)染色，光学显微镜下观察肝脏和肾脏的组织形态学改变。

血清中sod、gsh-px、mda、cr和bun的变化

如图3所示，图中，control：表示对照组，cddp：表示顺铂组，bee：表示蜂蛹组，*p<0.05，**p<0.01。

注射过顺铂后，顺铂组与对照组相比，小鼠血清sod和gsh-px的活力降低，但没有统计学差异(p>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中sod和gsh-px的活力无明显差异(p>0.05)；蜂蛹组与顺铂组相比，小鼠血清中sod和gsh-px的活力明显升高(p<0.05)(见图3a、图3b)。

顺铂组与对照组相比，顺铂组小鼠血清中mda含量升高，但没有统计学差异(p>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中mda含量无明显变化，没有统计学差异(p>0.05)(见图3c)。顺铂组与对照组相比，小鼠血清cr的含量明显升高(p>0.05)，bun含量升高，但没有统计学差异(p>0.05)；蜂蛹组与对照组相比，小鼠血清中cr和bun的含量无明显差异(p>0.05)。蜂蛹组与顺铂组相比，小鼠血清中cr的含量极明显降低(p<0.01)，bun含量明显升高(p<0.05)(见图3d、图3e)，统计学差异显著。

蜂蛹提取物对肾组织sod和gsh-px活性的影响

注射顺铂后，顺铂组与对照组相比，小鼠肾组织sod无显著差异(p>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，肾组织sod活性高于模型组(p<0.05，及显著高于对照组(p<0.01)(见图3f)。模型组肾组织gsh-px活性较对照物显著差异(p>0.05)，灌胃蜂蛹提取物后，肾组织gsh-px活力提高，显著高于对照组与模型组(p<0.01)。提示蜂蛹提取物能够提高或恢复小鼠肾脏的机能。

小鼠体重变化及蜂蛹提取物对肾组织形态学影响

如图4所示，小鼠各个指标变化如图所示；小鼠体重变化如图4c。实验前10d，各组体重皆随时间增长而增长，蜂蛹组增长量远高于正常组，提示蜂蛹具有极高营养价值。后五天受顺铂损伤影响而体重下降。

对照组小鼠肾脏组织结构正常(图5d)，与对照组相比，顺铂组小鼠肾脏组织，出现透明细胞、炎性细胞浸润现象(图5e)；蜂蛹组小鼠肾脏组织相对于顺铂组，透明细胞和炎性细胞浸润现象有所改善，其损伤程度明显减轻(图5f)；

顺铂导致的毒副作用有肾毒性，肝毒性，耳毒性，胃肠道毒性等。临床上使用过顺铂治疗，出现肾毒性损伤发生率为25％～30％，表现为血肌酐和尿素氮浓度升高和肾小球滤过率的降低等。本技术试验结果表明，顺铂诱导致使小鼠cr和bun含量升高，灌胃过蜂蛹提取物能显著降低cr和bun的含量，对肾小球有一定的保护作用。通过观察he组织染色发现，注射过顺铂后，小鼠肝脏出现细胞排列疏松，肾脏组织出现透明细胞、炎性细胞浸润的现象，但经蜂蛹提取物灌胃过后，对小鼠的肝、肾组织的损伤有显著的改善。当蜂蛹提取物浓度达到200mg/kg时，其dpph自由基清除率达到57％左右，蜂蛹提取物具有一定的自由基清除活性。顺铂的毒副作用致使小鼠肾损伤，检测到顺铂组小鼠血清中sod和gsh-px活性降低，mda、cr和bun的含量升高；而灌胃过蜂蛹提取物后，小鼠血清中sod和gsh-px活性升高，mda、cr和bun的含量降低。通过肾组织he染色观察，灌胃过蜂蛹提取物后，肝、肾细胞排列疏松，透明细胞、炎性细胞浸润现象减少，其损伤程度减轻。综上所述，蜂蛹提取物对顺铂诱导的肾损伤具有一定的保护作用。

实施例3

蜂蛹提取物在制备对顺铂诱导小鼠肾损伤起保护作用的药物中的应用；

一种治疗顺铂引起的肾损伤的药物，包括所述的蜂蛹提取物；

基于上述研究，蜂蛹提取物具有极高的自由基清除活力，能提高机体内超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活力，通过抑制顺铂诱导形成超氧自由基的分子机制，而从具有减轻其肾毒性的作用，将蜂蛹提取物用于治疗顺铂引起的肾损伤的药物的研究或者制备对顺铂诱导小鼠肾损伤起保护作用的药物。

本发明首先制备得到蜂蛹提取物，并将其物应用于治疗顺铂诱导肾损伤，具有治疗顺铂引起的肾损伤的作用；实验发现蜂蛹提取物具有极高的自由基清除活力，能提高机体内超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的活力，通过抑制顺铂诱导形成超氧自由基的分子机制，而从具有减轻其肾毒性的作用；同时，蜂蛹提取物具有极高营养价值，能够改善动物体质，增强抵抗力，并且蜂蛹提取物因来源于生物体内的活性成分，具有药食两用的功能，无毒副作用，可通过摄食获取，有望进一步开发为安全可靠的治疗药物。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。