莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途的制作方法

本发明是关于一种植物发酵物的保健用途，特别是关于一种莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途。

背景技术：

心脏及脑血管疾病是近年来国人的十大死因之二，其致病主因为动脉粥状硬化(atherosclerosis)。简言之，动脉粥状硬化是因为动脉中胆固醇累积导致血管管壁增厚、失去弹性、及管径变小，因此血流不顺的状况。先前研究显示在动脉硬化发展过程中，血液中过量的低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)携带胆固醇会积聚在动脉内壁并且氧化为具有细胞毒性的氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlow-densitylipoprotein，ox-ldl)，因而引起血管的发炎反应，吸引单核球进入血管内皮及分化为巨噬细胞。其后，巨噬细胞会透过细胞表面的蛋白质受体(receptor)与氧化型低密度脂蛋白结合并将其吞噬，进而形成含有大量油滴的泡沫细胞(foamcell)。泡沫细胞的累积可能造成脂肪斑块(fattystreak)形成，配合血管平滑肌细胞分泌的大量胶原纤维，最终可能形成动脉粥状硬化斑块，其会加剧发炎反应及增加血栓形成机率，甚至造成心绞痛、急性心肌梗塞、及中风。

避免动脉粥状硬化的首要策略便是透过均衡饮食或运动等方式降低血中脂肪含量，特别是减少三酸甘油脂与低密度脂蛋白胆固醇。减少动脉粥状硬化的危险因子，如高血压、糖尿病、吸烟等，亦是预防动脉粥状硬化的重要方法。其他策略包括减少血管发炎及抑制泡沫细胞形成。鉴于动脉粥状硬化的成因复杂，为从各方面预防其发生及恶化，开发一种以抑制泡沫细胞形成为目标的新颖组合物，以提升动脉粥状硬化的防治效果，实有其必要。

技术实现要素：

缘此，本发明的一目的在提供一种莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途，其中，该莱菔子发酵物是藉由以下步骤制得：(a)以水萃取一莱菔子(seedsofraphanusraphanistrumsubsp.sativus)而获得一莱菔子萃取物，(b)添加一酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)至该莱菔子萃取物及进行发酵以获得一第一中间发酵物，(c)添加一胚芽乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)至该第一中间发酵物及进行发酵以获得一第二中间发酵物，以及(d)添加一醋化醋酸杆菌(acetobacteraceti)至该第二中间发酵物及进行发酵以获得该莱菔子发酵物。

在本发明的一实施例中，该酿酒酵母的发酵时间为1至2天，该胚芽乳酸杆菌的发酵时间为1至3天，及该醋化醋酸杆菌的发酵时间为14至21天。

在本发明的一实施例中，该酿酒酵母的添加量为该莱菔子萃取物重量的0.01％至0.5％，该胚芽乳酸杆菌的添加量为该莱菔子萃取物重量的0.01％至0.25％，及该醋化醋酸杆菌的添加量为该莱菔子萃取物重量的1％至20％。

在本发明的一实施例中，该莱菔子与水的重量比为1∶5至1∶10，且该萃取是在50℃至100℃进行。

在本发明的一实施例中，该莱菔子发酵物的浓度为至少2％w/v。

在本发明的一实施例中，该莱菔子发酵物减少一巨噬细胞的脂肪累积，因其抑制该巨噬细胞中的一氧化型低密度脂蛋白的结合受体的基因表现，故而减少该巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取。

在本发明的一实施例中，该氧化型低密度脂蛋白的结合受体为是一白血球分化抗原36(clusterofdifferentiation36，cd36)、一巨噬细胞清除受体(microphagescavengerreceptor，msr)、或其组合。

本发明基于细胞实验揭示经过特定发酵过程的莱菔子发酵物能抑制巨噬细胞中的氧化型低密度脂蛋白结合受体的基因表现，减少巨噬细胞内脂肪累积，最终抑制泡沫细胞形成。因此，本发明提供莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途，该组合物可具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服方式给予一个体。

鉴于先前研究显示泡沫细胞形成是动脉粥状硬化发展过程中的一致病因子，对一个体施予能抑制泡沫细胞形成的莱菔子发酵物可避免该个体血管内壁堆积泡沫细胞，进而降低发生动脉粥状硬化的风险及预防罹患心血管疾病。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1显示巨噬细胞经白藜芦醇、莱菔子水萃取物、或莱菔子发酵物处理再与氧化型低密度脂蛋白(ox-ldl)及脂多醣(lps)共培养后，其细胞内油红o的相对含量；

图2显示巨噬细胞经莱菔子水萃取物或莱菔子发酵物处理再与氧化型低密度脂蛋白(ox-ldl)及脂多醣(lps)共培养后，其血球分化抗原36(cd36)与巨噬细胞清除受体(msr)基因的相对表现量。

具体实施方式

本发明提供一种莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途。本发明的莱菔子发酵物是经水萃取及三阶段发酵而制得，具体而言，该莱菔子发酵物的制备包含如下步骤：(a)以水萃取一莱菔子而获得一莱菔子萃取物，(b)添加一酿酒酵母至该莱菔子萃取物及进行发酵以获得一第一中间发酵物，(c)添加一胚芽乳酸杆菌至该第一中间发酵物及进行发酵以获得一第二中间发酵物，以及(d)添加一醋化醋酸杆菌至该第二中间发酵物及进行发酵以获得该莱菔子发酵物。该莱菔子发酵物经实验证实能抑制巨噬细胞中的氧化型低密度脂蛋白结合受体的基因表现，如cd36及msr的基因表现，并且减少巨噬细胞内的脂肪累积，故能抑制泡沫细胞的形成。

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

材料与方法

微生物

自食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter，bcrc)购买酿酒酵母(bcrc20271)、胚芽乳酸杆菌(bcrc910805)、及醋化醋酸杆菌(bcrc11688)。

细胞培养

以下实施例使用购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，atcc)的人类单核细胞株(humanmonocyticcellline)thp-1(atcctib-202)。该thp-1细胞在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于添加10％胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、0.05mm2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)、100单位/ml青霉素、及100μg/ml链霉素的rpmi1640培养基(gibcorpmimedium1640；thermofisherscientific)，以下称rpmi细胞培养基。

油红o染液的制备

将染剂油红o(oilredo；购自sigma)彻底溶解于100％异丙醇(isopropanol；购自echochemical)以配制30mg/ml的油红o储备溶液。为获得可使用的油红o染液，于使用前实时将该储备溶液以二次水稀释至浓度18mg/ml并以0.22m滤膜过滤。

油红o染色

细胞中的脂肪含量是藉由油红o染色测定。染色前，使用磷酸缓冲盐溶液(简称pbs溶液；购自thermofisherscientific)清洗细胞，再以10％甲醛(formaldehyde；购自echochemical)固定细胞10分钟。该固定的细胞经pbs溶液清洗1次后，以60％异丙醇润洗15秒。其后，以油红o染液对细胞染色1分钟，再以60％异丙醇退染15秒。染色后细胞经pbs溶液清洗即以显微镜(zeissaxiovert.a1)观察，或以100％异丙醇溶解细胞内染剂以进行定量。定量结果以excel软件的学生t(student’t)检定进行统计分析。

基因表现量分析

基于定量聚合酶链锁反应(quantitativepolymerasechainreaction，简称qpcr)测定巨噬细胞中有关于摄入氧化型低密度脂蛋白的蛋白质受体的基因表现量，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，利用rna萃取套组(rnaextractionkit；geneaid)自细胞分离出核醣核酸(rna)，于37℃下以反转录酶iiireversetranscriptase(invitrogen)将2000ngrna反转录为cdna。其后，利用qpcr套组(kapacybrfastqpcrkit(2x)；kapabiosystems)以及cd36、msr等目标基因与作为内部对照的β-肌动蛋白(β-actin)基因actb的引物对(表1)在pcr反应仪(steponeplusreal-timepcrsystem；appliedbiosystems)对前述cdna进行qpcr，以取得解链曲线(meltingcurve)。

表1

最终，使用2^-δδct方法测定目标基因的相对表现量。该方法以gapdh基因的循环阈值(ct)作为内部对照的参考基因的循环阈值，按照以下公式计算相对倍数变化：

δct＝实验组或控制组的目标基因的ct-内部对照的ct

δδct＝实验组的δct-控制组的δct

倍数变化＝2^{-δδct平均值}

统计分析是使用excel软件中的stdev函数计算各基因相对表现量的标准偏差，并以单尾学生t检定(ttest)计算统计上差异。

实施例1

莱菔子发酵物的制备

首先，洗净萝卜的成熟干燥种子(即莱菔子)，再将水与莱菔子混合以进行萃取及获得一莱菔子萃取物。该莱菔子与水的重量比为1∶5至1∶10。萃取温度为介于50℃至100℃，较佳为80℃至95℃。本实施例中萃取时间为0.5至3小时。该萃取开始前添加5％至15％(w/v)的葡萄糖至莱菔子与水的混合物。

经上述步骤所得莱菔子萃取物冷却至室温后用于三阶段发酵。各阶段的较佳发酵条件如下：

阶段一：添加酿酒酵母(bcrc20271)至该莱菔子萃取物及于25℃至35℃进行发酵1至2天以获得一第一发酵物。该酿酒酵母的添加量为该莱菔子萃取物重量的0.01％至0.5％。

阶段二：添加胚芽乳酸杆菌(bcrc910805)至该第一发酵物及于25℃至35℃进行发酵1至3天以获得一第二发酵物。该胚芽乳酸杆菌的添加量为该莱菔子萃取物重量的0.01％至0.25％。

阶段三：添加醋化醋酸杆菌(bcrc11688)至该第二发酵物及于25℃至35℃进行发酵14至21天以获得一莱菔子发酵物。该醋化醋酸杆菌的添加量为该莱菔子萃取物重量的1％至20％。

该莱菔子发酵物可透过200至400目(mesh)的滤网过滤以移除残余固体物。该过滤后的莱菔子发酵物可进一步在45℃至70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。经过浓缩的莱菔子发酵物可选择性地添加1-3％(w/w)柠檬酸及40-70％(w/w)异麦芽寡糖。最终，经加工处理的莱菔子发酵物于后续利用前于95℃至120℃灭菌70至90分钟。

实施例2

莱菔子发酵物减少巨噬细胞的脂肪累积及泡沫细胞的形成

为探讨本发明莱菔子发酵物对巨噬细胞形成泡沫细胞的影响，本实施例以油红o染色分析由人类单核细胞株thp-1分化而得的巨噬细胞经莱菔子发酵物处理后，其脂肪含量的变化。首先，将thp-1细胞依2×10⁵个细胞/孔接种于含有2mlrpmi细胞培养基的6孔盘的各孔，再以500nm佛波醇-12-肉蔻酯-13-乙酯(phorbol12-myristate13-acetate，pma；sigma-aldrich)处理该细胞48小时以诱导其分化为巨噬细胞。其后，更新细胞培养基并在37℃培养该巨噬细胞48小时，再以下列方式处理各孔细胞：(a)施以2mlrpmi培养基1小时(控制组)；(b)施以2mlrpmi培养基1小时，再施以50μg/ml人类氧化型低密度脂蛋白(购自athensresearch&technology)及100ng/ml脂多醣(lipopolysaccharide，lps；sigma)(ox-ldl组/lps组)；(c)施以2ml含2.5μm白藜芦醇的rpmi培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps+白藜芦醇组)；(d)施以2ml含2％(w/v)莱菔子水萃取物的rpmi细胞培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps+莱菔子水萃取物组)；及(e)施以2ml含2％(w/v)莱菔子发酵物的rpmi细胞培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps+莱菔子发酵物组)。前述各组细胞于37℃培养24小时后，移除培养基，以pbs溶液清洗细胞后进行油红o染色及定量分析。

图1显示前述各组细胞内油红o的相对含量，其是相对于控制组细胞的油红o含量的百分比；^##表示相比控制组为p＜0.01，**及***分别表示相比ox-ldl组为p＜0.01及p＜0.001，^▲▲表示相比ox-ldl+莱菔子水萃取物组为p＜0.01。依据图1，施予氧化型低密度脂蛋白以及刺激发炎反应的脂多醣会显著增加巨噬细胞内的脂肪含量，但莱菔子发酵物的额外处理显著抑制该脂肪含量增加，使细胞中的油红o相对含量下降至约80％。此外，莱菔子水萃取物无法显著减少ox-ldl/lps刺激下增加的脂肪。此结果显示本发明莱菔子发酵物能有效减少脂肪累积于巨噬细胞内，因此抑制泡沫细胞的形成。

实施例3

莱菔子发酵物抑制氧化型低密度脂蛋白结合受体的基因表现

为探讨本发明莱菔子发酵物对巨噬细胞的脂肪摄取相关基因表现的影响，以qpcr测定thp-1细胞分化而得的巨噬细胞经莱菔子发酵物处理后，其氧化型低密度脂蛋白结合受体白的基因表现变化。首先，将thp-1细胞依2×10⁵个细胞/孔接种于含有2mlrpmi细胞培养基的6孔盘的各孔，再以500nmpma处理该细胞48小时以诱导其分化为巨噬细胞。其后，更新细胞培养基并在37℃培养该巨噬细胞48小时，再以下列方式处理各孔细胞：(a)施以2mlrpmi培养基1小时(控制组)；(b)施以2mlrpmi培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps组)；(c)施以2ml含2％(w/v)莱菔子水萃取物的rpmi细胞培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps+莱菔子水萃取物组)；及(d)施以2ml含2％(w/v)莱菔子发酵物的rpmi细胞培养基1小时，再施以50μg/ml氧化型低密度脂蛋白及100ng/ml脂多醣(ox-ldl/lps+莱菔子发酵物组)。前述各组细胞于37℃培养24小时后用于qpcr分析。

图2显示前述各组细胞的血球分化抗原36(cd36)与巨噬细胞清除受体(msr)基因的相对表现量，其是相对于控制组细胞中相同基因的rna含量的比值；*及**分别表示相比ox-ldl/lps组为p＜0.05及p＜0.01。依据图2，施予氧化型低密度脂蛋白以及刺激发炎反应的脂多醣会略为增加巨噬细胞内msr的基因表现，但莱菔子发酵物的额外处理显著抑制msr的基因表现。此外，莱菔子发酵物会使ox-ldl/lps刺激下减少的cd36基因表现有更明显下降。相对地，相比ox-ldl/lps组，莱菔子水萃取物的额外处理仅显著减少msr的基因表现，但未显著影响cd36基因表现。此结果说明莱菔子发酵物能较全面地抑制巨噬细胞中的氧化型低密度脂蛋白结合受体的基因表现，因此有效减少巨噬细胞对氧化型低密度脂蛋白的摄取及细胞内脂肪累积。

综上所述，上述实验显示经过特定发酵过程的莱菔子发酵物能抑制巨噬细胞中的氧化型低密度脂蛋白结合受体的基因表现，减少巨噬细胞内脂肪累积，最终抑制泡沫细胞形成。因此，本发明提供莱菔子发酵物用于制备抑制泡沫细胞形成的组合物的用途，该组合物可具有粉末、颗粒、溶液、胶体、或膏体的剂型，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服方式给予一个体。