可洗消神经毒剂的蛋白-聚合物复合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及防化领域，具体涉及蛋白-聚合物复合物，其可作为神经毒剂的洗消材料。所述纳米复合物能够实现神经毒剂的极快速洗消，能良好的分散在水体系中，性能温和，对皮肤、设备、环境等无刺激性，且原材料均为大规模工业化成品，获取方便，造价低廉。
背景技术：
：1.神经毒剂的简介神经毒剂(nerveagent)是化学战剂CWA(chemicalwarfareagents)中的一种，指破坏神经系统正常传导功能的有毒性化学物质。神经毒剂的致伤途径包括皮肤、眼、呼吸道、消化道等，其中皮肤表面积最大，最易沾染毒剂造成中毒甚至死亡。神经毒剂主要分为G类毒剂和V类毒剂，它们的共性是稳定性，即常温下不易分解；速杀性，即如不及时抢救，可迅速造成伤员死亡。G类毒剂主要包括塔崩GA(tabun)、沙林GB(sarin)、梭曼GD(soman)，它的特点是隐蔽性，即无臭无味、无刺激、不易被发现。GD几乎没有特异体内解毒酶，机体染毒后救治非常困难。V类毒剂主要为维埃克斯VX，其特点是长效性，在环境中降解非常缓慢，其使用后施毒区域沾染维持很长时间；高毒性，其毒性极高，是梭曼毒性的十倍。综上原因，为快速从人体、环境中除去神经毒剂，保证平民或作战人员生命安全，针对神经毒剂洗消材料的研究尤其重要。2.神经毒剂的洗消现有针对神经毒剂洗消的方法主要包括：天然洗消、物理洗消、化学洗消和生物洗消。天然洗消主要通过通风、日晒、雨水冲刷、自行蒸发分解等方法对染毒物体上的神经毒剂进行洗消，洗消速度极慢且不可控；物理洗消主要通过活性炭等吸附材料，以吸附、溶剂吸收、高温分解、冲洗等方式进行，可快速洗消，但洗消不彻底，易造成泄露或二次污染；化学洗消主要包括使用含有有效氯的化合物(例如次氯酸盐类或氯胺类等)、碱-醇-胺消毒体系(例如氢氧化钠、碳酸氢钠或乙醇胺等)、氧化剂等材料(例如双氧水)，通过化学反应彻底消除毒剂，但是有一定刺激性和腐蚀性，部分材料难以应用于设备和人体；生物洗消，主要通过生物洗消酶催化水解神经毒剂，因其具有高效、环境友好、无腐蚀、无刺激等突出优势，被称为“最理想的洗消剂”。除该类酶外，现有技术中未见其它可用于毒剂洗消的蛋白材料。神经毒剂的高致死率、速杀性对洗消技术和洗消材料提出了较高的要求：(1)洗消剂须对毒剂完全彻底洗消，稍有残留即会造成严重的中毒反应；(2)洗消剂须尽可能在毒剂分子扩散和起效前，在极快速的时间内完成对毒剂分子的洗消；(3)尽可能性能温和，不刺激和损伤皮肤，不腐蚀和破坏装备，减少对环境的污染。因此，如何设计一种具有高效、快速和低刺激的洗消剂，一直是本领域尚待解决的问题。技术实现要素：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所涉及的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中使用的，术语BSA，为牛血清白蛋白。如本文中使用的，术语HSA，为人血清白蛋白。如本文中使用的，术语Mb，为肌红蛋白。如本文中使用的，术语NHS，为N-羟基丁二酰亚胺。如本文中使用的，术语EDAC，为1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰亚胺盐酸盐。如本文中使用的，术语F127，为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物。如本文中使用的，术语DMAP，为4-二甲氨基吡啶。如本文中使用的，术语BSA-DMAEMA，为牛血清白蛋白-水凝胶复合洗消材料。如本文中使用的，术语BSA-F127，为牛血清白蛋白-F127嵌段共聚物复合洗消材料。如本文中使用的，术语HSA-F127，为人血清白蛋白-F127嵌段共聚物复合洗消材料。如本文中使用的，术语Mb-F127，为肌红蛋白-F127嵌段共聚物复合洗消材料。如本文中使用的，术语h，为小时。如本文中使用的，术语min，为分钟。如本文中使用的，术语n，为摩尔数。如本文中使用的，术语M，为摩尔质量，即g/mol。如本文中使用的，术语g，为克数。如本文中使用的，术语V，为体积。发明人通过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种蛋白-聚合物纳米复合物。所述蛋白和聚合物基本无洗消能力，然而所得复合物出人意料地可以实现针对神经毒剂的极快速洗消，并且温和不刺激皮肤，由此完成了本发明。在一个方面，本申请提供一种应用于神经毒剂洗消的蛋白-聚合物纳米复合物，其中，所述蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)和肌红蛋白(Mb)；所述聚合物为水溶性聚合物。在一些优选的实施方案中，所述蛋白为BSA。在一些优选的实施方案中，所述聚合物为F127。在一些优选的实施方案中，所述神经毒剂为有机磷毒剂，包括沙林、塔崩、梭曼和VX，优选为梭曼。在一些优选的实施方案中，所述蛋白通过连接体与所述聚合物连接；所述连接体为-CO-(CH2)n-CO-，n为选自0-6的整数。在一些优选的实施方案中，所述连接体一端与所述蛋白表面氨基连接，另一端与所述聚合物上的羟基连接。在一些优选的实施方案中，所述复合物粒径为50-400纳米(例如50-350纳米，50-300纳米，50-250纳米，50-200纳米，50-150纳米，100-350纳米，100-300纳米，100-250纳米，100-200纳米，100-150纳米，150-350纳米，150-300纳米，150-250纳米或150-200纳米)。在一些优选的实施方案中，所述复合物为核壳结构。在一些优选的实施方案中，所述复合物壳层厚度为50-200纳米(例如50-150纳米，50-100纳米或100-150纳米)。在另一个方面，本申请提供一种洗消组合物或洗消液，其含有前述的复合物。在另一个方面，本申请提供一种防护装备，其含有前述的复合物、洗消组合物或洗消液。在另一个方面，本申请提供前述的复合物、洗消组合物、洗消液或防护装备在洗消毒剂中的用途。在一些优选的实施方案中，所述毒剂为神经毒剂或糜烂性毒剂。在一些优选的实施方案中，所述神经毒剂为有机磷毒剂，例如选自沙林、塔崩、梭曼和VX。在一些优选的实施方案中，所述神经毒剂为梭曼。在另一个方面，本申请提供前述的复合物的制备方法，其包括以下步骤：(1)将所述聚合物上引入-CO-(CH2)n-COOH，n为选自0-6的整数，得到聚合物-CO-(CH2)n-COOH，而后加至所述蛋白的水溶液中进行反应得到所述复合物粗品；优选地，先将所述聚合物-CO-(CH2)n-COOH链端的羧酸基团经NHS活化后，再与所述蛋白反应；(2)将步骤(1)中得到的复合物粗品透析得到所述复合物。在一些优选的实施方案中，所述蛋白的水溶液的浓度为0.1-1mg/ml，例如0.1-0.5mg/ml，0.2mg/ml。在一些优选的实施方案中，当所述聚合物为F127时，所述聚合物-CO-(CH2)n-COOH可为发明的有益效果本申请的蛋白-聚合物纳米复合物具有以下有益效果中的一个或多个：本申请提供一种神经毒剂洗消材料，其为蛋白-聚合物纳米复合物，其能够实现对神经毒剂极快速的洗消。在某些优选的实施方案中，所述复合物可趋近100％洗消梭曼毒剂。在某些优选的实施方案中，所述复合物可在极短时间内(例如2s内)实现对梭曼毒剂趋近100％的洗消效率。本申请的蛋白-聚合物纳米复合物安全性高，温和不刺激皮肤。所述复合物中使用的纳米载体为天然蛋白类材料，无免疫原性、生物相容性高，降解产物为多种氨基酸，无毒副作用。本申请的蛋白-聚合物纳米复合物，优选采用牛血清白蛋白(BSA)为纳米载体，其价格低廉，(1500-2000元/公斤)，相比于传统的有机磷水解酶等蛋白类洗消剂(23000元/公斤)价格约为其十分之一，且洗消速率洗消率或稳定性大幅高于传统的机磷水解酶。在所涉及的蛋白中，肌红蛋白为纤维状蛋白，其形成复合物后，在0.2mg/ml的使用量下，洗消效率平均达到78％，球状蛋白中，BSA复合物的洗消效率高于HSA复合物，而从药料价格考虑，HSA价格达到了近100000元/公斤，作为洗消使用的大量消耗品，基于HSA的洗消材料成本是较难以承受的。因此，在相同情况下，优先考虑使用便宜的BSA作为原材料。然而基于HSA的洗消材料，由于HSA为人源性材料，考虑在皮肤出现流血伤口等更为复杂的情况时洗消使用，安全性较高。本申请的蛋白-聚合物纳米复合物，由于采用“先合成高分子，再高分子接蛋白”的合成策略，不同于其他“蛋白接单体，再合成高分子”的合成步骤，交联度较低，所得蛋白-聚合物纳米复合物溶解性良好，能良好的分散于水溶液之中。另外，本发明人意外发现改变聚合物和酶的投料顺序(如本申请复合物制备方法步骤(1)所述)获得的产品洗消速率提升为2秒内达到100％，远超现有报道。附图说明图1显示了BSA-F127的扫描电镜照片，形态为不规则近圆形，尺寸在50-200nm左右。图2显示了BSA-F127的透射电镜照片，其为核壳结构，中心为深色蛋白，外层为浅色高分子层。图3显示了BSA-F127、BSA、F127的X射线衍射结果。图4显示了BSA-F127分别在高浓度和低浓度下对梭曼的洗消效率。图5显示了BSA-F127与常用洗消材料对梭曼洗消速率比较。图6显示了高浓度NaOH(A)和BSA-F127(B)对皮肤的刺激性和损伤的病理和照片。图7显示了Mb-F127对梭曼的洗消效率。图8显示了HSA-F127对梭曼的洗消效率。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1BSA-F127的合成(1)称取5gF127放入容积为50ml的两口梨形瓶中，体系密封，抽真空而后充满氮气，后续该梨形瓶中的反应均在充满氮气的体系中进行。将15ml1,4-二氧六环和110μl三乙胺混匀，而后加入97mg4-二甲氨基吡啶DMAP彻底溶解，用注射器将该溶液注入上述梨形瓶中，并不断搅拌(1000r/min，90min)。(2)将琥珀酰酐溶液(99mg琥珀酰酐溶于5ml1,4-二氧六环中)通过恒压低液漏斗缓慢滴入到梨形瓶中，在室温下继续搅拌(1000r/min，41h)。(3)停止搅拌后，将溶液转移到100ml梨形瓶中(溶液接近油状无色)。用旋蒸仪悬蒸(100℃)除去多余的1,4-二氧六环。(4)用乙醚混匀该样本，离心两次(10000r/min，10min)，去除未反应的多余杂质，保留沉淀F127-COOH产物，共约5g。(5)将F127-COOH(总量约5g)溶于65ml二氯甲烷中，室温下搅拌(1500r/min，10min)。将800mgEDC溶于5ml二氯甲烷中，而后滴入到该反应中继续搅拌30min。(6)将NHS(500mg)溶于10ml二氯甲烷中，滴入到反应体系中，室温继续搅拌24h，溶液总体积共约80ml，为乳白色悬浊液。(7)溶液混合物用冷乙醚沉淀3次，而后用旋蒸仪旋干(40℃)，收集得到乳白色沉淀，经干燥得到F127-NHS粉末。(8)称取5mgBSA溶于25ml蒸馏水中(0.2mg/ml)，加入F127-NHS粉末1000mg，在室温下搅拌(1000r/min)18h，收集样品溶液。(9)透析袋预处理。首先，配制2％的NaHCO3水溶液500ml，1mM的EDTA二钠水溶液500ml。随后，将截留分子量为5000的透析袋裁剪成长度为30cm。将该透析袋先后放入上述NaHCO3和EDTA二钠两组溶液中分别依次煮沸(100℃，10min)，每次煮沸完均用蒸馏水冲洗，并分别称取30gHEPES和1.2gNaOH加入到2.5L蒸馏水中，充分搅拌分散溶解配制为透析液待用。(10)产物透析。将样品溶液加入到透析袋(勿超过透析袋总容积的1/2-1/3)，用夹子封闭透析袋两端，随后将其放入透析液中，在室温下低速搅拌(150r/min)。期间每12h更换一次透析液，共更换3次透析液，彻底清除溶液中多余的小分子单体杂质。透析48h后收集透析袋中的溶液，得到产物BSA-F127，该产物无色透明，共30ml，其中BSA的浓度为0.2mg/ml，将其放入冰箱冷冻储存(-20℃)。实施例2BSA-F127的物理学表征(1)形貌表征。分别取微量(约150～200μl)BSA-F127水溶液(BSA的浓度为0.2mg/ml)滴于硅片上，室温自然风干。待干燥后，喷镀一层纳米金层以增强样品的导电性，将样品置于扫描电子显微镜(SEM)下观察，见图1。由图1可看出，所合成的BSA类复合物为尺寸大概在200-300nm左右的纳米颗粒。(2)内部结构表征。取50μlBSA-F127水溶液(BSA的浓度为0.2mg/ml)滴于铜网上自然风干，待完全干燥后，置于透射电子显微镜(TEM)观察，见图2。由图中可看出BSA-F127为直径约为200-300nm的近圆形纳米颗粒；纳米颗粒内核称度高，外层显称度较低，证明该纳米材料为核壳结构。(3)zeta电位和粒径测定。zate电位表示颗粒表面的电荷情况，zeta电位绝对值越高，证明颗粒分散在水溶液中越稳定。将BSA水溶液(浓度为0.2mg/ml)、BSA-F127水溶液(BSA的浓度为0.2mg/ml)、F127水溶液样品取0.5ml稀释10倍，利用zeta粒径分布仪测定其zeta电位和粒径，重复测定，最后取平均值，结果见表1。表1BSA-F127粒径和zeta电位测定(x±s，n＝3)由结果可得知，单体为蛋白和高分子，其溶解在水中后呈溶胀状态，动态直径在50nm以下，且分散性良好，而当各自单体按照核壳结构组成纳米颗粒后，BSA-F127动态粒径均增至200nm以上。各材料Zeta电位绝对值均在8mV以上，分散性良好。(4)XRD测定。取BSA水溶液(浓度为0.2mg/ml)、BSA-F127水溶液(BSA的浓度为0.2mg/ml)、F127水溶液滴于2*2cm载玻片上，重复滴加多次。待干燥后，将样品置于XRD下观察，结果见图3。F127为无序的结构未出现明显的衍射峰(对应于图3自上而下三条谱线中的第二条)，而合成的BSA-F127在2θ＝6.47874°处可见明显的尖峰(对应于图3自上而下三条谱线中的第一条)，通过三组衍射峰对比可得知，该峰为合成的复合物的晶格衍射，同样证明，通过F127端基的活化修饰，成功将其与蛋白上的氨基结合，形成纳米复合结构。高分子的引入，在2θ＝6.47874°左右形成新的衍射峰，初步证明，该峰的形成，与高分子种类无关，而与所形成的纳米结构有关。实施例3复合物对神经毒剂的洗消评价具体实验步骤：1.配制洗消反应的溶液试剂(1)饱和联苯胺溶液：过量(1g)联苯胺加入200ml蒸馏水中，70℃水浴1h溶解度增加。而后立即用50ml注射器吸取溶液，用0.22μm滤膜压滤。得到饱和联苯胺溶液200ml。(2)0.25％过硼酸钠溶液：0.5g过硼酸钠加入200ml蒸馏水中，充分溶解。(3)0.01MPBS溶液：用现有0.2MPBS溶液稀释至1/20。(4)丙酮-0.01MPBS溶液：比例为200ml丙酮加入90ml0.01MPBS溶液。共290ml。(5)分别配制各种洗消材料浓度均为0.2mg/ml。2.制作梭曼的联苯胺反应标准线性曲线(标准曲线)。(1)领取梭曼90％纯度10μl，溶于9.99ml蒸馏水中，即稀释1000倍，标定为母液，于冰块中储存。(2)依据不同浓度稀释梭曼编号稀释倍率浓度(V/V)配法11/101*10(-4)0.5ml母液+4.5ml蒸馏水21/201/2*10(-4)1ml①+1ml蒸馏水31/401/4*10(-4)1ml①+3ml蒸馏水41/1201/12*10(-4)1ml③+2ml蒸馏水51/8401/84*10(-4)1ml④+6ml蒸馏水61/58801/588*10(-4)1ml⑤+6ml蒸馏水70蒸馏水(3)联苯胺显色反应：150μl蒸馏水和50μl梭曼(不同浓度)混匀，离心(3000r，1min)后，37℃水浴20min。随后依次加入丙酮+0.01MPBS混合溶液600μl，饱和盐酸联苯胺溶液300μl，0.25％过硼酸钠溶液300μl，混匀。放入37℃烘箱5min，加入96孔板。测定414nm下吸光度值。多余梭曼用浓NaOH破坏处理。(4)通过计算，梭曼联苯胺反应标准曲线方程为y＝1.4184x+0.0525，R2＝0.9992。梭曼浓度在0-0.1μg/μl范围内，其吸光度值在该线性范围内。通过这个方法可以测定残余梭曼的含量。3.BSA-F127不同时间点的体外洗消效果评价取90％纯度的梭曼稀释至5*10-5(v/v)，将BSA-F127(该材料中BSA浓度为0.2mg/ml)3.125ml(高浓度组)和0.625ml(低浓度组)分别加入到两个10mlEP管中，而后各管分别加入梭曼1.25ml，再加入蒸馏水调至总体积7.5ml，充分混匀，放入三用水箱中水浴(37℃)。每隔一定时间点从该EP管中取200μl，随后依次加入丙酮-0.01MPBS溶液600μl，饱和联苯胺溶液300μl，0.25％过硼酸钠溶液300μl，混匀，而后放入37℃隔水式恒温培养箱(静置5min)，将EP管中的溶液加入到96孔板，每孔200μl，放入酶标仪中，测定在414nm波长下的吸光度值。在相应时间点取样。结果见图4所示，在洗消剂投入瞬间(2s内)，BSA-F127洗消率达到近100％。而已有的基于有机磷水解酶OPH的OPH-F127，其在140min后才达到100％。实施例4常见的洗消材料对神经毒剂洗消的评价(1)NaHCO3对神经毒剂梭曼洗消速率的评价测试样品为NaHCO3(0.2mg/ml)，其余测试方法、各溶剂剂量和样品取点时间同实施例3。(2)NaOH对神经毒剂梭曼洗消速率的评价测试样品为NaOH(0.2，2mg/ml)，其余测试方法、各溶剂剂量和样品取点时间同实施例3。(3)活性炭对神经毒剂梭曼洗消速率的评价测试样品为0.2mg/ml活性炭混悬液。除最后实验步骤中从隔水式恒温培养箱(静置5min)取出后离心(1000r/min)5min，取上清加入200μl到96孔板测定结果外，其余测试方法、各溶剂剂量和样品取点时间同实施例3。(4)H2O2对神经毒剂梭曼洗消速率的评价测试样品为30％H2O2溶液，其余测试方法、各溶剂剂量和样品取点时间同实施例3。(5)有机磷水解酶(OPH)对神经毒剂梭曼的洗消效率评价测试样品为浓度0.2mg/mlOPH的溶液，其余测试方法、各溶剂剂量和样品取点时间同实施例3。(6)洗消结果本实验对目前常见的各种洗消材料进行了测试，为保证实验结果的可对比性，各材料的浓度均与BSA-F127相同(即0.2mg/ml，以BSA计)，结果如图5所示。在相同浓度下，NaHCO3随着时间洗消率没有明显变化，洗消率最高达到5.63％；活性炭洗消率随着时间逐渐增加，半小时达到22.76％；NaOH随着时间洗消效率增加，在2分30秒时达到趋近100％，在极高浓度下(10mg/ml)达到与BSA-F127接近的洗消效果；传统的有机磷水解酶OPH，随着时间的延长，其洗消效率缓慢增加，符合酶的催化洗消的特性，但洗消效率低，洗消速率慢，在前10min内，仅能达到15％以下的洗消率；另一种常见洗消材料双氧水，其在最高浓度30％的情况下，也仅能仅达到6.01％的洗消率，在与洗消剂相同浓度下(30％的双氧水稀释约1500倍)，无任何洗消效果；而本实验合成的BSA-F127在洗消瞬间(2秒)随即达到趋近100％的洗消，洗消效率远优于上述几组材料。实施例5对皮肤的安全性评价大鼠麻醉后，平躺固定于实验台上，腹部涂抹脱毛膏去毛后，清洗腹部，并擦干待用。随后滴加30μL待测洗消剂于裸露腹部皮肤上，观察皮肤变化情况，拍照，10分钟后，取该区域皮肤，做病理检查。依次滴加的洗消剂为BSA-F127和高浓度氢氧化钠。从结果上看(图片6)，虽然能达到近似一致的洗消速率(见实施例4)，但是氢氧化钠严重的碱灼伤皮肤，直接破坏表皮层，对皮肤造成了较为严重的损伤，不能直接应用于皮肤的洗消，而BSA-F127对皮肤无刺激性，安全性高。实施例6Mb-F127的合成及洗消效果评价(1)称取5gF127放入容积为50ml的两口梨形瓶中，体系密封，抽真空而后充满氮气，后续该梨形瓶中的反应均在充满氮气的体系中进行。将15ml1,4-二氧六环和110μl三乙胺混匀，而后加入97mg4-二甲氨基吡啶DMAP彻底溶解，用注射器将该溶液注入上述梨形瓶中，并不断搅拌(1000r/min，90min)。(2)将琥珀酰酐溶液(99mg琥珀酰酐溶于5ml1,4-二氧六环中)通过恒压低液漏斗缓慢滴入到梨形瓶中，在室温下继续搅拌(1000r/min，41h)。(3)停止搅拌后，将溶液转移到100ml梨形瓶中(溶液接近油状无色)。用旋蒸仪悬蒸(100℃)除去多余的1,4-二氧六环。(4)用乙醚混匀该样本，离心两次(10000r/min，10min)，去除未反应的多余杂质，保留沉淀F127-COOH产物，共约5g。(5)将F127-COOH(总量约5g)溶于65ml二氯甲烷中，室温下搅拌(1500r/min，10min)。将800mgEDC溶于5ml二氯甲烷中，而后滴入到该反应中继续搅拌30min。(6)将NHS(500mg)溶于10ml二氯甲烷中，滴入到反应体系中，室温继续搅拌24h，溶液总体积共约80ml，为乳白色悬浊液。(7)溶液混合物用冷乙醚沉淀3次，而后用旋蒸仪旋干(40℃)，收集得到乳白色沉淀，经干燥得F127-NHS粉末。(8)称取5mg肌红蛋白(Mb)溶于25ml蒸馏水中(0.2mg/ml)，加入F127-NHS粉末1000mg，在室温下搅拌(1000r/min)18h，收集样品溶液。(9)透析袋预处理参照实施例3。(10)产物透析。将样品溶液加入到透析袋(勿超过透析袋总容积的1/2-1/3)，用夹子封闭透析袋两端，随后将其放入透析液中，在室温下低速搅拌(150r/min)。期间每12h更换一次透析液，共更换3次透析液，彻底清除溶液中多余的小分子单体杂质。透析48h后收集透析袋中的溶液，得到产物Mb-F127，该产物无色透明，共30ml，其中Mb的浓度为0.2mg/ml，将其放入冰箱冷冻储存(-20℃)。(11)按实施例3的测试方法测试Mb-F127的洗消效率。结果显示(图7)，在2s内，洗消率最高达到80％，低于同浓度的BSA-F127。实施例7HSA-F127的合成及洗消效果评价(1)称取5gF127放入容积为50ml的两口梨形瓶中，体系密封，抽真空而后充满氮气，后续该梨形瓶中的反应均在充满氮气的体系中进行。将15ml1,4-二氧六环和110μl三乙胺混匀，而后加入97mg4-二甲氨基吡啶DMAP彻底溶解，用注射器将该溶液注入上述梨形瓶中，并不断搅拌(1000r/min，90min)。(2)将琥珀酰酐溶液(99mg琥珀酰酐溶于5ml1,4-二氧六环中)通过恒压低液漏斗缓慢滴入到梨形瓶中，在室温下继续搅拌(1000r/min，41h)。(3)停止搅拌后，将溶液转移到100ml梨形瓶中(溶液接近油状无色)。用旋蒸仪悬蒸(100℃)除去多余的1,4-二氧六环。(4)用乙醚混匀该样本，离心两次(10000r/min，10min)，去除未反应的多余杂质，保留沉淀F127-COOH产物，共约5g。(5)将F127-COOH(总量约5g)溶于65ml二氯甲烷中，室温下搅拌(1500r/min，10min)。将800mgEDC溶于5ml二氯甲烷中，而后滴入到该反应中继续搅拌30min。(6)将NHS(500mg)溶于10ml二氯甲烷中，滴入到反应体系中，室温继续搅拌24h，溶液总体积共约80ml，为乳白色悬浊液。(7)溶液混合物用冷乙醚沉淀3次，而后用旋蒸仪旋干(40℃)，收集得到乳白色沉淀，经干燥得到F127-NHS粉末。(8)称取5mg人血清白蛋白(HSA)溶于25ml蒸馏水中(0.2mg/ml)，加入F127-NHS粉末1000mg，在室温下搅拌(1000r/min)18h，收集样品溶液。(9)透析袋预处理参照实施例3.(10)产物透析。将样品溶液加入到透析袋(勿超过透析袋总容积的1/2-1/3)，用夹子封闭透析袋两端，随后将其放入透析液中，在室温下低速搅拌(150r/min)。期间每12h更换一次透析液，共更换3次透析液，彻底清除溶液中多余的小分子单体杂质。透析48h后收集透析袋中的溶液，得到产物HSA-F127，该产物无色透明，共30ml，其中Mb的浓度为0.2mg/ml，将其放入冰箱冷冻储存(-20℃)。(11)按实施例3的测试方法测试HSA-F127的洗消效率。结果显示(图8)，在2s内，洗消率最高达到95％，略低于同浓度的BSA-F127。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，根据已经公开的所有教导，本领域技术人员可以对本发明技术方案的细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。当前第1页1 2 3