本发明涉及医用材料领域，尤其涉及一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法。
背景技术：
近年来，癌症已成为危害人类健康最大的疾病之一，而化疗是各种癌症最常见的治疗方式之一。目前临床用治疗肿瘤的药物大多为小分子化疗药物，然而小分子抗癌药物不但能进入肿瘤部位，而且很容易渗透到正常组织和器官。由于抗癌药物对癌细胞的选择性低，在肿瘤的临床上有效的细胞毒性所需的药物剂量，往往会严重损害周围健康的细胞，导致不良的副作用。而且小分子化疗药物的药效也受到多种耐药性的影响。因此，对于肿瘤形成及治疗方法的研究，目前己经成为研究人员的研究重点和热点。近年来，生物医学与纳米技术的结合为癌症的治疗带来了新机遇。具有独特的光学、磁学、电学和声学等理化性质的纳米药物为重大疾病的预防、诊断和治疗带来了新思路。其中，聚合物纳米材料具有优良的生物相容性和降解性、可设计的尺寸和表面性能、较高的载药量和药物递送效率、良好的循环稳定性和epr效应，从而提高药物的生物利用度，实现高效的药物靶向和控制释放。因此，聚合物纳米材料被广泛应用于药物递送系统。
随着聚合物纳米材料作为药物载体在生物医药方面的广泛应用，设计和构建能够有效输送抗癌药物至癌变部位，并控制药物释放速率、维持血药浓度、减小药物毒副作用等的药物载体是临床医学非常重要的研究内容。而纳米药物载体凭着其独特的性能，在解决这一问题方面有着极具广阔的前景。各种药物载体能对药物进行靶向运输和控制释放，提高抗癌药物在肿瘤组织或肿瘤细胞中的积累，降低系统毒性，增加药物的耐受剂量，实现增溶、增效和减毒的目的。如何让聚合物纳米材料同时兼具靶向性、肿瘤热疗和化疗的协同效应，改善其在药物靶向和代谢稳定性方面的不足等问题已成为关注的焦点。因此，研究一种同时兼具靶向性、肿瘤热疗和化疗协同效应的聚合物纳米材料迫在眉睫。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，本发明首先使用羧基化胆固醇和蛋黄卵磷脂制备得到具有ph敏感的脂质体膜；然后以脂质体膜为聚合模板，温度敏感的异丙基丙烯酰胺为单体，n，n-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，通过模板原位聚合方法制备出一种新型的ph和温度双敏感的纳米药物递送载体；然后再将氧化石墨烯与叶酸、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺、氮-羟基琥珀酰亚胺反应得到叶酸@石墨烯；最后再将叶酸@石墨烯负载于脂质体凝胶上，得到最终产物。该方法制备的脂质体凝胶将在后期可实现靶向性、肿瘤热疗和化疗的协同效应，增加聚合物材料的稳定性，有望用于癌细胞治疗。
本发明的具体技术方案为：一种具有靶向光热效应的智能响应性纳米粒子的制备方法，其特征在于：以μmol、mmol、ml、mg和g计，包括以下步骤：
1)取40～50μmol蛋黄卵磷脂和13～15μmol胆固醇琥珀酸单酯，用2～4ml三氯甲烷溶解，采用旋转蒸发法将溶剂除去，得到一层无色透亮的薄膜，真空干燥，得到干燥脂质体膜。
在步骤1)中，在用旋转蒸发后又采用真空干燥是为了在不污染样品的情况下使溶剂完全挥发。
2)取500～550mg异丙基丙烯酰胺，50～55mgn，n-亚甲基双丙烯酰胺，5～8mg偶氮二异丁脒盐酸盐和260～280mmol硫酸铵，用5～8ml去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液。
在步骤2)中，异丙基丙烯酰胺作为温敏单体，n，n-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，采用偶氮二异丁脒盐酸盐、硫酸铵双引发剂体系，使得反应快速得到温敏性凝胶。
3)通过手摇法使步骤1)所得干燥脂质体膜脱落溶解到步骤2)所得水凝胶预聚物水溶液中，在冰水浴下超声处理，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液。
4)在步骤3)所得混合溶液中加入抗坏血酸50～70mg，抽真空后通入氮气，重复3～5次；转移至氮气氛围的密封反应装置中，于45～50℃水浴中反应70～90min，并将反应后的溶液置于透析袋中透析去除未反应的杂质。
在步骤4)中，采用抗坏血酸作为阻聚剂，可阻止脂质体囊泡外部发生聚合。反复抽真空通氮气可得到较为密闭的反应环境，有利于反应进行。
5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到双敏感脂质体纳米凝胶溶液。
在步骤5)中，分别用孔径100nm和200nm的挤出器得到的粒子更容易被细胞胞吞。
6)取50～60mg氧化石墨烯加入50～60ml蒸馏水，在冰浴条件下超声振荡使氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在1000～12000r/min下离心15～25min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，合并上清液得到氧化石墨烯水溶液。
在步骤6)中，对氧化石墨烯进行超声粉碎，即可得到纳米尺寸的氧化石墨烯，同时对沉淀进行多次超声，使得氧化石墨烯的尺寸分布较为均匀。
7)将步骤6)所得氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水进行透析，取滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液。
在步骤7)中，对氧化石墨烯水溶液进行透析，可以除去杂质，得到较为纯净的溶液。
8)将步骤7)所得氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入5～7g氢氧化钠、5～7g次氯酸钠，超声浴1～3h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析40～50h，除去未反应的水溶性物质。
在步骤8)中，将氧化石墨烯与氢氧化钠、次氯酸钠反应，使氧化石墨烯上的羟基转化为羧基，有利于接下来与叶酸上的氨基发生反应；使用稀盐酸洗涤是为了保证样品始终为中性；透析处理是为了得到浓度和纯度较高的溶液。
9)向步骤8)所得溶液中加入0.5～0.8g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边加入125～127mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和182.5～184.5mg氮-羟基琥珀酰亚胺，超声2～3h后用ph＝7.8-8.2的碳酸氢钠溶液进行透析处理，每3-5h换一次水，40～50h后完成透析，得到黑色溶液。
在步骤9)中，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和氮-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，作用为活化氧化石墨烯，使其与叶酸充分反应，通过将叶酸连接于聚合物微粒表面，增加其与受体的结合性，使负载药物的聚合物微粒大量聚集于对象细胞表面；使用碳酸氢钠作为透析液是为了保证溶液处于中性条件。
10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯。
在步骤10)中，采用丙酮反复洗涤是为了降低溶液zeta电位，使其接近合成环境。
11)将步骤10)所得叶酸修饰的氧化石墨烯与步骤5)所得双敏感脂质体纳米凝胶溶液共混，避光搅拌8～12h，离心洗涤、冷冻干燥，得到最终产物。
作为优选，步骤11)中，所述叶酸修饰的氧化石墨烯与双敏感脂质体纳米凝胶溶液的用量比为1∶1.。
作为优选，步骤3)中，超声过程为：使用超声波粉碎机，在400w的功率下对混合物进行超声振荡5～8min。
作为优选，步骤4)中，选用截留分子量为8000da的透析袋透析3～5d。
作为优选，步骤6)中，超声振荡为：使用超声波粉碎机，在400-600w的功率下超声振荡1～2h；离心过程为：使用冷冻高速离心机，1000～12000r/min的条件下离心15～20min。
作为优选，步骤7)中，选用截留分子量为8000～14000da的透析袋透析2～3d。
作为优选，步骤8)和9)中，选用截留分子量为3500da的透析袋透析。
作为优选，步骤7)中，离心过程为：使用冷冻高速离心机，5000～7000r/min的条件下离心15～20min。
作为优选，步骤1)中，真空干燥12～15h。
作为优选，步骤10)中，真空干燥温度为40～50℃。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1.在步骤2)中，采用温敏性单体制得具有温度敏感的纳米粒子。
2.在步骤3)中，将具有温敏效应的预聚物溶液和脂质体混合，制得具有温度和ph双敏感的纳米粒子。
3.在步骤4)中，采用挤出器可得到粒径均匀的脂质体凝胶粒子。
4.在步骤6)和7)中，通过超声、离心、透析等处理对氧化石墨烯进行提纯，得到均匀分散的小尺寸氧化石墨烯。
5.在步骤8)中，通过氧化石墨烯与氢氧化钠、次氯酸钠发生反应使氧化石墨烯上的羟基转化为羧基，保证其与叶酸充分反应。
6.在步骤9)中，通过将叶酸连接于聚合物材料表面，增加其与受体的结合性，使负载药物的聚合物微粒大量聚集于对象细胞表面，从而增大作用部位的药物浓度，减少对正常细胞的毒副作用。
7.在步骤11)中，将叶酸@石墨烯负载于脂质体纳米粒子上，可使其在具有温度和ph双敏感的同时，也具有靶向性和光热效应。
8.在本发明中，通过制备复合纳米材料可实现高效的肿瘤热疗和化疗协同效应，增加药物的稳定性，实现主动靶向性，增加与受体的结合能力，从而大大提升对癌细胞的治疗效果。
9.本发明通过构建一种安全，无毒性，并且能够高效运输药物的纳米载体，能够提高药物的稳定性，便于贮存。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
(1)取40μmol的蛋黄卵磷脂和13μmol的胆固醇琥珀酸单酯，用2ml三氯甲烷溶解在500ml的梨形瓶中，用旋转蒸发仪将溶剂除去得到一层无色透亮的薄膜，放入真空干燥箱中12h，备用；
(2)取500mg异丙基丙烯酰胺，50mgn，n-亚甲基双丙烯酰胺，5mg偶氮二异丁脒盐酸盐，260mmol硫酸铵，用5ml去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液，备用；
(3)通过手摇法使步骤(1)得到的干燥脂质体膜脱落溶解到步骤(2)得到的预聚物水溶液中，在冰水浴下将样品置于细胞粉碎仪探头下400w超声5min，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液，备用；
(4)在混合溶液中加入抗坏血酸50mg，抽真空后通入氮气，重复3次。将在氮气保护下的密封反应装置置于45℃水浴锅中反应70min，并将反应后的溶液置于透析袋(截留相对分子质量8000da)中透析3d去除未反应的杂质。
(5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到粒径分布良好的双敏感脂质体纳米凝胶溶液，备用；
(6)取50mg氧化石墨烯加入50ml蒸馏水，在冰浴条件下，使用超声粉碎机在500w功率下对混合物进行超声振荡1h，氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在1000r/min下离心15min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，最终得到氧化石墨烯水溶液，备用；
(7)将步骤(6)得到的氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水以截留分子量为8000da的透析袋透析2d，获得的滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液，备用；
(8)将步骤(7)得到的氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入5g氢氧化钠、5g次氯酸钠，超声浴1h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析40h，除去未反应的水溶性物质；
(9)向步骤(8)得到的溶液中加入0.5g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边向加入125mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和182.5mg氮-羟基琥珀酰亚胺，超声2h后用ph＝8碳酸氢钠溶液进行透析处理，每3h换一次水，40h后完成透析，得到黑色溶液；
(10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，而后置于40℃下真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯，记叶酸@石墨烯，备用；
(11)将步骤(10)得到的叶酸@石墨烯与步骤(5)得到的脂质体纳米凝胶溶液1∶1共混，避光搅拌8h，通过离心洗涤、冷冻干燥等即可得到最终产物。
本实施例所得的100μg/ml材料的光热效应可达到6min升高40℃左右。
实施例2
(1)取45μmol的蛋黄卵磷脂和14μmol的胆固醇琥珀酸单酯，用3ml三氯甲烷溶解在500ml的梨形瓶中，用旋转蒸发仪将溶剂除去得到一层无色透亮的薄膜，放入真空干燥箱中13h，备用；
(2)取530mg异丙基丙烯酰胺，53mgn，n-亚甲基双丙烯酰胺，7mg偶氮二异丁脒盐酸盐，270mmol硫酸铵，用7ml去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液，备用；
(3)通过手摇法使步骤(1)得到的干燥脂质体膜脱落溶解到步骤(2)得到的预聚物水溶液中，在冰水浴下将样品置于细胞粉碎仪探头下500w超声6min，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液，备用；
(4)在混合溶液中加入抗坏血酸60mg，抽真空后通入氮气，重复4次。将在氮气保护下的密封反应装置置于47℃水浴锅中反应80min，并将反应后的溶液置于透析袋(截留相对分子质量8000da)中透析4d去除未反应的杂质。
(5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到粒径分布良好的双敏感脂质体纳米凝胶溶液，备用；
(6)取55mg氧化石墨烯加入55ml蒸馏水，在冰浴条件下，使用超声粉碎机在500w功率下对混合物进行超声振荡1h，氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在11000r/min下离心20min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，最终得到氧化石墨烯水溶液，备用；
(7)将步骤(6)得到的氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水以截留分子量为10000da的透析袋透析2d，获得的滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液，备用；
(8)将步骤(7)得到的氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入6g氢氧化钠、6g次氯酸钠，超声浴2h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析45h，除去未反应的水溶性物质；
(9)向步骤(8)得到的溶液中加入0.7g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边向加入126mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和183.5mg氮-羟基琥珀酰亚胺，超声2h后用ph＝8碳酸氢钠溶液进行透析处理，每4h换一次水，45h后完成透析，得到黑色溶液；
(10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，而后置于45℃下真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯，记叶酸@石墨烯，备用；
(11)将步骤(10)得到的叶酸@石墨烯与步骤(5)得到的脂质体纳米凝胶溶液1∶1共混，避光搅拌10h，通过离心洗涤、冷冻干燥等即可得到最终产物。
本实施例所得100μg/ml材料的光热效应可达到6min升高45℃左右。
实施例3
(1)取50μmol的蛋黄卵磷脂和15μmol的胆固醇琥珀酸单酯，用4ml三氯甲烷溶解在500ml的梨形瓶中，用旋转蒸发仪将溶剂除去得到一层无色透亮的薄膜，放入真空干燥箱中15h，备用；
(2)取550mg异丙基丙烯酰胺，55mgn，n-亚甲基双丙烯酰胺，8mg偶氮二异丁脒盐酸盐，280mmol硫酸铵，用8ml去离子水溶解，配制成水凝胶预聚物水溶液，备用；
(3)通过手摇法使步骤(1)得到的干燥脂质体膜脱落溶解到步骤(2)得到的预聚物水溶液中，在冰水浴下将样品置于细胞粉碎仪探头下500w超声8min，形成由脂质体囊泡和纳米凝胶预聚物水溶液组成的混合溶液，备用；
(4)在混合溶液中加入抗坏血酸70mg，抽真空后通入氮气，重复5次。将在氮气保护下的密封反应装置置于45～50℃水浴锅中反应90min，并将反应后的溶液置于透析袋(截留相对分子质量8000da)中透析5d去除未反应的杂质。
(5)先后用200nm、100nm孔径大小的脂质体挤出器挤出透析所得溶液，得到粒径分布良好的双敏感脂质体纳米凝胶溶液，备用；
(6)取60mg氧化石墨烯加入60ml蒸馏水，在冰浴条件下，使用超声粉碎机在500w功率下对混合物进行超声振荡2h，氧化石墨片层剥落，获得棕黄色的分散液，将分散液在12000r/min下离心25min，收集棕黄色上清液，将沉淀再次加入蒸馏水中，重复上述步骤，最终得到氧化石墨烯水溶液，备用；
(7)将步骤(6)得到的氧化石墨烯水溶液，用蒸馏水以截留分子量为14000da的透析袋透析3d，获得的滤液即为纯化后的氧化石墨烯分散液，备用；
(8)将步骤(7)得到的氧化石墨烯分散液，超声分散均匀，加入7g氢氧化钠、7g次氯酸钠，超声浴3h，将氧化石墨烯片层上的羟基转化为羧基；反应完全后，用稀盐酸中和并反复漂洗，经过离心处理，收集上层的黑色溶液，并用去离子水透析50h，除去未反应的水溶性物质；
(9)向步骤(8)得到的溶液中加入0.8g叶酸，超声分散均匀，边搅拌边向加入127mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺和184.5mg氮-羟基琥珀酰亚胺，超声3h后用ph＝8碳酸氢钠溶液进行透析处理，每5h换一次水，50h后完成透析，得到黑色溶液；
(10)采用旋转蒸发法去除黑色溶液中的水分，用丙酮反复洗涤，而后置于50℃下真空干燥，得到叶酸修饰的氧化石墨烯，记叶酸@石墨烯，备用；
(11)将步骤(10)得到的叶酸@石墨烯与步骤(5)得到的脂质体纳米凝胶溶液1∶1共混，避光搅拌12h，通过离心洗涤、冷冻干燥等即可得到最终产物。
本实施例所得100μg/ml材料的光热效应可达到6min升高50℃左右。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。