一种评估HR缺陷模型及应用的制作方法

(一)技术领域

本发明涉及生命科学与生物技术领域，特别涉及一种评估同源重组缺陷的多分子标志物、评估hr缺陷模型及应用。

(二)

背景技术：

胆囊癌是胆系肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈明显的上升趋势。胆道恶性肿瘤早期缺乏典型症状而不易诊断，同时因其特殊的解剖结构和复杂的毗邻关系，根治性切除率低，预后极差，其5年生存率仅为9％～18％[baiui,visserb.gallbladdercancer.jama.2018；320(12):1294.]。目前对胆囊癌的防治研究仍处于起步阶段，多见于手术方式、术前检测评价、病例特点等方面的探讨或临床病理联系，无论是在研究还是在治疗应用领域均远远落后于其他多数肿瘤。在临床上胆囊癌的治疗则多采用手术为主的综合治疗，中晚期患者常失去手术机会。胆囊癌对许多传统的化疗药物不敏感，化疗效果受病人个体差异影响较大，但术后化疗仍有改善预后的意义，且可能是很多病人唯一能得到的治疗。fam(氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素)药物组合可与dna发生交叉联结，抑制dna合成并造成其损伤，是现有胆囊癌常用化疗方案之一。然研究资料表明与其他胃肠道肿瘤比较，胆囊癌的化疗敏感性欠佳[baiui,visserb.gallbladdercancer.jama.2018；320(12):1294.]。综上，基于目前胆囊癌预后恶劣、治疗单一的现状，针对不同靶点选择靶向药物提高胆囊癌对化疗药物的敏感性、减少无效治疗，对提高病人整体生存率有很重要的意义。

dna双链断裂(doublestrandbreak,dsb)是哺乳动物中最危险的dna损伤之一，如果不修复或错误修复，可能导致基因组不稳定或细胞死亡，是目前多类临床化疗药物(包括fam)治疗肿瘤的重要途径。为保证基因组的稳定性，细胞已进化出复杂但非常协调的dna损伤反应，以确保合适的dsb修复[jacksonsp,bartekj.thedna-damageresponseinhumanbiologyanddisease.nature,2009,461(7267):1071-1078.]。目前认为相较于正常细胞，肿瘤细胞自身dna修复能力会存在不同程度的升高，这也是大多数化疗药物无效的原因之一。人体中dsb修复主要由两条途径完成：同源重组(homologousrecombination，hr)和非同源末端连接(nonhomologousend-joining,nhej)。hr主要发生于细胞周期的s期和g2期，需姐妹染色单体的同源序列作为模板进行潜在无差错的修复，并导致基因转换，将供体的dna序列复制到受体。hr缺陷能产生基因组不稳定性，是癌症治疗药物的潜在靶点。以下将分别从自噬和parpi两方面阐述hr在其中的作用：

自噬与hr正常胆囊癌的化疗

新近研究证实自噬是肿瘤的化疗抵抗机制之一。在肿瘤进展过程中，由于血供减少，肿瘤细胞特别是肿瘤内部细胞要在乏氧和营养受限的状况下生存。乏氧和营养缺失均能刺激自噬启动，肿瘤细胞通过自噬改变胞内物质的降解和循环，从而对应激做出适应性反应得以生存[venidaa,pererarm.hostcontroloftumorfeeding:autophagyholdsthekey.cellmetab.2019；29(2):236-238.]。

目前发现在小鼠胚胎成纤维细胞、肝前体细胞、造血细胞及胶质母细胞瘤等细胞中抑制自噬可导致细胞内特定激酶的降解，抑制hr修复过程，增加dna错配修复的发生率[gomeslr,menckcfm,leandrogs.autophagyrolesinthemodulationofdnarepairpathways.intjmolsci.2017；18(11).]。这些发现对自噬缺陷细胞中基因组损伤累积现象提供了新的解释，并为自嗜抑制剂与基因损伤药物联合化疗肿瘤的治疗方案的可行性提供了依据。

parp抑制剂与hr缺陷胆囊癌的化疗

乳腺癌1号和2号基因(breastcancersusceptibilitygene1/2，brca1/2)缺陷的人类乳腺癌细胞不能有效的利用hr介导的修复途径修复dsb。利用hr内在缺陷这一弱点，parp抑制剂(parpi)已成为一类新型有效的抗肿瘤靶向药物。在这种靶向疗法中，单独的hr内在缺陷或单独的parp抑制对癌细胞而言并不致命，但是两者相结合却能选择性杀死癌细胞，因此称之为“合成致死”[lordcj,ashwortha.thednadamageresponseandcancertherapy.nature,2012,481(7381):287-294.]。

研究发现在hr缺陷的肿瘤，包括brca1/2相关的乳腺癌和卵巢癌中，其肿瘤细胞对parpi的敏感性是正常细胞的1000倍，抑制parp的活性可靶向杀伤肿瘤细胞，导致合成致死。而在目前已公开的胆囊癌病人样本dna测序数据中(catalogueofsomaticmutationsincancer(cosmic)：cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic)，发现brca1突变频率约1.47％(68384例样品中存在1005例突变)，brca2突变频率则约2.55％(48241例样品中发现1229例突变)，此外影响胆囊癌细胞hr修复的关键基因还包括rad51b、rad50、fa蛋白家族、blm、atm、atr、chek2、brip1、cdk12、fam175a、palb2等。基于parp结构的药物研究已发现了大量抑制剂，并有多个化合物进入了临床试验[chabanonrm,soriajc,lordcj,postel-vinays.beyonddnarepair:thenovelimmunologicalpotentialofparpinhibitors.molcelloncol.2019；6(2):1585170.]，包括parpi药物olaparib、rucaparib、niraparib等已经过美国fda与欧盟药监局(ema)批准上市，为经过多重治疗的晚期卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌等患者提供一个新的治疗选择。

迄今为止，尚未发现有关判断同源重组缺陷的多分子标志物评估体系，尚未发现有关胆囊癌个体化化疗即cq或parp抑制剂与fam联合给药或是序贯给药的报道。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是基于肿瘤个体化化疗策略，开发一种临床评价hr缺陷的多分子标志物、评估hr缺陷模型及其应用。以hr修复机制作为潜在靶点，依据hr正常或hr缺陷分别从抑制自噬和使用parpi两个方向上提高目前临床上的胆囊癌常规化疗方案fam的化疗效果，降低fam在治疗胆囊癌时的用量，减少其潜在的副作用并降低治疗成本。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种评估hr缺陷模型，所述模型为：

其中，t为评估hr缺陷模型统计值，n为分子标志物个数，m0为基础值，设为0；mn为第n个分子标志物的基因突变值，n为大于1的正整数，若分子标志物存在功能缺失性突变则mn值设为1，未突变的mn值为0。对于不同种类肿瘤细胞，n代表的具体数值与各分子标志物需在细胞水平通过hr报告系统的验证。

进一步，优选n为15(针对胆囊癌细胞)，m1……mn分别为分子标志物brca1、brca2、rad51b、rad50、fanca、fancb、fancg、blm、atm、atr、chek2、brip1、cdk12、fam175a、palb2的基因突变值。

本发明还提供一种所述评估hr缺陷模型在定性判断肿瘤细胞是否存在同源重组缺陷中的应用，所述肿瘤细胞为胆囊癌细胞，更优选为胆囊癌细胞gbc-sd或胆囊癌细胞sgc-996。

进一步，所述的应用方法为：提取待测肿瘤样本进行分子标志物外显子测序，若检测到分子标志物基因序列中存在功能缺失性突变，则其相应m值设为1，未检测到突变，则m值为0，利用所述评估hr缺陷模型，若t>0，则hr缺陷，待测样本对parp抑制类药物敏感，建议使用olaparib与fam联合治疗，以合成致死的方式选择性杀死胆囊癌细胞，提高化疗药物疗效；反之，若t≤0，则hr正常，提示可使用自嗜抑制剂(氯喹或羟基氯喹)联合fam进行治疗，提高化疗药物疗效。

本发明还基于利用自嗜抑制剂(氯喹)预处理可显著降低fam(氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素)药物组合中各单一成分的ic50值，显著增加胆囊癌细胞对其中氟尿嘧啶(5-fu)的敏感性，其作用效果包括增加细胞凋亡率及g0/g1期阻滞等。

进一步，胆囊癌组学测序研究指出hr过程中的15个关键调控基因(见表1)存在相当频率的突变，表明目前可能存在相当部分hr缺陷的胆囊癌病人，该人群对通过抑制自噬下调hr的化疗增敏手段无效果，需寻找可能的新靶点。而该部分人群却正是parpi的靶点，parpi不仅可以促进化疗药物的敏感性，基于合成致死理论还可能对hr缺陷的胆囊癌细胞有明显的靶向致死作用。

具体而言，本发明将测序胆囊癌病人肿瘤标本中15个在hr修复过程中起关键作用的基因(即分子标志物)，通过与野生型基因序列比对查找有无功能缺失性突变。通过将检测结果代入计算模型评估该患者肿瘤中hr修复效率：对判定为hr正常的胆囊癌患者，使用自嗜抑制剂(氯喹或羟基氯喹)抑制fam诱导的肿瘤细胞的自噬，抵消该自噬引起的对fam化疗的拮抗作用，从而显著增强fam对肿瘤的治疗效果。对判定为hr缺陷的胆囊癌患者，则使用olaparib与fam组成的药物复合物、复方药物或序贯使用于治疗该类胆囊癌，以合成致死的方式选择性杀死癌细胞。上述个体化化疗方案在动物实验和细胞实验中均取得了明显的效果。

本发明所述治疗方案中使用的各类药物均为目前临床一线药物，已通过严格的安全毒性测试及临床验证。本发明所述的药物组合中，进一步选自下述的形式进行配置，包括：固体、溶液、分散剂、乳剂、脂质体或包被纳米材料等，其具体形式应根据实际情况择优选取。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明基于肿瘤个体化化疗策略，利用已有的hr相关指标评估胆囊癌细胞内hr是否存在缺陷，依据hr正常或hr缺陷分别以抑制自噬和抑制parp处理，提高化疗方案fam的抗肿瘤疗效，避免了患者多轮高毒性用药后才发现存在抗性的情况的发生。本发明用于检测胆囊癌细胞的多分子标志物仅包含15个基因，易于临床试验检测及减少检测费用；且该多分子标志物不会受到实验的批次效应或检测平台差异的影响；该多分子标志物在使用前不需要进行多样本间的数据标准化处理，使用方便。

本发明进行了细胞实验，实验结果显示，在带有hr报告系统的胆囊癌细胞中利用sirna技术分别沉默brca1、brca2等15个关键调控基因(见图2)后，其hr效率显著下降。相较于fam(氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素)单独处理组，与parpi药物olaparib联合处理后可明显降低brca1/2敲减组胆囊癌细胞的活力，增加凋亡率。另一方面，抑制自噬(氯喹预处理、sirna沉默自噬关键基因)也显著提高了胆囊癌细胞对5-fu的敏感性，胆囊癌细胞的凋亡率及被阻滞在g0/g1期的细胞数均有较大增加，且fam药物组合中各成分的ic50值均有不同程度的降低。该个体化化疗方案的有效性同样在动物实验中得到了证实。

综上，本发明通过设计评价hr缺陷的多分子标志物及方法，创造性提出了以同源重组作为靶点的胆囊癌个体化化疗方案，并证实了该方案对fam的增敏效果。

(四)附图说明

图1是实施例1基于肿瘤个体化化疗策略开发的评估hr缺陷模型的应用技术路线图。

图2hr报告系统的检测原理与计量；a为hr报告系统的基本结构；a1为hr报告系统的工作原理图；a2为转染ev空载体后的gfp阳性细胞率流式细胞图；a2表示转染i-scei表达质粒后的gfp阳性细胞率流式细胞图；a3表示转染gfp表达质粒后的gfp阳性细胞率流式细胞图；b为利用sirna分别敲减15个在hr修复过程中起关键作用基因的western-blot实验检测图；c为分别敲减15个基因后相应的hr效率图。

图3为不同浓度olaparib对gbc-sd-scramble、gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2稳转细胞株(a)、sgc-996-scramble、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2稳转细胞株(b)以及胆囊癌患者p1原代细胞、胆囊癌患者p2原代细胞(c)的活性抑制率曲线。

图4为氟尿嘧啶诱导胆囊癌细胞株发生自噬后细胞检测图，其中：a为5μm5-fu分别处理胆囊癌gbc-sd细胞(a1)和胆囊癌sgc-996细胞(a2)24、48小时，检测自噬标志物lc3-ii、p62表达水平的免疫印迹图；b：荧光图；c：透射电镜图：c1为透射电镜下未处理组胆囊癌sgc-996细胞图；c2为5μm5-fu处理胆囊癌sgc-996细胞24小时后的透射电镜图；c3为5μm5-fu处理胆囊癌sgc-996细胞48小时后的透射电镜图；c4为c2局部放大后的透射电镜图片，可见明显自噬小泡(白色箭头标注)；c5为c3局部放大后的透射电镜图片，可见自噬小泡(白色箭头标注)数量较c3明显增多。

图5为自噬抑制剂氯喹(cq)对氟尿嘧啶(5-fu)抑制胆囊癌细胞的影响。a：cq预处理增强了5-fu对胆囊癌细胞增殖的抑制作用：a1为sgc-996细胞增殖率直方图；a2为gbc-sd细胞增殖率直方图；b：cq预处理促进了5-fu作用下胆囊癌细胞的死亡率：b1为sgc-996细胞死亡率直方图；b2为gbc-sd细胞死亡率直方图。

图6为氯喹、5-fu对胆囊癌细胞的促凋亡和细胞周期的阻滞作用；其中，a：流式细胞仪检测图；b：western印迹图；c：细胞克隆染色图片。

图7为自噬抑制剂cq预处理、rna干扰自噬关键基因atg-5或atg-7表达对fam药物组合的影响。其中，a：定量pcr与western印迹图。b：不同处理下胆囊癌gbc-sd细胞或sgc-996细胞在氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素分别作用48小时的ic50值。

图8为免疫组化分别检测brca1/2蛋白在胆囊癌病人中的表达情况。a：免疫组化检测brca1结果为阳性(a1)和阴性(a2)的典型图片及brca1各表达强度病例数统计(a3)。b：免疫组化学检测brca2结果为阳性(b1)和阴性(b2)的典型图片及brca2各表达强度病例数统计(b3)。

图9为olaparib联合fam对胆囊癌细胞的促凋亡作用；a为胆囊癌细胞活力图，b为流式细胞仪检测图。

图10为hr正常或hr缺陷胆囊癌细胞化疗结果，a为各组小鼠肿瘤组织照片图(其中a-h组每组6例，i-l组每组3例)：(a)皮下接种gbc-sd-scramble稳转细胞株后以fam药物腹腔注射；(b)皮下接种gbc-sd-scramble稳转细胞株后以cq联合fam药物腹腔注射；(c)皮下接种gbc-sd-shbrca1稳转细胞株后以fam药物腹腔注射；(d)皮下接种gbc-sd-shbrca1稳转细胞株后以olaparib联合fam药物腹腔注射；(e)皮下接种sgc-996-scramble稳转细胞株后以fam药物腹腔注射；(f)皮下接种sgc-996-scramble稳转细胞株后以cq联合fam药物腹腔注射；(g)皮下接种sgc-996-shbrca1稳转细胞株后以fam药物腹腔注射；(h)皮下接种sgc-996-shbrca1稳转细胞株后以olaparib联合fam药物腹腔注射；(i)皮下接种gbc-sd细胞后以cq药物腹腔注射；(j)皮下接种gbc-sd细胞后以olaparib药物腹腔注射；(k)皮下接种sgc-996细胞后以cq药物腹腔注射；(l)皮下接种sgc-996细胞后以olaparib药物腹腔注射；其中cq注射剂量为：10mg/kg；fam注射剂量分别为：5-fu(20mg/kg)+阿霉素(5mg/kg)+丝裂霉素(1mg/kg)；olaparib注射剂量为50mg/kg；b为各组小鼠体重的盒须图；c为各组小鼠肿瘤组织重量的盒须图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：评价同源重组缺陷的多分子标志物及hr缺陷模型的构建

1.评估hr缺陷模型中多分子标志物的选择

从数据库catalogueofsomaticmutationsincancer(cosmic，cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic)中获得553例胆囊癌病人样本dna测序数据，将其中突变基因按照突变频率排序，结合目前关于hr修复机制相关分子的研究挑选在其中起关键作用的15个基因(m1-m15)作为以同源重组为靶点的胆囊癌化疗多分子标志物，如表1所示。

表1.判断hr缺陷的多分子标志物组合

2.评估hr缺陷模型中多分子标志物的验证

1)嘌呤霉素(puromycin)浓度选择：

胆囊癌gbc-sd细胞(hr正常)接种至含10％fbs的1640培养基(gibco，商品号：12633012)，置于37℃、5％co2饱和湿度的无菌恒温细胞培养箱内培养(下述常规培养条件均为37℃，5％co2饱和湿度，培养基均为含10％fbs的1640培养基)，正常生长情况下2～3天更换培养基，当细胞密度达到90％左右时进行传代。吸引器吸去旧培养基，沿壁缓慢加入5ml室温pbs洗涤一次。吸去pbs，加入1ml室温胰酶(含0.25％edta)，放入培养箱1-2分钟，取出后轻轻拍打培养皿底，见细胞成片脱离后加入5ml新鲜含10％fbs的1640培养基终止消化。将细胞悬液离心后(800rpm，5min)弃上清，加入新鲜含10％fbs的1640培养基吹散细胞后以4×10⁴/ml密度转入24孔培养板(每孔1ml细胞悬液)内培养，待细胞完全贴壁后，加入嘌呤霉素(浓度分别为0ug/ml、0.25ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml，每个浓度设3个平行孔)。继续观察细胞状态，结果显示当嘌呤霉素浓度大于2ug/ml时，gbc-sd细胞在一周内即全部死亡，而当嘌呤霉素浓度为2ug/ml时，gbc-sd细胞在3天左右时出现死亡细胞，11天时3个平行孔中细胞全部死亡。据此选择2ug/ml作为最终筛选浓度。

2)稳定表达hr报告系统的gbc-hr细胞的构建：转染前20小时，将处于对数生长期的胆囊癌gbc-sd细胞按照4×10⁴/ml接种在24孔培养板中常规培养，至细胞融合度达到80％左右时进行lipofectamine3000转染(thermo，商品号：l3000150)。转染过程均在超净台(thermo，型号：1384cmc)中进行，保持无菌操作，并严格参照lipofectamine^tm3000reagentprotocol使用手册操作，具体过程为：ep管中加入0.5ughr报告系统质粒(构建方法参见文献[pugetn,knowltonm,scullyr.molecularanalysisofsisterchromatidrecombinationinmammaliancells.dnarepair,2005,4(2):149-161.])与1ulp3000，另一ep管中加入1.5ullipofectamine3000(均为试剂盒中提供)，再分别加入25μlopti-mem(thermo，商品号：31985070)，将两管置一起混匀后静置15min。将上述混合液(约53ul体积)加入于24孔板中常规培养的gbc-sd细胞，转染6-8小时后更换为1ml含2ug/ml嘌呤霉素的新鲜的含10％fbs的1640培养基。加压筛选4-5周至有明显成团细胞形成。消化下成团细胞并使用含1ug/ml嘌呤霉素的含10％fbs的1640培养基于6孔板中常规培养，大量扩增抗性细胞。待获得足够多的克隆细胞后，取部分细胞以快速dna提取试剂盒(quickdnaextractionkit，江苏康为世纪生物科技有限公司，商品号：cw3011)提取基因组dna后以pcr法扩增检测gfp，选择电泳结果在约566bp左右位置处呈明显条带(表明hr报告系统质粒已成功整合至该细胞的基因组)的细胞株，并将其命名为gbc-hr细胞。

表2.检测gbc-hr细胞的引物

表3.pcr反应液配制(南京诺唯赞生物科技有限公司，商品号：p112-01)

表4.pcr反应条件

3)检测gbc-hr的gfp阳性率：分别将处于对数生长期的gbc-hr细胞以4×10⁴/孔接种在24孔培养板中常规培养，参照手册使用lipofectamine3000转染，并如图2中a所示，分别设置ev组(空载体，转染pcdna3质粒)、i-scei组(转染pbad-i-scei质粒)、gfp组(转染pcdna3-gfp质粒)，上述质粒均购自addgene，商品号依次为：plasmid#52535；plasmid#60960；plasmid#74165。转染6-8小时后更换新鲜培养基，继续培养72小时后以胰蛋白酶+edta(gibco，商品号：25200-056)分别消化并收集细胞，pbs洗涤后分别取1×10⁵细胞加入流式管中，后于流式细胞仪检测分析gfp阳性细胞率(激发光：395-495nm；发射光：509nm)并依次记录数值x1(ev组)、x2(i-scei组)、x3(gfp组)。最终得到的胆囊癌细胞同源重组水平以r-hr(relativehr)表示，其计算公式为r-hr＝(x2-x1)/(x3-x1)。

如图2中a所示，其中，a1为hr报告系统的工作原理：该系统包含两个gfp基因，第一个是不完整的gfp基因(trgfp)，因此它不能发光。第二个是完整的gfp，但是在中间插入了一个i-scei酶切位点(i-sceigfp)，因此也不能发光。正常情况下，细胞不会发光。当细胞内表达i-scei内切酶时，会在第二个gfp中产生一个双链断裂，在细胞分裂过程中，该断裂的gfp基因能够寻找到姐妹染色单体上同源的第一个gfp来进行同源修复，形成完整的gfp，从而使得细胞发光。a3表示转染i-scei后有0.85％的细胞通过正确同源重组产生了绿色荧光，a2表示转染ev空载体时有0.01％的细胞产生了绿色荧光(可以看作hr报告系统的本底值)，a4表示转染gfp表达质粒后发出绿色荧光的细胞比例(即在相同转染条件下，本组实验转染成功的细胞比例为42.59％)。

4)分别敲减hr过程中15个关键基因验证评估hr缺陷模型

针对表1中15个基因设计合成sirna(委托广州锐博生物有限公司完成)并按照表5所示设立各实验组(i-scei+nc组、i-scei+sirna组、gfp+nc组、gfp+sirna组、ev+nc组和ev+sirna组)进行sirna转染。分别将处于对数生长期的gbc-hr细胞以1×10⁵/孔接种在6孔培养板中常规培养，参照手册使用lipofectamine3000转染：即在ep管中加入表5所示的质粒与sirna，另一ep管中加入7.5ullipofectamine3000，再分别加入125μlopti-mem(thermo，商品号：31985070)，将两管一起混匀后静置15min(待转染细胞也更换培养基为opti-mem)。将上述混合液(约265ul体积)加入于6孔板中常规培养的gbc-sd细胞(培养于2ml含10％fbs的1640培养基)，转染6-8小时后更换为新鲜的含10％fbs的1640培养基，继续培养72小时后以胰蛋白酶+edta(gibco，商品号：25200-056)分别消化并收集细胞，pbs洗涤后分别取1×10⁵细胞加入流式管于流式细胞仪检测分析gfp阳性细胞率并依次记录数值y1(i-scei+nc组)、y2(i-scei+sirna组)、y3(gfp+nc组)、y4(gfp+sirna组)、y5(ev+nc组)、y6(ev+sirna组)。在ev+nc组和ev+sirna组剩余的细胞中分别加入300ul含1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液裂解细胞，使用bca试剂盒(美国thermo公司，商品号：23225)进行总蛋白定量行免疫印迹实验。每孔上样量为30ug总蛋白，进行蛋白电泳后转膜至pvdf膜上，用5％脱脂牛奶封闭1小时，分别加入上述15个基因的一抗抗体和gapdh或β-actin内参抗体，于4℃孵育12小时。tbst洗膜后加入二抗室温孵育1.5小时，用ecl显色液显色并于曝光显像系统下拍照并分析蛋白条带。

表5.以hr报告系统验证15个关键基因对胆囊癌细胞同源重组水平的影响

*：m-sirna分别表示针对表1中所列15个基因所设计的sirna；nc-sirna表示设计合成sirna时提供的阴性对照sirna。表5中质粒pbad-i-scei、pcdna3-gfp、pcdna3均购自addgene，商品号依次为：plasmid#60960；plasmid#74165；plasmid#52535。

如图2中b所示，利用sirna分别敲减15个在hr修复过程中起关键作用的基因，以western-blot实验检测相应蛋白的表达量变化，western-blot实验结果显示brca1-sirna、brca2-sirna、rad51b-sirna、rad50-sirna、fanca-sirna、fancb-sirna、fancg-sirna、blm-sirna、atm-sirna、atr-sirna、chek2-sirna、brip1-sirna、cdk12-sirna、fam175a-sirna、palb2-sirna均可有效干扰相应目的基因的表达。

图2中c为hr效率，其计算方法如下：将i-scei组减去相对应的空载体(ev)组得到相对hr效率，除以相对应的gfp转染组，得到对应的hr效率。将表5中的i-scei+nc组y1值减去相对应的ev+nc组y5值(y1-y5)除以本组实验转染效率(y3-y5)后的数值标化为100％，15个sirna敲减基因组的hr效率计算方法如下：将i-scei+sirna组y2值减去相对应的ev+sirna组y6值(y2-y6)再除以相对应的gfp+sirna组y4值减去相对应的ev+sirna组y6值，得到对应的hr效率为(y2-y6)/(y4-y6)。最后得到r-hr＝((y2-y6)/(y4-y6))/((y1-y5)/(y3-y5))。每组实验数据至少重复3遍，计量数据用均数±标准差表示。结果显示转染brca1-sirna组、brca2-sirna组、rad51b-sirna组、rad50-sirna组、fanca-sirna组、fancb-sirna组、fancg-sirna组、blm-sirna组、atm-sirna组、atr-sirna组、chek2-sirna组、brip1-sirna组、cdk12-sirna组、fam175a-sirna组、palb2-sirna组对比转染对照组(nc-sirna)的hr效率均有显著性下降(p<0.05)。

分别敲减表1中hr过程中15个关键基因可显著性降低r-hr数值，表明该hr报告系统有效且有较高灵敏度，亦表明选取上述多分子标志物的缺失与同源重组缺陷存在强相关性，该评估hr缺陷模型具可行性。

3.评估hr缺陷模型的建立

在征得患者同意后术中收集胆囊癌病人的肿瘤样本并对表1中15个基因的外显子进行测序，根据测序结果判定有无功能缺失性突变(即基因缺失、移码突变和剪切位点突变导致的基因的失活)，通过上述方法将这15个基因的失活指数(有或无)进行整合，建立定性判断胆囊癌hr缺陷的模型，在该模型中基础值为m0＝0，测序检测到任意一个基因存在功能缺失性突变则将其相应的mn值设为1。

评估hr缺陷模型：

其中，t为hr缺陷模型统计值，n为分子标志物个数，m0为基础值，设为0；mn为第n个分子标志物的基因突变值，n为15，若分子标志物存在功能缺失性突变则mn值设为1，未突变的mn值为0。

m1……mn分别为分子标志物brca1、brca2、rad51b、rad50、fanca、fancb、fancg、blm、atm、atr、chek2、brip1、cdk12、fam175a、palb2的基因突变值(以上描述仅代表本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于表格中的15个基因，在后续科学研究中新的被报道并验证在hr修复途径中起重要作用的基因也将纳入表1中，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围)。

见图1，依据hr正常或hr缺陷分别从抑制自噬和使用parpi两个方向上提高目前临床上的胆囊癌常规化疗方案fam的化疗效果。对于hr缺陷模型以0作为分界值，将病人分为hr缺陷和hr正常。若t>0，揭示hr缺陷，对parp抑制类药物敏感，建议使用奥拉帕尼(olaparib)与fam(氟尿嘧啶+阿霉素+丝裂霉素)联合治疗，以合成致死的方式选择性杀死胆囊癌细胞。反之，若t≤0，hr正常，则提示可使用自嗜抑制剂(氯喹或羟基氯喹)联合fam进行治疗。

实施例2：分离培养胆囊癌原代细胞并验证评估hr缺陷模型的准确性

1.构建稳定敲减brca1、brca2的胆囊癌gbc-sd和sgc-996细胞株

(1)慢病毒预感染实验

按照3-5×10³/孔(含10％fbs的1640培养基，体积100μl)在96孔培养板孔内分别预接种胆囊癌细胞gbc-sd和胆囊癌细胞sgc-996，慢病毒感染时细胞融合度应在30％-50％左右。将10μl病毒液(brca1、brca2慢病毒颗粒均委托上海吉凯生物有限公司制作包被)按照终浓度1×10⁶tu/ml、1×10⁵tu/ml、1×10⁴tu/ml3个浓度预感染细胞。如当前胆囊癌细胞数约为1×10⁴个，则上述三个孔的moi约为100、10、1。37℃培养12小时左右更换含10％fbs的1640培养基，37℃培养3天后，荧光显微镜下观察发现在moi＝10及moi＝100的孔中约90％以上细胞表达gfp荧光，故确认理想的moi值为10。

(2)慢病毒感染实验

分别将待感染的胆囊癌细胞gbc-sd和胆囊癌细胞sgc-996接种到6孔培养板中(含10％fbs的1640培养基，体积2ml)，细胞融合度控制在30％左右。因步骤(1)慢病毒预感染实验中理想的moi值为10，故分别加入20μl1×10⁸tu/ml浓度的病毒液(brca1、brca2慢病毒颗粒均委托上海吉凯生物有限公司制作包被)。37℃培养12小时左右，更换培养基，获得转染慢病毒后的胆囊癌细胞。

(3)构建稳定转染细胞株实验

以2ug/ml嘌呤霉素分别处理步骤(2)转染慢病毒后的胆囊癌细胞gbc-sd和胆囊癌细胞sgc-996各自7天，生存下来的细胞即可认为是稳定转染的胆囊癌细胞株，依次将其命名为gbc-sd-scramble、gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2、sgc-996-scramble、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2。

选上述对数生长期的细胞株gbc-sd-scramble(对照)、gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2、sgc-996-scramble(对照)、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2，以2×10⁴/ml密度(含10％fbs的1640培养基，体积100μl)转入96孔板内37℃培养过夜，待细胞贴壁充分后，加入终浓度为0.01-10000nm的olaparib，37℃培养96小时后，以celltiter-glo试剂盒(promega，商品号：pr-g7570)检测细胞活力。结果如图2所示，olaparib对brca1/2敲减的胆囊癌稳转细胞株活性的抑制作用具有良好的剂量依赖性，但对scramble组胆囊癌细胞的生长则无影响。

2.取术中胆囊癌病人的肿瘤组织，行胶原酶消化法获得胆囊癌原代细胞

胶原酶消化法的操作过程如下所述：

(1)将术中留取的胆囊癌组织浸泡于50mlpbs(含1％青霉素/链霉素)中转移至超净台操作。

(2)去掉坏死的组织及动脉、静脉血管，以新的50mlpbs(含1％青霉素/链霉素)浸泡洗涤两次后使用消毒后的手术刀将肿瘤组织切成1mm³左右小块，将组织块置于含300单位/mliv型胶原酶及1％青霉素/链霉素的pbs中消化1小时，收集上部酶液并使用10mlpbs反复冲洗下部肿瘤组织，静置1分钟后再次收集上部细胞悬液。将上述两次收集到的细胞悬液混合后离心(800rpm，5分钟)，弃上清，以dmem/f12+10％fbs(gibco，商品号：12400-024)培养基重悬，200目滤网过滤，细胞计数后以2×10⁵/ml密度共5ml细胞悬液接种于预先使用1％明胶包被的t25培养瓶。每周换液2次并观察贴壁细胞生长，获得胆囊癌原代细胞。

3.检测评估hr缺陷模型的准确性

收集状态良好的胆囊癌原代细胞以1×10⁵/孔传代至6孔板(corning，商品号：3516)，分别选取在实施例1预测模型中判定hr正常(t＝0)的患者p1及hr缺陷(t＝0.13)的患者p2所分离的原代细胞p1和p2，依次加入终浓度为0.01-10000nm的olaparib，37℃培养96小时后以celltiter-glo试剂盒(promega，商品号：pr-g7570)检测细胞活力。对比稳定敲减brca1/2的胆囊癌细胞株gbc-sd、sgc-996(图3中a和b)，判定hr缺陷模型的有效性，如图3中c所示胆囊癌原代细胞p2(t＝0.13)较p1(t＝0)在不同浓度olaparib作用下的细胞活性曲线更接近brca1/2稳定敲减(shbrca1、shbrca12)胆囊癌细胞株，与hr缺陷模型预测的结果相符。

实施例3：自嗜抑制剂氯喹显著增强fam对hr正常的胆囊癌细胞的杀伤作用

1.配置氯喹：

取适量氯喹(sigma，商品号：c6628)溶于双蒸水配成10mm的储存液，用0.22μm滤器过滤除菌后保存于4℃，体外细胞实验用1640培养基稀释至100μm进行实验。体内动物实验则按照10mm浓度下31.25ul/10g标准腹腔注射。

本实施例所用胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996经实施例1所述hr缺陷模型判定t值均为0，即hr正常。

2.5-fu处理诱导胆囊癌细胞产生自噬：

(1)胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996以5μm5-fu分别处理24、48小时后使用pbs小心清洗，加入300ul含1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液裂解细胞，使用bca试剂盒进行总蛋白定量并将各蛋白样品以ripa裂解液统一调整至2ug/ul。按照比例加入5x蛋白上样缓冲液，经过震荡混匀后，100℃加热变性10min，12000rpm离心1分钟后置于冰上备用。

免疫印迹实验中每孔加入混合了5x蛋白上样缓冲液的蛋白样品，上样量为30ug，进行蛋白电泳后转膜至pvdf膜上，用5％脱脂牛奶封闭1小时，分别加入lc3b、p62和gapdh抗体，于4℃孵育12小时。tbst洗膜后加入二抗室温孵育1.5小时，用ecl显色液显色并于曝光显像系统下拍照并分析蛋白条带。如图4中a所示，免疫印迹结果显示5-fu处理可增强胆囊癌细胞中lc3-ii表达水平，下调p62表达水平，其中lc3-ii、p62均为自噬特异性标志物。

(2)胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996用gfp-lc3质粒按lipofectamine3000转染试剂盒的操作说明进行转染后，再用5μm5-fu处理48小时，使用pbs小心清洗后以3.7％多聚甲醛固定15分钟。再次使用pbs小心清洗后加入细胞核染色试剂dapi染料并于倒置荧光显微镜下观察。如图4中b所示，5-fu处理后胆囊癌细胞中代表自噬小泡的点状荧光数量明显增多；而空白处理组(不添加5-fu)的荧光却呈弥散状，无明显的点状出现。

(3)将步骤(1)中5μm5-fu分别处理24、48小时后收集到的胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996使用pbs小心清洗后以2.5％戊二醛4℃固定过夜。次日1.5％锇酸固定后，分别经过50％、70％、90％、100％乙醇、100％丙酮脱水，包埋切片后依次以4％醋酸铀及枸杞酸铅染色。切片于80kv电镜下观察。如图4中c所示，透射电镜检测结果显示对比空白处理组(c1)，5-fu处理后胆囊癌细胞sgc-996中自噬小泡数量明显增多(c2-c5)。

3.氯喹能显著增强氟尿嘧啶诱导的胆囊癌细胞死亡

将常规培养的胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996分别分为下列处理组：空白对照组(不做任何处理)；100μm氯喹(cq)处理12h后正常培养组(细胞培养于含终浓度100μmcq的含10％fbs的1640培养基12小时后再替换为含10％fbs的1640培养基)；5μm5-氟尿嘧啶(5-fu)处理组(含终浓度5μm5-fu+10％fbs的1640培养基)；使用100μmcq预处理胆囊癌细胞12h后再以5μm5-fu处理组(含终浓度100μmcq+10％fbs的1640培养基12小时后再替换为含终浓度5μm5-fu+10％fbs的1640培养基)。连续培养48小时后，经过cck-8法检测细胞增殖率，台盼蓝染色计数阳性细胞计算细胞死亡率。结果如图5所示，使用100μmcq预处理胆囊癌细胞12h后，5μm浓度下5-fu对gbc-sd和sgc-996细胞增殖的抑制率约增加了50％。同样的，对比cq或5-fu单独处理组，台盼蓝染色计数结果显示cq预处理可显著增加5-fu处理下胆囊癌gbc-sd细胞的死亡率。

4.氯喹可增强5-fu对胆囊癌细胞的促凋亡和细胞周期的阻滞作用

此部分实验设计同步骤3，即均采用空白对照组；100μmcq处理12h后正常培养组；5μm5-fu处理48h组；使用100μmcq预处理胆囊癌细胞12h后再以5μm5-fu处理48h组。步骤(1)-(3)中实验均采用上述分组处理细胞。

(1)取1×10⁵胰酶(不含edta)消化后收集到的各组胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996，使用annexinv-fitc/pi试剂盒(联科生物，商品号：70-ap101-60)处理后，利用流式细胞仪检测各孔胆囊癌细胞凋亡率。如图6中a所示，通过流式细胞仪检测发现，cq预处理12h后，5-fu诱导胆囊癌细胞的凋亡率分别由34.3％(gbc-sd)、20.6％(sgc-996)上升至46.2％(gbc-sd)、43.4％(sgc-996)。

(2)选对数生长期的各组胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996，以1×10⁵/ml密度转入6孔板内常规培养过夜，待细胞贴壁充分后，以上述分组处理细胞。培养48小时后采用ripa裂解液裂解细胞并提取细胞全蛋白组，行western-blot检测。结果如图6中b所示，免疫印迹检测凋亡标志物活化parp蛋白显示，cq预处理后再以5-fu处理组较5-fu单独处理组的活化parp蛋白(cleavedparp)相对表达量存在显著性差异。

(3)将步骤(1)消化下的胆囊癌细胞gbc-sd和sgc-996分别按500个/孔的密度接种于35mm小皿。常规培养24小时后以步骤(1)分组处理细胞48小时。吸去孔内培养液后使用pbs小心清洗后常规培养细胞13天。之后以3.7％多聚甲醛固定15分钟并使用结晶紫染色，显微镜下观察计数(含50个细胞及以上的克隆)。结果如图6中c所示，在13天时空白对照组、cq预处理组和5-fu单独处理组中大部分胆囊癌细胞形成克隆，但在cq预处理后再以5-fu处理组中细胞克隆数较其他各组明显减少。

5.抑制自噬可显著降低fam药物组合中各单一成分的ic50值

(1)atg5、atg7基因敲减细胞的制备

通过引入sirna基因沉默技术沉默自噬过程中的关键基因(atg5、atg7)，比较处理前后胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞对化疗药物的敏感性。靶向atg5、atg7的各sirna-1、sirna-2以及对照sirna均委托广州锐博生物有限公司设计合成。

将sirna-1、sirna-2和二者1:1混合后的sirna-mix以及对照sirna按rnaimax转染试剂盒(美国thermo公司，商品号：13778030)的操作说明分别转染胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞。转染后常规培养72小时，收集各组细胞(分别获得胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞各自的atg5、atg7基因敲减细胞)行免疫印迹实验(方法同实施例3，步骤2(1)所述)检测atg5与atg7的蛋白水平。结果如图7中a显示，研究设计的atg5-sirna与atg7-sirna均可有效的抑制atg5、atg7蛋白表达。

(2)各组药物的ic50值

检测并计算药物ic50值前的预处理如下分组：

对照组(control)：胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞分别在含10％fbs的1640培养基常规培养12h；

cq预处理12h组(cqpre-treatment)组：含终浓度100μmcq+10％fbs的1640培养基12小时后再替换为含10％fbs的1640培养基常规培养12h；

atg5(atg-5sirna)基因沉默组：atg5基因缺失的胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞分别在含10％fbs的1640培养基常规培养12h；

atg7(atg-7sirna)基因沉默组：atg7基因缺失的胆囊癌gbc-sd、sgc-996细胞分别在含10％fbs的1640培养基常规培养12h。

选取上述各组对数生长期的胆囊癌细胞，以0.3×10⁴/ml密度转入96孔板内常规培养过夜，待细胞贴壁充分后，分别加入不同浓度的5-fu(1、10、25、50、100、150、200μm)、阿霉素(doxorubicin，0.25、0.5、1、1.5、2μm)、丝裂霉素(mitomycin，0.25、0.5、1、1.5、2μm)后培养48小时，以cck-8法检测细胞相对数量并依次计算各组药物的ic50值。如图7中b所示，相比对照组(control)，cq预处理12h组(cqpre-treatment)或atg5(atg-5sirna)、atg7(atg-7sirna)基因沉默组中胆囊癌细胞对fam各类药物(5-fluorouracil、doxorubicin、mitomycin)的耐受明显降低，其ic50值均有显著下降(5-fu的ic50值下降了80％以上；阿霉素的ic50值约下降了10％左右；丝裂霉素的ic50值约下降了40％)。

实施例4：parp抑制剂olaparib显著增强fam对hr缺陷的胆囊癌细胞的杀伤作用

1.配置olaparib

olaparib(selleck，商品号：s1060)溶于dmso中配成150mm的储存液，使用1640培养基稀释后进行细胞实验。动物实验使用4％dmso+30％peg300+双蒸水配置成5mg/ml溶液，按照小鼠体重以100ul/10g剂量行腹腔注射。

本实施例所用胆囊癌稳转细胞株gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2(实施例2步骤1(3)所构建)分别利用shrna技术敲减了目的基因，经分析软件imagej(美国nationalinstitutesofhealth(nih)免费提供)分析图2中b中蛋白条带灰度值并经内参gapdh标化后发现相对于对照组敲减效率在90％以上(即brca1及brca2蛋白表达量下降了90％以上)，成功模拟了实施例1所述hr缺陷模型判定t值大于零(即存在hr缺陷)的情况。

2.免疫组化检测胆囊癌病人标本中brca1及brca2的表达量

通过向病理科调取110例胆囊癌病人的肿瘤标本，行免疫组化，分别检测其中brca1及brca2的表达量。免疫组化评分依据国际通用的germanimmunoreactivescore系统完成。着色评分经由不知样本临床特征的两位病理科医生给予评分，根据石蜡切片的染色范围以及染色强度评估结果(每张石蜡切片都至少随机观察5个高倍视野)。染色强度：无色或仅细胞核蓝色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕揭色为3分。整张石蜡切片染色面积：小于5％为0分；5-25％之间为1分；25％-50％之间为2分；50％-75％之间为3分；大于75％为4分。将染色强度和染色面积分数相乘得出最终结果：小于等于5分为阴性表达，大于等于6分为阳性表达。结果如图8所示，brca1及brca2低表达组患者分别占总患者人数的28.18％及36.36％，这一比例远高于在cosmic数据库中查询得到的二者基因的突变频率(1.47％及2.55％)，表明胆囊癌患者中可能存在相当一部分潜在的hr缺陷人群对parpi药物显著敏感。

3.olaparib能增强fam对胆囊癌细胞的杀伤作用

(1)将olaparib的终浓度设置为1nm(据图3可知此浓度下brca1/2敲减组细胞的活力较对照组无明显降低)，单独以fam(其中5-fu终浓度为25ug/ml；阿霉素终浓度为1ug/ml；丝裂霉素终浓度为0.5ug/ml)或联合1nmolaparib作用实施例2步骤1(3)所构建的gbc-sd-scramble和sgc-996-scramble稳定转染细胞株，以0.1nm或1nmolaparib联合fam作用gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2稳定转染细胞株48小时，以celltiter-glo试剂盒检测细胞活力。如图9中a所示，1nmolaparib对fam作用下brca1或brca2敲减组胆囊癌细胞的增敏效果非常明显(细胞活力下降了约40％)，但在scramble组中则无此现象。

(2)同步骤(1)，以0.1nmolaparib单独或联合fam处理gbc-sd-scramble、sgc-996-scramble细胞及0.1nmolaparib联合fam处理gbc-sd-shbrca1、gbc-sd-shbrca2、sgc-996-shbrca1、sgc-996-shbrca2稳定转染细胞株48小时，以不含edta的胰酶消化后取1×10⁵细胞，使用annexinv-fitc/pi试剂盒处理后，利用流式细胞仪检测各孔胆囊癌细胞凋亡率。结果如图9中b所示，相对于scramble组，brca1或brca2敲减组胆囊癌细胞在0.1nmoraparib联合fam处理下细胞的凋亡率存在不同程度的显著上升。

实施例5：动物实验验证胆囊癌个体化fam化疗策略的有效性

消化收集80-90％融合度状态良好的scramble组及brca1稳定敲减组胆囊癌细胞(实施例2步骤1(3)所构建的gbc-sd-scramble、gbc-sd-shbrca1、sgc-996-scramble、sgc-996-shbrca1稳定转染细胞株)，无血清1640培养基重悬，细胞量调整至5×10⁷个细胞/100μl，置于冰上备用。

将48只4-6周龄的雄性裸鼠随机分成实验组(预接种gbc-sd-shbrca1或sgc-996-shbrca1细胞)和对照组(预接种gbc-sd-scramble或sgc-996-scramble细胞)：(a)皮下接种gbc-sd-scramble细胞后以fam药物腹腔注射；(b)皮下接种gbc-sd-scramble细胞后以cq联合fam药物腹腔注射；(c)皮下接种gbc-sd-shbrca1细胞后以fam药物腹腔注射；(d)皮下接种gbc-sd-shbrca1细胞后以oraparib联合fam药物腹腔注射；(e)皮下接种sgc-996-scramble细胞后以fam药物腹腔注射；(f)皮下接种sgc-996-scramble细胞后以cq联合fam药物腹腔注射；(g)皮下接种sgc-996-shbrca1细胞后以fam药物腹腔注射；(h)皮下接种sgc-996-shbrca1细胞后以oraparib联合fam药物腹腔注射。将12只4-6周龄的雄性裸鼠随机分成以下各对照组：(i)皮下接种gbc-sd细胞后以cq药物腹腔注射；(j)皮下接种gbc-sd细胞后以oraparib药物腹腔注射；(k)皮下接种sgc-996细胞后以cq药物腹腔注射；(l)皮下接种sgc-996细胞后以oraparib药物腹腔注射。

左手抓取固定小鼠，使用0.1ml胰岛素注射器平行刺入小鼠腋下，皮下接种100ul细胞悬液(可见一圆形皮丘)。缓慢旋转拔出注射器，将小鼠放回笼内继续饲养。每隔一周用游标卡尺测量肿瘤的长(l，mm)、短径(w，mm)，并记录。裸鼠皮下成瘤体积计算公式为v＝(l×w²)/2。待成瘤体积至80-100mm³左右(约2-3周)时，按上述分组处理，其中cq注射剂量为：10mg/kg；fam注射剂量分别为：5-fu(20mg/kg)+阿霉素(5mg/kg)+丝裂霉素(1mg/kg)；oraparib注射剂量为50mg/kg；注射方式为每周三次，持续两周。于处死前将裸鼠称重(图10中b)，颈椎脱臼法处死全部裸鼠后再取出肿块(图10中a)并以电子天平称重(图10中c)，依次记录各数值并拍照。

如图10所示，结果显示cq联合fam药物组和oraparib联合fam药物组的荷瘤小鼠肿块重量明显小于fam单独处理组裸鼠皮下移植的肿块，且有显著性差异。各组间小鼠的体重则无统计学差异。