一种大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型及应用的制作方法

本发明属于动物实验模型技术领域，尤其涉及一种大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型及应用。

背景技术：

椎间盘退变(ivdd)被认为是一种全球健康威胁，是腰痛中最重要的病因之一。椎间盘退变是由遗传易感性，环境，吸烟，衰老，生物化学和生物力学因素等多种因素引起的疾病，其中椎间盘细胞营养的减少被认为是椎间盘退变的最终共同途径。许多研究表明，终板对于椎间盘营养供应至关重要，由于正常情况下椎间盘无血液供应，大多数营养物质通过软骨终板扩散以滋养椎间盘，终板的退化不仅阻断了椎间盘的营养，而且还可通过氧化应激等途径启动ivdd。cep是600-1000μm的透明样软骨层，将椎间盘与相邻的椎骨终板分开，主要由ii型胶原蛋白，蛋白多糖和水组成，cep的作用是传递压缩载荷，包含并加压髓核，并将水，营养物和废物输入和输出椎间盘。尽管人类软骨终板(cep)在椎间盘发挥正常功能中起到关键作用，但对其结构和机械特性及其随变性后引起的椎间盘退变研究较少。在临床上，统计发现椎间盘两侧的软骨终板炎更易导致椎间盘退变，因此如果要在生物学科研领域要研究软骨终板炎及退变与椎间盘退变之间的关系，需构建稳定的大鼠软骨终板炎及退变模型。

目前，最接近的现有技术：已有其他团队发明的针刺椎间盘和垂直加压模型建立椎间盘退变模型，可以有一定的诱导椎间盘退变的效果，但是效果较差，如针刺模型和垂直加压模型诱导椎间盘退变的成功率较低，且外固定架垂直加压模型易导致大鼠尾椎骨坏死，本方案通过诱导软骨终板炎症状态、阻断营养供应、正压力及正磁场加快细胞衰老原理，诱发椎间盘退变模型稳定，成功率高，用时短，2周产生明显的椎间盘退变，模拟多种因素导致软骨终板炎引起椎间盘髓核退变的病理过程，更符合人体ivdd病理变化过程。现阶段，软骨终板炎模型没有明确的造模方法，针刺和外固定架加压造大鼠椎间盘退变(ivdd)模型效率低，动物模型还未被建造。本发明通过磁铁和磁环加压、阻断骨髓腔营养、诱发终板炎症及正磁场诱导细胞衰老等机理，建造大鼠软骨终板炎及椎间盘退变模型，为临床研究终板炎与ivdd关系提供动物模型。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术模拟软骨终板炎及软骨终板退变导致椎间盘退变，纤维环抗性减弱，易发生紊乱、断裂，髓核细胞加速凋亡，软骨终板及纤维化内的干细胞迁移补充减少，都易导致髓核组织及附近纤维环向外突出，压迫神经，引起腰背部疼痛。

(2)现阶段，软骨终板炎模型没有明确的造模方法，动物模型还未被建造，针刺和外固定架加压造大鼠椎间盘退变(ivdd)模型效率低。

解决上述技术问题的难度：实验难度较大，要求实验者较高的手术技术水平，如果磁铁和骨髓腔大小不匹配，还需对椎骨进行一定的修切；与针刺模型相比较为复杂，而且与外固定架垂直加压模型相比，磁铁产生的压力相对较小；大鼠尾椎有一定的直径要求，如果过细，无法进行操作；合适大小的强磁铁力磁铁和磁环购买不方便。

解决上述技术问题的意义：

(1)多种理念方法结合，进行软骨、纤维化及髓核退变造模；

(2)模拟人软骨终板炎引起椎间盘髓核退变的病理过程；

(3)运用阻断营养供应、产生炎症、正压力及正磁场加快细胞衰老原理，构建椎间盘退变模型稳定，用时短，2周产生明显的椎间盘退变。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型及应用。

本发明是这样实现的，一种大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型，所述模型的构建方法包括以下步骤：

步骤一，对大鼠尾皮肤切开，暴露椎骨后对椎骨开窗，将骨髓腔内骨髓清除并对干骺端骨髓腔进行破坏。

步骤二，将小磁铁放入骨髓腔产生压力和阻断软骨终板的营养供应，缝合皮肤，待水肿消退后，对大鼠尾部皮肤外套一定长度的磁环，磁环两侧胶带固定。

步骤三，在套筒尾端的下面大鼠尾巴上缠多层胶带，达到一定厚度防止套筒滑落。

进一步，步骤一中，根据不同大鼠的尾椎骨直径情况，需对骨髓腔进行一定的处理，以便放入磁铁。

进一步，步骤二中，所述磁环内径稍大于与大鼠尾部直径，与椎骨内磁铁相互吸引增大对两小磁铁间的椎间盘压力，产生压力扩大效应及正磁场作用。

进一步，所述磁环外面的套筒由15ml离心管制成，内径略大于磁环外径，套筒尾端被切开，切口直径大小刚好将尾巴放入。

进一步，所述大鼠靠近尾跟部椎骨外直径为5-6mm，内直径3mm，长度为9-10mm，两椎骨之间的椎间盘厚度3mm。

进一步，所述超强磁铁e直径2.5mm，长度4mm，两磁铁距离5mm时，产生吸力约为11g，距离6mm时产生吸引力为8g。

进一步，所述磁环外f径16mm，内径11mm，厚度3mm，3-4个磁环形成磁筒套在大鼠尾巴外面，磁筒与两侧的磁铁有一定的重叠，磁筒对磁铁产生的压力为51g。

本发明的另一目的在于提供一种所述大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型在软骨终板炎模拟中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型在软骨退变中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型在软骨终板退变后中的应用。

应用原理：(1)骨髓腔内放入磁铁，使软骨终板持续产生炎症状态，软骨终板的炎症可以明显促进椎间盘退变，加重髓核细胞衰老和凋亡。

(2)放入磁铁及捣毁干骺端明显阻断骨髓腔通过软骨终板对椎间盘内营养供应。

(3)小磁铁产生基础压力与大磁铁产生的放大压力模拟人体椎间盘退变过程中持续压力作用。

(4)文章报知，正磁场可以加速细胞衰老和凋亡，我们也通过小磁铁和大磁环构建正磁场状态，加速软骨细胞、纤维化细胞和髓核细胞衰老和凋。

(5)人体椎间盘退变不是单一因素导致的，我们模拟多种因素作用在椎间盘，符合人体病理变化过程。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明对大鼠尾椎处理：打开椎间盘两侧的椎骨，破坏骨髓腔并捣毁干骺端，阻断血液供应。放入大小适合的磁铁，产生一定压力挤压椎间盘，然后缝合皮肤，为防止大鼠咬伤口，对尾部套一个套筒，套筒是由15ml的离心管改造的。一个星期左右大鼠伤口皮肤水肿消退，加入大的磁环，主要作用是与内部磁铁配合产生更大的压力。

本发明使用新的方法造软骨退变模型；软骨终板和椎体长期受压情况下，骨改建异常引起的软骨下骨硬化严重降低了软骨下骨应力吸收和对椎间盘保护功能的能力，最终导致局部炎性因子增加，阻碍了椎间盘的营养途径，增强了椎间盘退变。椎间盘在长期受压和营养阻断情况下，纤维化抗性减弱，易发生紊乱、断裂，髓核细胞加速凋亡，软骨终板及纤维化内的干细胞迁移补充减少，都易导致髓核组织及附近纤维环向外突出，压迫神经，引起腰背部疼痛。未对软骨及椎间盘做处理；用时较短，2周左右可以产生明显明显的椎间盘退变；可以模拟临床病人软骨终板退变更易引起椎间盘髓核退变的病理过程；阻断营养供应，压力作用，正磁场可加快细胞衰老退变作用。

附图说明

图1和图2是本发明实施例提供的大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型的关键方法流程图。

如图3所示，本发明实施例提供的磁铁诱导大鼠软骨终板炎及纤维环及髓核退变示意图。

图4是本发明实施例提供的正常软骨终板中炎症因子il-6表达水平示意图；

图中：(a)100*；(b)200*。

图5是本发明实施例提供的针刺模型中软骨终板中炎症因子il-6表达水平示意图；

图中：(a)100*；(b)200*。

图6是本发明实施例提供的磁铁处软骨终板中炎症因子il-6表达水平示意图；

图中：(a)100*；(b)200*。

图7是本发明实施例提供的2周、4周和6周针刺处理椎间盘后软骨终板、纤维环及髓核衰老蛋白标志物p16表达水平组化图。图(a)、图(b)分别为处理2周后100倍和200倍放大倍数下的组化图，图(c)、图(d)分别为处理4周后100倍和200倍放大倍数下的组化图，图(e)、图(f)分别为处理6周后100倍和200倍放大倍数下的组化图。

图8是本发明实施例提供的2周、4周和6周磁铁诱导大鼠软骨、纤维环及髓核退变示意图处理椎间盘后衰老蛋白标志物p16表达水平组化图，图(a)、图(b)分别为处理2周后100倍和200倍放大倍数下的组化图，图(c)、图(d)分别为处理4周后100倍和200倍放大倍数下的组化图，图(e)、图(f)分别为处理6周后100倍和200倍放大倍数下的组化图。

如图9所示，是本发明实施例提供的针刺模型和磁铁加压模型的椎间盘对衰老标志蛋白p16进行wb检测，在2周、4周和6周针刺模型和磁铁加压模型中p16表达水平有明显差异(p<0.01),(a)wb条带结果，分别为针刺2周、磁铁加压2周，针刺4周、磁铁加压4周，针刺6周、磁铁加压6周，(b)统计分析结果(同一时期的针刺和磁铁加压组比较时，p<0.01，有明显统计学差异)。

如图10所示，是本发明实施例提供的正常椎间盘凋亡蛋白c-caspase3表达水平示意图，图(a)为100*和图(b)为200*，可见凋亡蛋白c-caspase3表达较低。

如图11所示，是本发明实施例提供的磁铁加压椎间盘凋亡蛋白c-caspase3表达水平示意图，图(a)为100*和图(b)为200*，对比发现，磁铁加压椎间盘中凋亡蛋白表达水平高于正常椎间盘中凋亡蛋白表达水平。

如图12所示，是本发明实施例提供的100*和200*下的正常椎间盘纤维环示意图，正常椎间盘，纤维环为多层环状的椭圆形，每层排列整齐、形状规则，层与层之间间距均匀，为正常未发生退行性变的椎间盘。

如图13所示，是本发明实施例提供的100*和200*下的磁铁加压椎间盘纤维环示意图，磁铁加压椎间盘：纤维环排列略有不规则，纤维环乃至髓核在受载荷方向有明显的突出变形，变形处纤维环受压迫，层与层之间间距缩短，更加密集，说明磁铁加压可以导致纤维化的断裂，进一步导致髓核细胞衰老凋亡和椎间盘退变。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的大鼠软骨退变诱导纤维环及髓核退变模型的构建方法包括以下步骤：

s101：大鼠靠近尾跟部椎骨外直径为5-6mm，内直径3mm(根据不同大鼠的尾椎骨直径情况，需对骨髓腔进行一定的处理，以便放入磁铁)，长度为9-10mm，两椎骨之间的椎间盘厚度3mm。

s102：超强磁铁e直径2.5mm，长度4mm(如图2a)，两磁铁距离5mm时，产生吸力约为11g，距离6mm时产生吸引力为8g。

s103：磁环外f径16mm，内径11mm(如图2b)，厚度3mm，3-4个磁环形成磁筒套在大鼠尾巴外面，磁筒与两侧的磁铁有一定的重叠，磁筒对磁铁产生的压力为51g。

s104：对大鼠尾皮肤切开，暴露椎骨后对椎骨开窗，将骨髓腔内骨髓清除并对干骺端骨髓腔进行破坏(如图2c)。

s105：将小磁铁放入骨髓腔产生压力和阻断软骨终板的营养供应(如图2d)，缝合皮肤，待水肿消退后(如图2e)，对大鼠尾部皮肤外套一定长度的磁环(如图2f)，磁环内径稍大于与大鼠尾部直径，与椎骨内磁铁相互吸引增大对两小磁铁间的椎间盘压力，产生压力扩大效应及正磁场作用，磁环两侧胶带固定(如图2g)；磁环外面的套筒由15ml离心管制成，内径略大于磁环外径，套筒尾端被切开，切口直径大小刚好将尾巴放入。

s106：在套筒尾端的下面大鼠尾巴上缠多层胶带，达到一定厚度防止套筒滑落。

如图3所示，是本发明实施例提供的磁铁加压缺血模型示意图。

如图4所示，是本发明实施例提供的正常软骨终板炎症因子il-6表达水平示意图。

如图5所示，是本发明实施例提供的针刺处理椎间盘后软骨终板内炎症因子il-6表达水平示意图。

如图6所示，是本发明实施例提供的磁铁处理椎间盘后软骨终板内炎症因子il-6表达水平示意图。

如图7所示，是本发明实施例提供的2周、4周和6周针刺处理椎间盘后软骨终板、纤维环及髓核衰老蛋白标志物p16表达水平组化图。图(a)、图(b)为处理2周后的组化图，图(c)、图(d)为处理4周后的组化图，图(e)、图(f)为处理6周后的组化图。

如图8所示，是本发明实施例提供的2周、4周和6周磁铁诱导大鼠软骨、纤维环及髓核退变示意图处理椎间盘后衰老蛋白标志物p16表达水平组化图，图(a)、图(b)为处理2周后的组化图，图(c)、图(d)为处理4周后的组化图，图(e)、图(f)为处理6周后的组化图。

如图9所示，是本发明实施例提供的针刺模型和磁铁加压模型的椎间盘对p16进行wb检测。。

如图10所示，是本发明实施例提供的正常椎间盘凋亡蛋白c-caspase3表达水平示意图。

如图11所示，是本发明实施例提供的磁铁加压椎间盘凋亡蛋白c-caspase3表达水平示意图。

如图12所示，是本发明实施例提供的100倍和200倍下的正常椎间盘纤维环示意图。

如图13所示，是本发明实施例提供的磁铁加压椎间盘纤维环示意图，磁铁加压椎间盘。

下面结合应用原理对本发明作进一步的描述。

本发明实施例提供的应用原理包括：

(1)骨髓腔内放入磁铁，使软骨终板持续产生炎症状态，软骨终板的炎症可以明显促进椎间盘退变，加重髓核细胞衰老和凋亡。

(2)放入磁铁及捣毁干骺端明显阻断骨髓腔通过软骨终板对椎间盘内营养供应。

(3)小磁铁产生基础压力与大磁铁产生的放大压力模拟人体椎间盘退变过程中持续压力作用。

(4)文章报知，正磁场可以加速细胞衰老和凋亡，我们也通过小磁铁和大磁环构建正磁场状态，加速软骨细胞、纤维化细胞和髓核细胞衰老和凋。

(5)人体椎间盘退变不是单一因素导致的，我们模拟多种因素作用在椎间盘，符合人体病理变化过程。

下面结合实验对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明通过骨髓腔内放入磁铁、捣毁干骺端、磁铁加压及正磁场诱导衰老等作用，第一次构建软骨终板炎诱导大鼠椎间盘退变的模型，综合多种因素，更符合人体椎间盘退变的病理过程；通过与正常软骨终板、针刺模型软骨终板对比发现，磁铁加压模型中软骨终版炎症更加明显，il-6表达水平更高；与针刺模型相比，软骨终板、纤维化和髓核中衰老标志蛋白p16表达水平更高，而且wb结果提示磁铁加压更有助于增加椎间盘p16表达；与未做任何处理的正常椎间盘相比，磁铁加压椎间盘髓核细胞凋亡蛋白c-caspase3表达更高，纤维环更易紊乱、断裂，说明磁铁加压模型能够模拟软骨终板炎诱发椎间盘退变的生理过程，而且诱导椎间盘退变效果优于传统的针刺模型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。