超临界CO2流体萃取丹参提取物的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及超临界co2流体萃取丹参提取物的应用。

背景技术：

肿瘤转移是肿瘤病人死亡的主要原因，临床上90％以上的肿瘤病人死于肿瘤转移而不是原发性肿瘤(hanahanandweinberg2011,sethiandkang2011)。目前中国肿瘤手术后的生存者估计至少在2000万以上，他们面临着肿瘤复发和转移的危险，而传统的“抗癌药”由于其严重的毒副作用并不能有效地阻止肿瘤转移。morgan等对1990-2004年的22次临床试验结果进行分析发现，“抗癌药”仅能使肿瘤病人5年存活率增加2.1％(morgan,wardetal.2004)。早期使用化疗药不能预防肿瘤的转移，反而会加速肿瘤生长。sharouni等临床研究发现药物化疗可加速非小细胞肺癌再增生，化疗组病人肿瘤体积翻倍时间反而比未接受化疗的病人显著缩短(elsharouni,kaletal.2003)。rustin等2010年在lancet上报道过(rustin,vanderburgetal.2010)，卵巢癌病人的早期化疗组和延期化疗组的存活期中值没有显著差异，并且早期化疗组病人的存活期中值反而缩短了2个月，提示人们“抗癌药”不仅不能抑制肿瘤转移，而且对人的毒副作用绝对不可小视。然而，目前没有可预防肿瘤转移的药物用于临床。

肿瘤转移是一个多步骤多因素参与的复杂过程，涉及到肿瘤细胞骨架重排、变形，从细胞外基质脱落的肿瘤细胞，正常情况下会失巢凋亡(anoikis)，然而极少的一部分肿瘤细胞会发生变异，细胞表面整合素改变，适应所在的环境，发生上皮间质转化(emt)，抵抗失巢凋亡。发生变异的肿瘤细胞可能会突破基底膜，侵入毛细血管或毛细淋巴管，形成循环肿瘤细胞(circulationtumorcells,ctcs)，之后可能会与血管内皮细胞粘附，相互作用后穿出脉管系统，滞留在特定组织或器官，肿瘤细胞在新组织或器官进行增殖及血管生成，形成新的转移灶。发生变异的肿瘤细胞可能会进入血管或淋巴管，进入循环系统的肿瘤细胞是否粘附到血管内皮成为肿瘤转移的关键一步，取决于肿瘤细胞和内皮细胞表面特定的粘附分子的表达，包括细胞间粘附分子(icam-1)、肿瘤细胞表面整合素(integrin)的表达，及一系列的生存信号，致癌基因，生长因子受体，和整合素及生长因子受体相关酶的变异或表达。

现有生物抗癌技术一般从肿瘤细胞的角度论述预防肿瘤转移，但实际运用中，针对肿瘤细胞的治疗，特别针对肿瘤切除手术后，对于预防肿瘤再转移的实际效果有限，且针对肿瘤细胞往往单靶点的，肿瘤细胞容易产生耐药性，无法达到真正的预防肿瘤再转移。

另一方面，现有技术中还未有从肿瘤细胞所在微环境的角度预防肿瘤转移，以同时抑制细胞间粘附分子(icam-1)、肿瘤细胞表面整合素(integrin)及其他相关基因的表达，从肿瘤细胞的微环境出发有效全面抑制肿瘤术后再转移。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供了超临界co2流体萃取丹参提取物的应用，该应用从肿瘤细胞所在微环境的角度预防肿瘤转移，以同时抑制细胞间粘附分子(icam-1)、肿瘤细胞表面整合素(integrin)及其他相关基因的表达，同时解决肿瘤细胞耐药性问题，多靶点安全有效全面抑制肿瘤术后再转移。具体发明内容如下：

超临界co2流体萃取丹参提取物的应用，将该丹参提取物应用于预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞的转移；

所述肿瘤细胞为循环肿瘤细胞。

进一步的，所述肿瘤细胞包括肺癌、乳腺癌或结肠癌中的任一种循环肿瘤细胞。

进一步的，所述丹参提取物通过药学上可接受的载体或辅料应用于预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞转移的产品或者制备预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞转移产品中。

进一步的，所述丹参提取物各成分之间从多个通路调节循环肿瘤细胞表面整合素蛋白，阻碍循环肿瘤细胞与血小板的粘附，降低循环肿瘤细胞与血管内皮粘附的能力，促进循环肿瘤细胞发生失巢凋亡，从而抑制循环肿瘤细胞的迁移预防肿瘤再转移。

进一步的，所述丹参提取物通过抑制内皮细胞上粘附蛋白icam、e-selectin的表达，从而阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞。

进一步的，所述丹参提取物通过抑制肿瘤细胞上粘附蛋白cd29integrinβ1的表达，从而阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞。

进一步的，所述丹参提取物的制备方法为：取丹参粉末200g,加入60ml无水乙醇，置于超临界萃取釜中，固定分离釜压力10mpa，温度50℃；萃取压力20mpa,萃取温度50℃，co2流量为15kg/h,萃取时间120min。

进一步的，所述丹参提取物的成分包括丹参酮iia、丹参酮iib、丹参酮i、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参酮甲酯、丹参新酮、紫丹参甲素、丹参醇i、丹参醇ii、异丹参酮、丹参酚、丹参酚酸、丹参二醇a、丹参二醇b、丹参内脂以及原儿茶醛。

本发明主要针对的是肿瘤细胞所在微环境，特别针对进入血管的循环肿瘤细胞，通过丹参提取物调节循环肿瘤细胞表面的整合素蛋白以及肿瘤细胞所在的微环境——降低微环境中血小板的活性，使得血小板作为肿瘤细胞和内皮细胞之间的桥梁作用降低。另外，丹参提取物调节内皮细胞表面的粘附蛋白。以上几种途径综合起来降低肿瘤细胞粘附内皮细胞的作用，预防了肿瘤切除手术的后续肿瘤细胞穿过内皮细胞发生组织转移提供。

丹参提取物预防肿瘤手术后发生再转移的作用途径主要有以下几个方面：

抑制肿瘤细胞的迁移性和侵袭性。

促进肿瘤细胞脱离细胞外基质后失巢凋亡。

调节进入脉管系统的循环肿瘤细胞表面整合素，以及血管内皮细胞表面粘附蛋白表达，降低细胞粘附性。

减少ctc与血小板的粘附，阻碍ctc粘附血管内皮细胞，从而促进循环肿瘤细胞失巢凋亡。

本发明一方面利用超临界co2流体萃取的丹参提取物在安全浓度范围内有效调节多个通路及多种蛋白，抑制肿瘤细胞emt过程，调节多种与肿瘤转移相关的酶及整合素的表达，调节bcl-2家族多种蛋白(bcl-2、bax、bim、bad等)，抑制粘着班激酶(fak)，抑制整合素相关激酶(ilk)，抑制pi3k/akt通路，抑制mapk通路，减少多种生长因子受体被激活{上皮生长因子受体(egfr)、血小板衍生的生长因子受体(pdgfr)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)}，调节多种与肿瘤转移相关的整合素表达水平，调节多种mirna对肿瘤细胞转移过程的调控，增加细胞内活性氧等。通过这些途径使进入循环系统的ctc减少与血小板的粘附，无法粘附血管内皮从而导致ctc失巢凋亡，有效预防循环肿瘤细胞发生转移。

另一方面，通过寻找多通路调节，多靶点治疗的药物有效解决肿瘤细胞耐药性的问题。丹参提取物成分之间可以相互协作配合，从多个通路调节循环肿瘤细胞表面整合素蛋白，减少ctc与血小板的粘附，降低ctc与血管内皮粘附的能力，促进循环肿瘤细胞发生失巢凋亡，达到预防ctc再转移的目的。

附图说明

图1a、图1b及图1c为本发明丹参提取物成分高效液相色谱图；

图2为本发明丹参提取物mtt细胞毒性实验结果及分析图；

图3为本发明丹参提取物和紫杉醇air值结果分析比较图；

图4为本发明丹参提取物细胞划痕试验的显微镜摄影图及结果分析图；

图5为本发明丹参提取物transwell细胞侵袭试验图及结果分析图；

图6为本发明丹参提取物作用人脐带静脉内皮细胞表面蛋白icam与e-selectin结果及分析图；

图7为本发明丹参提取物作用人源乳腺癌细胞231表面蛋白cd29结果及分析图；

图8为本发明丹参提取物基质粘附实验结果及分析图；

图9为本发明丹参提取物作用肿瘤细胞粘附内皮细胞结果及分析图；

图10为本发明丹参提取物作用血小板粘附肿瘤细胞结果及分析图；

图11为本发明丹参提取物血小板粘附人源肺癌细胞a549结果分析图；

图12为本发明丹参提取物在血小板存在情况下肿瘤细胞粘附内皮细胞的结果及其分析图；

图13为本发明丹参提取物小鼠生存及肿瘤转移结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明进一步阐述。

超临界co2流体萃取丹参提取物的应用，将该丹参提取物应用于预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞转移的产品或者制备预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞转移产品中。

如果采用其他方法提取，由于提取工艺以及提取溶剂的不同，将导致提取成分不全，有效成分含量不足，无法达到本发明相同效果。

进一步的，所述肿瘤细胞包括肺癌、乳腺癌或结肠癌的微量循环肿瘤细胞。

进一步的，所述预防肿瘤切除手术后肿瘤细胞转移产品由所述丹参提取物与药学上可接受的载体或辅料组成，制成临床上使用的常规制剂，可以口服或肠胃外给药等方式施用于需要这种治疗的患者。如片剂、颗粒、胶囊、粉末、注射剂、滴丸剂、吸入剂、舌下给药制剂、糖浆、凝胶、油膏、栓剂、优选片剂、胶囊剂、滴丸剂和丸剂等。这些制剂可以通过常规方法，添加药物载体如赋形剂、黏合剂、增湿剂、崩解剂、增稠剂等制备而成。所述的药用载体选自微晶纤维素、粉末状纤维素、甘露糖醇、淀粉、乳糖、明胶、甲基纤维素、糊精、预胶化淀粉、微粉硅胶、羟丙基甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、聚乙二醇、木糖醇、乳糖醇、葡萄糖、蔗糖、甜菊素、山梨酸钾、甘氨酸、甘露醇、酒石酸、二氧化硅、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉等。

进一步的，所述丹参提取物通过特异性抑制微量循环肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附，而促进血中微量循环肿瘤细胞的失巢凋亡，从而抑制肿瘤细胞的迁移预防肿瘤再转移。

进一步的，所述丹参提取物通过抑制内皮细胞上粘附蛋白icam、e-selectin的表达，阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞，以预防肿瘤再转移。

进一步的，所述丹参提取物通过抑制肿瘤细胞上粘附蛋白cd29integrinβ1的表达，阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞，以预防肿瘤再转移。

进一步的，所述丹参提取物通过抑制血小板粘附肿瘤细胞，阻碍血小板对肿瘤细胞失巢凋亡的抵抗作用，以预防肿瘤再转移。

进一步的，所述丹参提取物的制备方法为：取丹参粉末200g,加入60ml无水乙醇，置于超临界萃取釜中，固定分离釜压力10mpa，温度50℃；萃取压力20mpa,萃取温度50℃，co2流量为15kg/h,萃取时间120min。

进一步的，所述丹参提取物的成分包括丹参酮iia、丹参酮iib、丹参酮i、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参酮甲酯、丹参新酮、紫丹参甲素、丹参醇i、丹参醇ii、异丹参酮、丹参酚、丹参酚酸、丹参二醇a、丹参二醇b、丹参内脂以及原儿茶醛。

本发明发现超临界co2流体萃取的丹参提取物在安全浓度范围内可以有效调节多个通路及多种蛋白，抑制肿瘤细胞emt过程，调节多种与肿瘤转移相关的酶及整合素的表达，调节bcl-2家族多种蛋白(bcl-2、bax、bim、bad等)，抑制粘着班激酶(fak)，抑制整合素相关激酶(ilk)，抑制pi3k/akt通路，抑制mapk通路，减少多种生长因子受体被激活{上皮生长因子受体(egfr)、血小板衍生的生长因子受体(pdgfr)、肝细胞生长因子受体(hgfr)、血管内皮生长因子受体(vegfr)}，调节多种与肿瘤转移相关的整合素表达水平，调节多种mirna对肿瘤细胞转移过程的调控，增加细胞内活性氧等。通过这些途径使进入循环系统的ctc减少与血小板的粘附，无法粘附血管内皮从而导致ctc失巢凋亡，有效预防循环肿瘤细胞发生转移。本发明预防肿瘤术后再转移，不同于“抗癌药”通过直接杀伤肿瘤细胞引起严重毒副作用但仍无法抑制肿瘤转移，肿瘤转移预防药物毒副作用低，可长期安全有效服用，与具有严重毒副作用、不能长期服用的“抗癌药”形成显著区别(见表1)。预防肿瘤转移药物作用于循环肿瘤细胞所在的微环境，调节循环肿瘤细胞与细胞外基质、脉管系统中的血管内皮细胞、血小板之间的粘附性，从而达到阻断肿瘤细胞到达远端转移组织的目的。

表1.抗癌药和肿瘤转移预防药的区别表

实施例1

一种丹参提取物的制备，采用超临界co2流体萃取制备，取丹参药材，烘干，过40目，精密称取丹参粉末200g,加入60ml无水乙醇，混匀，置于超临界萃取釜中，固定分离釜压力为10mpa，温度50℃。所使用的最佳萃取压力为20mpa,萃取温度50℃，co2流量为15kg/h,萃取时间为120min。分别对萃取釜，分离釜，贮罐进行预热到选定温度，系统加压到20mpa进行循环萃取，保持恒温恒压，到达选定时间时，得到丹参提取物。使用高效液相色谱hplc鉴定得到附图1a、附图1b及附图1c三组图谱。图1a中的成分为丹参酮iia，根据极性大小可以分辨出其他成分隐丹参酮、丹参酮i。图1b中的成分为丹酚酸b。图1c中的成分为原儿茶醛。

为了验证本发明效果，申请人设置了以下试验。

试验1

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行mtt细胞毒性试验，具体如下：

使用含有10％胎牛，1％双抗1640培养基，在37℃，5％co2常温培养箱培养人肺癌细胞a549，一天换一次液，隔天使用胰酶消化细胞。使用细胞计数板进行细胞计数，铺处于生长对数期细胞于96孔板，0.8万/100μl/孔，过夜后加药。使用培养基配置丹参提取物作用细胞的浓度分别为0、5、10、20μg/ml。一天后吸去培养基，每孔加入100μl的mtt溶液作用4h，吸去mtt溶液，加入dmso溶液于摇床上作用10min，测570nm处吸光值，得图2吸光值，再以空白对照组的吸光值作为参考，给药组的吸光值和空白组作比较，得到图2所示的百分比直方图。

如图2所示，丹参提取物浓度在0、5、10、20μg/ml相对较低的浓度范围内，mtt结果显示肿瘤细胞a549的活性没有显著性差异。结果说明丹参提取物在一定浓度水平对肿瘤细胞几乎没有杀伤力。验证了本发明丹参提取物对细胞的安全性。

试验2

取实施例1所得本发明丹参提取物，试验、计算紫杉醇和丹参提取物的air值，具体如下：

为了证明本发明中肿瘤转移预防药物不同于传统抗癌药物(抗癌药物通过细胞毒性作用杀伤肿瘤细胞，而肿瘤转移预防药物作用的一种方式是通过干预肿瘤细胞粘附血管内皮代替杀死肿瘤细胞)，我们定义了一种新的肿瘤转移预防药物疗效评价标准，通过计算肿瘤转移预防药物的粘附抑制率来评价药物的预防肿瘤转移的效率。粘附抑制率(adhesioninhibitionratio，air)为药物的ic10(指药物引起测试细胞10％的增殖抑制的浓度)与ec50(指药物引起肿瘤细胞与内皮细胞之间的粘附效率下降50％的浓度)的比值，即air＝ic10/ec50。air值越大，药物的细胞毒副作用越小，表明受试药物主要是通过特异性抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的粘附而起作用的，并非通过杀伤肿瘤细胞来抑制它与血管内皮细胞之间的粘附。

测试、计算air值的图3结果，结果显示丹参提取物值在1.6左右，紫杉醇值在0.5左右。根据本申请图2和图9得到的数据结果，ic10为36μg/ml,ec50为10μg/ml,得到丹参提取物的air值为4。根据本申请图3a和图3b的结果，ic10为10μm，ec50为20μm，故得到紫杉醇的air值为0.5。试验证明与传统抗癌药紫杉醇比较，丹参提取物的air值明显增高、毒性显著降低，预防肿瘤转移的效果明显增强，说明了丹参提取物的细胞毒副作用小，可以通过特异性抑制肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的粘附，以用于预防肿瘤细胞转移。

试验3

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行细胞划痕试验，具体如下：

细胞培养方法同试验1。使用细胞计数板进行细胞计数，铺处于对数生长期的a549细胞于24孔板，20万/500μl/孔，过夜做划痕实验。使用100μl枪头轻轻在24孔板的中央划一道笔直的线，生理盐水轻柔洗三遍，使用1ml含2％胎牛的培养基配置成浓度分别为0、1、5、10μg/ml的丹参提取物作用细胞。使用荧光显微镜于明场下拍照，24h后，再拍照一次，对两次拍照结果作比较分析，得如图4所示显微镜照片及结果分析图。图4以对照组的实验迁移距离作为参考距离，给药组的迁移距离和对照组的迁移距离的比值的结果作为百分比直方图。

如图4所示，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml分别的相对迁移率为100％、77％、55％、28％，划痕结果显示浓度越高肿瘤细胞a549的迁移逐渐减少。结果说明丹参提取物有效抑制了肿瘤细胞的迁移。

试验4

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行transwell细胞侵袭试验，具体如下：

细胞培养方法同试验1。使用细胞计数板进行细胞计数，于transwell小皿上室加入250μl0.1％bsa，其中含有20万个a549细胞，并配置丹参提取物浓度分别为0、1、5、10μg/ml，下室加入750μl含20％胎牛的培养基。在含5％co2的常温培养箱培养24h，弃去上下室液，生理盐水洗三遍，下室加入800μl多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，加入用生理盐水1:1稀释的结晶紫溶液800μl作用30min，正置显微镜下拍照，再以对照组细胞的侵袭数作为参考数，给药组的侵袭数和对照组的侵袭数的比值的结果作为百分比直方图的结果，得图5。

图5所示，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml的分别相对侵袭率为100％、88％、35％、20％，transwell结果显示浓度越高肿瘤细胞侵袭明显减少。结果说明丹参提取物有效抑制了肿瘤细胞的侵袭。

试验5

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行流式检测丹参提取物对内皮细胞粘附蛋白icam(细胞间粘附因子)，e-selectin表达的影响，具体如下：

使用含有10％胎牛，1％双抗ecm培养基，在37℃，5％co2常温培养箱培养人脐静脉内皮细胞。将处于对数生长期的细胞铺到6孔板中，40万/ml，每孔2ml。过夜后，使用tnf-α(肿瘤坏死因子，一种炎症因子)10ng/ml，同时加入浓度为0、5、10μg/ml的丹参提取物，其中一个孔不加tnf-α，作为对照组。于培养箱一起作用4h，吸掉培养基，使用不含edta的胰酶消化细胞，消化下来后，轻轻吹打细胞，离心收集细胞。使用1mlpbs溶液轻轻将细胞吹打均匀，加入带有荧光的抗体icam，e-selectin孵育30分钟，使用pbs轻柔的洗涤一遍。离心，用适量的pbs混悬和抗体结合的细胞。最后使用流式细胞仪测定内皮细胞的icam(细胞间粘附因子)，e-selectin的表达量，分别测得图6中icam的蛋白量及e-selectin的蛋白量，再以空白组的蛋白表达量作为参考组，实验组的蛋白表达量和空白组的蛋白表达量的比值的结果作为百分比直方图的结果，得图6中直方图。

如图6所示测定结果，丹参提取物浓度在0、5、10μg/ml范围内，icam的蛋白相对的表达量为100％、60％、50％，对照组为4％，e-selectin的蛋白相对表达量为100％、85％、65％，对照组为7％，结果显示浓度越高内皮细胞和粘附相关的蛋白icam、e-selectin的表达水平逐渐降低。结果说明丹参提取物可以抑制内皮细胞上粘附相关蛋白icam、e-selectin的表达，为阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞提供依据。

试验6

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行流式检测丹参提取物对肿瘤细胞粘附蛋白cd29(integrinβ1)表达的影响试验，具体如下：

使用含有10％胎牛，1％双抗的l-15培养基，在37℃，5％co2常温培养箱培养人源乳腺癌细胞mda-mb-231。将处于对数生长期的细胞铺在6孔板中，40万/ml，每孔2ml。过夜待细胞贴壁后，加入浓度为0、1、5、10μg/ml的丹参提取物，作用24h，吸掉培养基，使用不含edta的胰酶消化细胞，消化下来后，轻轻吹打细胞，离心收集细胞。使用pbs溶液轻轻清洗细胞后，再用pbs溶液将细胞吹打均匀，加入带有荧光的抗体cd29孵育细胞30min。使用pbs溶液轻柔的洗涤一遍，离心，用适量的pbs溶液混悬和抗体结合的细胞。最后使用流式细胞仪测定肿瘤细胞mda-mb-231表面cd29(细胞间粘附因子)的表达量，以空白组的蛋白表达量作为参考组，实验组的蛋白表达量和空白组的蛋白表达量的比值的结果作为百分比直方图的结果，结果如图7所示。

如图7所示测定结果，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml蛋白表达相对量分别为100％、97％、95％、91％，结果显示浓度越高肿瘤细胞mda-mb-231表面粘附相关的蛋白cd29(integrinβ1)的表达水平逐渐降低。结果说明丹参提取物可以抑制肿瘤细胞上粘附相关蛋白cd29(integrinβ1)的表达，为阻断肿瘤细胞粘附内皮细胞提供依据。

试验7

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行丹参提取物对肿瘤细胞对细胞外基质粘附作用的干预试验，具体如下：

细胞培养方法同试验1。用1％matrigel包被96孔板各孔，于37℃，5％co2常温培养箱过夜后吸去matrigel溶液。使用细胞计数板进行细胞计数，铺处于生长对数期的a549细胞于96孔板，8×10³个/100μl/孔，过夜后加药。使用培养基配置丹参提取物作用细胞的浓度分别为0、1、5、10μg/ml。一天后吸去培养基，pbs缓冲液轻轻清洗96孔板三次，洗去死掉和未粘附的细胞。每孔加入100μl的mtt溶液作用4h，吸去mtt溶液，加入dmso溶液于摇床上作用10min，测570nm处吸光值。matrigel包被96孔板，模拟细胞外基质环境，正常情况下细胞会正常粘附细胞外基质，但是在药物刺激的情况下，细胞会从细胞外基质上脱落下来。没有加药的空白组作为实验对照组，mtt结果显示的是正常粘附在基质上的细胞。而给药组相对空白组，细胞会从基质上脱落下来一部分，所以给药组粘附在基质上的细胞会有所减少。给药组和对照组的比值就作为百分比直方图的结果，即图8.

如图8所示，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml基质相对相符率分别为：100％、95％、80％、65％，结果显示浓度越高肿瘤细胞粘附基质逐渐减少。结果说明丹参提取物可以抑制肿瘤细胞粘附细胞外基质，从而促进脱落的肿瘤细胞失巢凋亡。

试验8

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行肿瘤细胞粘附内皮细胞试验，具体如下：

细胞培养方法同试验5。人脐带静脉内皮细胞铺6孔板，每孔30万细胞，1ml培养基。过夜后，加入10ngtnf-α刺激因子作用4h，激活内皮细胞。再将消化的a549细胞混匀置于1mlpbs缓冲溶液，使用罗丹明10μl/ml避光染色肿瘤细胞，20分钟后，pbs洗涤肿瘤细胞两次。使用不含酚红的1640将肿瘤细胞计数为20万/ml，同时混入浓度为0、1、5、10μg/ml的丹参提取物，吸掉内皮细胞培养基，将1ml不含酚红的1640悬浮的肿瘤细胞与内皮细胞共孵1h。各孔吸掉培养基后，使用pbs轻柔的洗涤两遍，除去没有粘附的肿瘤细胞，再继续加入1ml不含酚红的1640培养基，最后在荧光显微镜下拍照，每孔5-6张，以空白组内皮细胞上粘附的肿瘤细胞数作为对照组，给药组内皮细胞上粘附的肿瘤细胞和对照组的比值结果作为百分比直方图，即图9。

如图9所示，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml相对粘附率为100％、88％、85％、50％，结果显示浓度越高肿瘤细胞a549粘附内皮细胞逐渐减少。结果说明丹参提取物可以抑制肿瘤细胞粘附内皮细胞，促进肿瘤细胞失巢凋亡。

试验9

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行共聚焦显微镜拍摄血小板与肿瘤细胞的粘附试验，具体如下：

细胞培养方法同试验1。肿瘤细胞a549铺共聚焦小皿，30万/ml/小皿，过夜。使用pkh26染料和dapi染料分别染肿瘤细胞的细胞膜和细胞核20min。使用1mlpbs溶液悬浮10μl血液，加入20μmadp，同时血液中加入浓度为0、10、20μg/ml的丹参提取物，其中一组不加adp作为阴性对照组。使用cfse染料染色血液中的血小板15min。使用不含酚红的1640将染完色的肿瘤细胞和血小板共孵45min，在激光共聚焦显微镜下拍摄肿瘤细胞和血小板的粘附情况，以加adp组肿瘤细胞上粘附的血小板数作为对照组，不加adp和加药组肿瘤细胞上血小板数和对照组的比值作为百分比直方图的结果，即得图10。

如图10所示结果，丹参提取物浓度在0、10、20μg/ml的相对粘附率分别为：100％、70％、65％，结果证明浓度越高肿瘤细胞粘附血小板的数量减少。结果说明丹参提取物可以抑制血小板粘附肿瘤细胞，阻碍血小板对肿瘤细胞失巢凋亡的抵抗作用。

试验10

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行丹参提取物对肿瘤细胞携带血小板的影响试验，具体如下：

取消化后的a549细胞计数为80万/ml，500μlpbs悬浮，加入丹参提取物浓度为0、10、20μg/ml，接着加入新鲜血液1.5毫升，再加入20μm的adp刺激血小板，孵育抗体cd61，cd29，作用20min。最后使用红细胞裂解液作用血液20min，使红细胞破解。离心收集肿瘤细胞。使用流式细胞仪测定肿瘤细胞携带血小板的情况。试验采用流式分析结果，使用cd29标记乳腺癌细胞a549，cd61标记血小板。空白不加药组肿瘤细胞上的血小板数作为对照组，给药组肿瘤细胞上的血小板和对照组上的血小板数的比值作为百分比直方图的结果。这里使用流式细胞仪检测到的cd61的荧光强度代表血小板数，得结果图11。

如图11所示，丹参提取物浓度在0、10、20μg/ml的相对粘附率分别为100％、85％、80％，结果证明浓度越高肿瘤细胞上粘附血小板的数量减少。结果说明丹参提取物可以抑制血小板在肿瘤细胞上的粘附。

试验11

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行与血小板共孵的肿瘤细胞粘附内皮细胞试验，具体如下：

细胞培养方法同试验5。使用人脐带静脉细胞铺6孔板，每孔30万细胞，1ml培养基。过夜后，加入10ngtnf-α刺激因子作用4h，激活内皮细胞。再将消化的a549细胞混匀置于1mlpbs缓冲溶液，使用罗丹明10μl/ml避光染色肿瘤细胞，20分钟后，pbs洗涤肿瘤细胞两次，使用不含酚红的1640将肿瘤细胞计为20万/ml。每孔准备10μl新鲜血液，加入adp激活血小板，并加入浓度为0、1、5、10μg/ml的丹参提取物，使用不含酚红的1ml1640将计数好的肿瘤细胞和新鲜血液混匀，吸掉内皮细胞培养基，与血液混匀的肿瘤细胞与内皮细胞共孵1h。各孔吸掉培养基后，使用pbs轻柔的洗涤两遍，除去没有粘附的肿瘤细胞，再继续加入1ml不含酚红的1640培养基，最后在荧光显微镜下拍照，每孔5-6张。原理同试验8，空白不加药组的内皮细胞上的肿瘤细胞数作为对照组，加药组内皮细胞上粘附的肿瘤细胞数和对照组的比值作为百分比直方图的结果图12,。

如图12所示，丹参提取物浓度在0、1、5、10μg/ml分别的相对粘附率为100％、78％、72％、67％，结果显示浓度越高肿瘤细胞a549与血液共孵的情况下粘附内皮细胞逐渐减少。结果说明丹参提取物可以抑制与血液共孵情况下的肿瘤细胞粘附内皮细胞，促进肿瘤细胞失巢凋亡。

试验12

取实施例1所得本发明丹参提取物，进行动物试验，具体如下：

将购买的裸鼠置于鼠房养育1周后，将31只balb/c裸鼠分为四组，对照组10只，丹参提取物高剂量组7只，丹参提取物低剂量组7只，紫杉醇组7只。丹参提取物使用0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)配成高剂量组50mg/kg/d，低剂量组5mg/kg/d，紫杉醇组10mg/kg/d，对照组给溶剂100μl，提前三天给药。然后尾静脉注射使用100μlpbs溶液悬浮的100万人源黑色素瘤a375细胞，获得四组小鼠的生存曲线。小鼠死亡后解剖，统计肺部肿瘤结节。得图13.

如图13所示，丹参提取物高剂量组肿瘤结节平均数为4，低剂量组肿瘤结节平均数为5和紫杉醇组肿瘤结节平均数为12，对照组肿瘤结节平均数为13，试验可见裸鼠的生存期明显延长，裸鼠肺部转移的结节数减少。结果说明丹参提取物在肿瘤细胞转移的动物模型中具有预防肿瘤转移的作用，且相比传统抗癌药紫杉醇更有优势。

目前，临床上治疗肿瘤转移的药物存在极大空白，很多药物在临床前实验就已经夭折，最主要的原因是肿瘤细胞的耐药性。故本麻烦寻找多通路调节，多靶点治疗的药物能有效解决肿瘤细胞耐药性的问题。丹参提取物成分之间可以相互协作配合，从多个通路调节循环肿瘤细胞表面整合素蛋白，减少ctc与血小板的粘附，降低ctc与血管内皮粘附的能力，促进循环肿瘤细胞发生失巢凋亡，达到预防ctc再转移的目的。即预防肿瘤转移药物作用于循环肿瘤细胞所在的微环境，调节循环肿瘤细胞与细胞外基质、脉管系统中的血管内皮细胞、血小板之间的粘附性，从而达到安全有效阻断肿瘤细胞到达远端转移组织的目的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护为准。