一种用于减低骨肉瘤顺铂耐药性的药物组合物的制作方法

本发明属于生物医学领域，提供了一种用于减低骨肉瘤顺铂耐药性的药物组合物。

背景技术：

骨肉瘤为间叶组织来源的好发于青少年患者长骨干骺端的原发性恶性骨肿瘤，在原发性骨肿瘤中，骨肉瘤的发病率仅次于浆细胞骨髓瘤，居第2位。骨肉瘤患者死亡率较高，化疗是骨肉瘤治疗的一线治疗方法之一。尽管在癌症初期内有比较好的治疗效果，但是随着用药时间的不断延长，大多数骨肉瘤患者开始对化疗药产生一定的耐药性。近些年来，大量研究表明骨肉瘤高死亡率很可能是由于一些肿瘤细胞在长期使用化疗药物后对化疗药物产生耐药性所导致的，因此深入研究骨肉瘤获得耐药性的机制，并籍此逆转耐药成为骨肉瘤中待解决的关键问题。

长链非编码rna(lncrna)是一类长度大于200个核苷酸的转录物，不具有编码蛋白质的能力。许多研究表明，lncrnas与多种肿瘤的化学药物耐药性密切相关。lncrnaatb在乳腺癌中过度表达且与乳腺癌患者曲妥珠单抗耐药性呈正相关；lncrnaleigc与胃癌患者的5氟尿嘧啶耐药有关；lncrnahotair与乳腺癌及非小细胞肺癌的耐药相关；lncrnanck1-as1可通过调节mir-137/trim24途径增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性；许多lncrnas，如hotair，uca1和malat1已被证明是肿瘤的发展和进展过程中的重要调节剂。目前，有关lncrna在骨肉瘤耐药方向中的研究基本空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于减低骨肉瘤顺铂耐药性的药物组合物，更具体的涉及lncrnadancr在降低骨肉瘤顺铂耐药性中的应用。

本发明进行测序通过分子生物学验证，结果显示，发现lncrnadancr和骨肉瘤对顺铂的耐药密切相关，抑制lncrnadancr表达能降低骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性，可用于临床治疗，减低患者的耐药性具有很好的实际应用价值。

本发明采用了如下技术方案：

一种用于减低骨肉瘤顺铂耐药性的产品，其特征在于，所述产品包含抑制长链非编码rna表达的试剂，所述长链非编码rna为dancrgeneid57291，具有8304bp的长度，相应的dna序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种用于降低骨肉瘤患者顺铂耐药性的药物组合物，所述药物组合物包括dancr的抑制剂。

进一步，所述抑制剂不受限制，只要是可以降低dancr表达水平或降低dancr功能活性的均可。

所述抑制剂包括dancr本身、抑制型mirna、抑制型转录调控因子或抑制型靶向小分子化合物。所述药物组合物含有药学中可接受的辅料或者辅助性成分。

本发明所述药物组合物可以作为医药单独施用或与其他药物一起施用，可以与本发明的药物组合物一起施用的其他药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明所述药物组合物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明所述药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药，在某些情况下是局部地给药。

本发明所述药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了一种诊断骨肉瘤的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获得受试者的样品；

(2)检测受试者样品中的dancr的表达水平；

(3)将测得的dancr的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，dancr的表达水平增高，则该受试者被判断患有骨肉瘤、或者该受试者患有骨肉瘤的风险高、或者骨肉瘤患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种降低骨肉瘤患者的顺铂耐药性的方法，所述方法包括降低dancr表达量或者降低dancr的调节活性。

本发明的优点和有益效果：本发明发现了一种降低骨肉瘤顺铂耐药的分子标志物，使用该标志物可以降低骨肉瘤患者的顺铂耐药性，提高患者对顺铂的敏感性，提高患者的预后及生存率。

附图说明

图1显示利用qpcr检测dancr表达情况的统计图(**代表p<0.05)；

图2显示mtt方法检测顺铂对不同处理细胞的ic50的影响的统计图(**代表p<0.05)；

图3显示edu染色法检测dancr敲低对骨肉瘤细胞顺铂耐药性影响的统计图(**代表p<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人的实验室手册中所述的条件，或者按照制造厂所建议的条件。

实施例1

dancr敲低实验

1、骨肉瘤细胞的培养与转染

1.1细胞培养

将骨肉瘤细胞株u2os用含有10％胎牛血清，青、链霉素各100u/ml的dmem于37℃、5％co2的饱和湿度箱中培养。

1.2细胞转染

(1)转染前24小时，在400ul无抗生素培养基中接种0.5-2*10⁵个肿瘤细胞，转染时细胞融合度为30-50％。

(2)用50ulopti-mem稀释shrna，其相应dna序列如seqidno.2所示(转染细胞的终浓度为50nm)，轻轻吹吸3-5次混匀。

(3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50ulopti-mem稀释1ullipo2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。

(4)混匀转染试剂和shrna稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。

(5)转染复合物加入到24孔板中，100ul/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

(6)细胞板置于37℃、5％co2培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后换新鲜培养基。

2、利用qpcr实验检测shdancr的表达情况

2.1提取细胞总rna利用常规方法进行操作。

2.2逆转录

以提取的总rna(1ug)为模板，加入以下反应体系，具体为：5xprimescrimebuffer4ul，primescrimertenzymemix1ul,oligodtprimer(50um)1ul，random6mers(100um)1ul，以无rna酶的ddh2o将反应体积补足为20ul。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cdna，可用于lncrnareal-timepcr检测。

2.3qpcr

按日本takara公司的sybrpremixextaq^tm(tlirnasehplus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10um)，将dancr引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：sybrpremixextaq^tm(2x)25ul，roxreferencedye(50x)1ul，pcr上游引物(10um)1ul，pcr下游引物(10um)1ul，cdna4ul，灭菌ddh2o18ul。以95℃20s预变性，按95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得ct值。结果采用相对定量法，运用公式2^-δδct计算。实验重复3次。

2.4结果

结果如图1所示，shdancr能够成功敲低，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例2

dancr的敲低表达对骨肉瘤细胞耐药性的测定

1、mtt检测细胞活性及对顺铂的耐药性

1.1转染后72h弃去原培养液。

1.2加入不同浓度梯度的顺铂溶液0m、0.001μm、0.005μm、0.01μm、0.05μm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm，每个孔设置3个复孔，每个孔加入200μl含顺铂的培养液，无细胞孔加入培养基作为空白对照孔。

1.348小时后每孔加入5mg/mlmtt20μl，培养4h，吸掉孔内混合液。

1.4每孔加入150μldmso，并置于摇床上低速震荡10min。

1.5上机。酶标仪选择450nm波长测定吸光度值，最终的od值为各孔od值与空白对照孔平均od值的差值。

1.6按照以下公式计算顺铂对细胞的抑制率。

抑制率＝1-(od实验组-od空白)/(od对照-od空白)。抑制率为50％时的药物浓度为半数抑药浓度(ic50)，耐药细胞株转染shdancr的u2os(实验组)的ic50与u2os(对照组)的ic50的比值为耐药指数ri。

2、统计分析

统计学分析由graphpadprism6软件完成，两组间比较采用student-t检验，数据表示为均数±标准误(mean±sem)，p＜0.05，认为差异具有统计学意义。

3、结果

结果如图2所示，相比于对照组，实验组的细胞对顺铂的耐药性减低，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实验结果表明，降低dancr表达可以减低骨肉瘤患者对顺铂的耐药性。

实施例3

edu实验验证低表达dancr对骨肉瘤的顺铂耐药性的影响

1、实验原理：edu(5-溴-2-脱氧尿嘧啶)是一种嘧啶类似物，可以在dna合成期整合入dna双链。kfluor488荧光染料试剂含有叠氮化合物，可非常有效地标记出整合的edu，从而精确的检测细胞的增殖。

2、实验步骤：

2.1取对数生长期状态良好的骨肉瘤u2os，胰酶消化，用完全培养基重悬成单细胞悬液，然后细胞计数，按每孔5000个细胞铺96孔板过夜。

2.2次日给予细胞药物处理，分别设置dmso组和tmz组。

2.310-30ul的顺铂药物处理48h后去掉含药培养基进行edu孵育，取适量试剂盒中的10mmedu原液并用提前预热的完全培养基稀释成10um，按每孔100ul加入96孔板中，细胞培养箱中孵育4h。

2.4细胞固定及促渗：去除含edu的培基，每孔加入50ul4％多聚甲醛，室温孵育15min；去除固定液，每孔加入50ul2mg/ml的甘氨酸溶液，室温孵育5min，中和残留的固定液；然后每孔加入100ul用pbs配制的3％bsa洗涤2次；去除洗涤液，每孔加入100ul0.5％triton.x100，室温孵育20min。

2.5检测edu：去除促渗液，用100ul3％bsa轻柔洗涤2次，然后每孔加入100ul提前配制好的click-it反应混合物，轻轻摇晃均匀，室温避光孵育30min。然后去除反应混合物，每孔加入l00ul3％bsa轻柔洗涤2次。

2.6dna复染：用100ul的pbs洗涤每孔1次，并去掉洗涤液；用pbs按1：2000将hoechst33342稀释至1xhoechst33342溶液，终浓度为5ixg/ml，然后每孔加入100ul的1xhoechst33342溶液，室温避光孵育15-30min。除去hoechsd3342溶液。用100ul的pbs洗涤每孔2次，去除洗涤液。

2.7成像及分析，荧光光谱数据为kfluor488.azide：495/520nm；hoechst33342；

2.8统计学分析

统计学分析由graphpadprism6软件完成，两组间比较采用student-t检验，数据表示为均数±标准误(mean±sem)，p＜0.05，认为差异具有统计学意义。

3、结果

结果如图3所示，相比于对照组，实验组的细胞对顺铂的耐药性减低，差异具有统计学意义(p<0.05)。上述实验结果表明，降低dancr表达可以减低骨肉瘤患者对顺铂的耐药性。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>沈阳医学院附属中心医院

<120>一种用于减低骨肉瘤顺铂耐药性的药物组合物

<141>2019-12-26

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8304

<212>dna

<213>人类(human)

<400>1

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