本发明属于生物与医药生物
技术领域：
，具体涉及一种猪哮喘病疫苗佐剂及制备方法。
背景技术：
：佐剂，又称免疫佐剂，也叫免疫增强剂。是一类先于抗原或与抗原同时注入到动物机体内，能非特异性地增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，但自身并无免疫原性且不能引起机体的免疫应答的物质。一种良好的佐剂一般具备以下条件：增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能；良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。疫苗佐剂种类较多，常用的有白油佐剂、氢氧化铝佐剂、蜂胶佐剂等，但目前家禽畜类灭活疫苗应用最广泛的疫苗佐剂为白油佐剂，虽然效果明显，但也有一些不可避免的缺点，一是配方中含有吐温、司班、硬脂酸铝等成份，应激较大；二是易导致局部副反应，如发炎、脓肿、肉芽肿等；三是比较粘稠，较难注射，费时费力。因此探寻新型高效的水性疫苗佐剂是禽畜疫苗重要的研究方向。技术实现要素：为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种猪哮喘病疫苗佐剂及制备方法，所述佐剂为红豆杉水水加醇混合提取物，使用剂量为300-500mg/ml。本发明的技术内容如下：一种猪哮喘病灭活疫苗佐剂，所述的佐剂为红豆杉水加醇混合提取物，与疫苗配比使用后，佐剂的浓度为300-500mg/ml。一种猪哮喘病灭活疫苗佐剂的制备方法，具体步骤如下：将新鲜或干燥的红豆杉置于提取罐中，加入6-10倍重量的水，浸泡18-24后，升温至85℃-90℃浸提2-4h，提取液过滤并流入回收罐；再次向提取罐中加入6-10倍体积含30％-50％乙醇的水溶液，并加入整个溶液重量3％-5％的碳酸氢钠，调节ph值为7.5-8.5，升温至85℃-90℃浸提2-4h，提取液过滤并流入回收罐。二次提取的液体混合后，减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体即得佐剂。本发明的有益效果：所提供的佐剂工艺简单、成本低、使用方便，作用效果好，无毒副反应，在畜牧业中的开发利用潜力巨大，具有广阔的应用前景。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。1.佐剂制备按照本发明提供的红豆杉水+乙醇混合提取法，制备不同的佐剂：佐剂1—红豆杉水+乙醇混合提取物：将干燥红豆杉置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡20h后，升温至90℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐；再次向提取罐中加入6倍重量含40％乙醇的水溶液，并加入碳酸氢钠调节ph值为8，升温至90℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐。二次提取的液体混合后，减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂2—红豆杉水提取物：将干燥红豆杉置于提取罐中，加入8倍重量的水，浸泡20h后，升温至90℃浸提3h，提取液过滤并流入回收罐，提取液减压浓缩至十分之一体积，然后喷雾干燥成粉状固体。固体物用无菌生理盐水配成100mg/ml溶液，备用。佐剂3—红豆杉乙醇提取物：将干燥红豆杉置于提取罐中，加入8倍重量含95％乙醇的溶液，升温至60℃浸提6h，提取液过滤并流入回收罐，减压浓缩至十分之一体积，将膏状提取物取出，烘干成固体。固体物用少量无水乙醇溶解后，用无菌生理盐水配成100mg/ml，备用。2.疫苗制备猪哮喘病毒抗原液制备：9日龄猪接种猪哮喘病毒种毒，72h后，收获猪尿囊液，用血凝试验测定病毒效价，将病毒液加水稀释至血凝效价为29，加入质量比为10％的甘油混合均匀，然后加入质量比为0.2％的甲醛，37℃灭活48h，即为抗原液。疫苗1—3：猪哮喘病毒灭活疫苗制备：分别向抗原液中添加实施例1中获得的三种水性佐剂，并对应佐剂编号，分别命名为疫苗1-疫苗3。于常温下用均质机在3000rpm条件下充分混合均匀10min，所述免疫佐剂与抗原液体积比为1:1，即每种疫苗里佐剂干物质的含量均为300mg/ml；3.毒性检验选取15日龄健康猪，将猪随机分为4组，每组2只。1-3组分别大剂量腿部肌肉注射实施例2中制备的3种疫苗，每只猪每只腿注射2ml疫苗；4组为正常对照。注射后观察猪的临床症状，包括精神萎靡、食欲减退、扎堆、下痢、死亡等，连续观察7天。观察结果如下表，结果显示红豆杉水加乙醇混合提取物和作为佐剂制备的疫苗无任何副作用。表1不同疫苗组大剂量接种副作用观察编号症状疫苗1无疫苗22只猪接种部位轻微红肿疫苗31只猪接种部位轻微红肿4.免疫效果比较1试验设计按实施例1和2中的方法获得3种不同佐剂疫苗。选取12只健康猪，平均分成4组，每组3只。前3组猪分别肌肉注射3种疫苗，1ml/只。第4组为正常对照组。分别在免疫后14、28、42d采血。2结果与分析2.1血清抗体效价比较各试验组于免疫后14、28、42d随机抽取3只猪，翅下静脉采血1ml，分离血清，用血凝(ha)和血凝抑制(hi)试验检测抗体滴度，结果以log2表示。结果见表2，疫苗1、2、3均能够显著提高疫苗接种诱导的抗体水平，其中疫苗1组免疫效果最优。表2不同疫苗组猪血清抗体水平比较(log2)综上研究比较，佐剂1的免疫增强效果均优于佐剂2和3，即红豆杉水加醇混合提取物效果最佳。毒性试验结果表明，含有红豆杉醇提物的佐剂1和佐剂3具有更好的抗炎作用。从提取成本考虑，佐剂3为95％乙醇提取物，其提取成本较高、工艺复杂和安全性较差，而佐剂1同时具备良好的免疫提高效果和较低的提取成本，且工艺简单，适合大规模生产，无安全隐患，因此本发明优选佐剂1作为本发明最终产品。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页12